CC BY
38
ТЕХНИЧЕСКОЕ ОСНАЩЕНИЕ ОТРАСЛИ _
MfJ' ТЕМА НОМЕРА НАНОТЕХНОЛОГИИ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
УДК: 664:330.341.1.62.001.7 (00)
Ключевые слова: просвечивающая электронная микроскопия; техногенные наночастицы; безопасность пищевых продуктов; нанодисперсия.
Методические аспекты анализа наночастиц серебра в молоке
методом просвечивающей электронной микроскопии
К.И. Попов, д-р хим. наук, профессор, Н.Н. Котова, д-р хим. наук, доцент, Н.В. Осташенкова, канд. техн. наук, профессор, О.В. Красноярова
Московский государственный университет пищевых производств
А.В. Шапагин, канд. хим. наук, В.В. Матвеев, А.Е. Чалых, д-р хим. наук, профессор Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН
Развитие пищевой наноиндустрии ставит задачи обеспечения безопасности производимых продуктов питания и разработки методов контроля содержания в них техногенных наночастиц, обладающих потенциальной опасностью для здоровья человека. Проблема обнаружения и количественного определения содержания техногенных наночастиц в пищевых матриксах чрезвычайно актуальна как для мирового сообщества в целом, так и для России [1-4]. Такие частицы в ряде случаев вводятся в пищевой продукт целенаправленно, например, для обогащения таким элементом, как селен [2]. Вместе с тем, попадание техногенных наночастиц в пищевые продукты также может происходить за счет миграции с поверхности упаковочных пленок с антибактериальным покрытием, имеющих слой наночастиц серебра, двуокиси титана или окиси цинка [4].
Трудности анализа, в первую очередь, связаны с необходимостью обнаружения таких потенциально опасных техногенных наночастиц, как серебро, двуокись титана, селен, окись цинка, на фоне естественных бионаночастиц пищевого матрикса (например, белков). Для многих методов такие частицы неразличимы. Вторая, не менее важная, проблема - пробоподготовка, так как любые попытки концентрирования дисперсии или разделения ее на фракции могут приводить к агрегации изначально содержащихся в продукте наночастиц. В результате может быть получен недостоверный или ошибочный результат.
В настоящей работе представлены методические приемы пробоподго-товки и метод обнаружения и количественной оценки содержания наночастиц тяжелых элементов в пи-
Key words: transmission electronic microscopy; engineered nanoparticles; safety of food products; nanodisper-
щевом матриксе на модельном примере серебра в молоке.
В качестве жидкого пищевого продукта было использовано детское молоко «Агуша» 3,2 %-ной жирности (Республика Беларусь). Наносе-ребро - медицинский препарат «Ар-говит» (ТУ 9310-13-00008064-00, ООО НПЦ «Вектор-Вита»), содержание серебра - 0,8 мас. %, имеется стабилизатор коллоидной эмульсии поливинилпироллидон.
На предварительном этапе нами было установлено, что детекция на-ночастиц серебра в молоке методом ПЭМ возможна только при условии предварительного удаления жира. Пробу холодного молока (20 мл) помещали в центрифугу «Эппендорф», в которой при -5 °С, 6000 мин-1 за 15 мин отделяли большую часть жира. Затем 200 мкл препарата «Арговит» вносили в 10 мл обезжиренного молока и смесь гомогенизировали в ультразвуковой ванне при комнатной температуре.
Использовали просвечивающий электронный микроскоп EM-301 Philips и сканирующий электронный микроскоп Philips SEM-500. На просвечивающем электронном микроскопе исследования проводили при комнатной температуре и при ускоряющем напряжении 80 кВ. Остальные параметры микроскопа подбирали таким образом, чтобы обеспе-
чить разрешающую способность прибора, позволяющую уверенно идентифицировать нанодисперсные частички размером до 1 нм. Юстировку маркера размеров микроскопа проводили по частичкам известного размера (золи золота 15+20 нм) для каждого увеличения. Съемку образцов производили на электронный носитель в графическом формате."^ с разрешением не ниже 2016 х 1344 точек. С одного образца делали не менее 10 микрофотографий различных областей (для обеспечения достаточной статистической выборки суммарное количество наночастиц на отснятых областях должно быть не менее 100 шт.).
Выполнение анализа методом электронной микроскопии состояло из трех основных этапов: подготовка образца продукции для препарирования (обезжиривание, дегазация, осушка и т. д.) и его препарирование для визуализации на электронном микроскопе; получение микрофотографий образца на электронном микроскопе; анализ микрофотографий и математическая обработка полученных результатов.
Препарирование объекта для исследования включало следующие операции. Каплю фиксированного объема (^кап = 10 мкл) исследуемой жидкости наносили на сетку-подложку для исследования в просвечивающем электронном микроскопе с предварительно нанесенным слоем углерода (термораспыление в ваку-уме). Далее каплю сушили на воздухе при комнатной температуре, стараясь в процессе сушки достичь равномерного распределения дисперсных частичек по всей площади капли. Вспомогательным методом сканирующей электронной микроскопии определяли размер следа высохшей капли (рис. 1).
Для анализа на просвечивающем электронном микроскопе из сетки-
Рис. 1. Микрофотография следа высохшей капли разбавленного молока, полученная на сканирующем электронном микроскопе Philips SEM-500
BRANCH HARDWARE
Рис. 2. Микрофотография наночастиц серебра в разбавленном молоке, полученная на просвечивающем электронном микроскопе EM-301 Philips после 50 мин травления в плазме кислородного разряда
Рис. 3. Микрофотография наночастиц серебра в разбавленном молоке, полученная на просвечивающем электронном микроскопе
количество дисперсных включении во всеИ капле:
N б = N10S б /S10
общ 10 общ 1С
Площадь следа всей капли определяли методом взвешивания. Распечатанные на листах формата А4 каплю и квадрат известной площади
(снятые при одинаковых увеличениях) взвешивали и по формуле 5, = т /(т /16) рассчиты-
общ капли/ квадрата/ 1
вали площадь капли. Например, масса листа квадрата, соответствующего площади 16 мм2 (согласно маркеру на фото), составляет 1,7764 г, а масса сфотографированной с тем же увеличением, что и квадрат следа
подложки вырезали образцы размером 3 мм в диаметре. В случае недостаточного разбавления тестируемого вещества (рассеивания электронного пучка надмолекулярными структурами объекта исследовании) образец травили 50 мин в плазме кислородного разряда (ВУП-5) с целью уменьшения толщины высохшей капли за счет травления органических структур (рис. 2).
Затем высохшую каплю помещали в электронный микроскоп и получали изображения (рис. 3).
Анализ микрофотографий заключался в следующем. Полученные микрофотографии при помощи программного приложения Adobe PhotoShop переводили в черно-белый режим и контрастировали (рис. 3). В зависимости от увеличения, при котором получена микрофотография, на ней размещали маркер размера (отрезок известной длины) и рассчитывали количество дисперсных частиц (Nq6[), содержащихся во всем объеме капли. Для этого считали суммарное количество частиц, зафиксированных на отснятых 10 микрофотографиях (N10). Зная площадь следа всей капли (5общ) и площадь микрофотографий (S ), определяли
Микрофотографии дисперсии серебра (ПЭМ) и результаты их обработки
ТЕХНИЧЕСКОЕ ОСНАЩЕНИЕ ОТРАСЛИ _
'Hfl' ТЕМА НОМЕРА НАНОТЕХНОЛОГИИ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
высохшей капли объемом 10 мкл, равна 1,984 г. Таким образом, площадь капли составляет 17,8698 = 1,984/(1,7764/16) мм2.
Массу всех частичек (m), содержащихся в капле заданного объема, рассчитывали из плотности материала частиц (r) и их объема (V). Объем частиц определяли, исходя из их сферической формы и наиболее часто встречаемого размера дисперсных включений (Я-радиус), известного из предварительно построенной графической зависимости распределения частиц по размерам:
m = rV,
V = 4/3рЯ3.
Концентрацию дисперсных частиц (С) рассчитывали по формуле:
С = m/V .
! кап
Результаты математической обработки изображений представлены в таблице.
В качестве основного метода исследования был выбран метод про-
свечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Достоинство данного метода - возможность обнаружения наночастиц, содержащих «тяжелые» элементы на фоне «прозрачных» для электронного пучка органических нанодисперсий белков, жиров и полисахаридов. Вместе с тем, очевидный недостаток ПЭМ - необходимость работы с сухими образцами, а при высушивании может происходить агрегация наночастиц, искажающая их размеры.
Тем не менее, частицы наносе-ребра в молоке методом ПЭМ были обнаружены, агрегации удалось избежать. При этом распределение частиц по размеру по сравнению с «чистым» Арговитом существенно не изменилось. Средний размер частиц наносеребра составил 48 нм, а определенная экспериментально концентрация наносеребра в молоке Срасч - 0,00012 г/мл при теоретически рассчитанной по величине внесенной в молоко массы Арговита С = 0,000157 г/мл.
1 теор ' !
Относительная ошибка I составила 24 %, что для маленьких концент-
раций является приемлемым результатом. Полученные результаты позволяют полагать, что Арговит-хороший эталон для отработки методик анализа нанодисперсий тяжелых элементов и их соединений в пищевых матриксах. Вместе с тем, необходимо отметить, что для широкой апробации методики необходимы масштабные испытания как собственно Арговита, так и других нанодисперсий в разных пищевых матриксах.
Таким образом, впервые разработана и апробирована методика выявления и определения содержания наночастиц серебра в молоке методом просвечивающей электронной микроскопии, получены результаты количественного определения содержания наночастиц в искусственных дисперсиях жидких пищевых продуктов.
Метод просвечивающей электронной микроскопии позволяет детектировать нанодисперсии серебра на фоне естественных частиц жира в пищевых матриксах, что невозможно сделать ни при помощи АСМ, ни при помощи динамического светорассеяния.
В случае высокостабилизирован-ных нанодисперсий пробоподготов-ка оказалась оправданной и к агрегации не приводила.
Данная работа выполнена при поддержке государственного контракта от 11 ноября 2008 г. № 01.648.12.3023.
ЛИТЕРАТУРА
1. Tiede, К. Detection and characterization of engineered nanoparticles in food and the environment/K.Tiede, [et al.]//Food Additives and Contaminants Part A. -2008. - Vol.25. - No.7. - P.. 795821.
2. Попов, К.И. Пищевые нанотех-нологии/К.И. Попов, А.Н. Филиппов, С.А. Хуршудян//Российский химический журнал (Журнал ВХО им. Д.И. Менделеева). - 2009. - Т. 53. - № 2. С. 86-97.
3. Ligeng, Xu. Applications and toxicological issues surrounding nanotechnology in the food industry/ Xu. Ligeng, L. Ying, R. Bai, Ch. Chunying//Pure and Applied Chemistry. - 2010. - Vol. 82. No. 2. -P. 349-372.
4. Simon, P. Migration of engineered nanoparticles from polymer packaging to food - a physicochemical view/P. Simon, Q. Chaudry, D. Bakos//J. of Food and Nutrition Research. - 2008. - Vol. 47. - No.3. - P. 105-113.
