CC BY
31
УДК: 664: 620.22 (045)
Использование атомно-силовой микроскопии
для обнаружения наночастиц в продуктах питания
Д.О. Подкопаев, студент 5 курса Московский государственный университет пищевых производств
Сегодня разработки в области на-нотехнологий все сильнее пронизывают повседневную жизнь. В основном их используют в сфере электроники, материаловедения, медицины и других наукоемких областях. Но по мере развития эти разработки коснулись и продуктов питания.
В целом данные технологии можно применять для различных целей: создание «умной» упаковки, упаковки, обладающей бактерицидными свойствами, обогащение продуктов питания пищевыми добавками в виде наночастиц и т. д. Целесообразность добавления таких частиц обусловлена их уникальными качествами: высокой бактерицидной активностью, способностями легко проникать в клетки, придавать упаковке новые свойства и т. д. На сегодняшний день уже есть производители, использующие данные технологии (в основном в США, Южной Корее).
Также существуют методы, позволяющие исследовать наноразмерные объекты: просвечивающая электронная микроскопия, растровая электронная микроскопия, зондовая сканирующая микроскопия, динамическое лазерное светорассеяние и т. д.
Но наряду с уникальностью данные технологии могут нести определенную опасность, и в связи с этим должны быть созданы методы, позволяющие контролировать безопасность и качество тех продуктов питания, где используют нанотехно-логии. К сожалению, из-за сложной структуры пищевых продуктов (наличие собственных коллоидных структур, многокомпонентность и многофазность, изменчивость в течение времени) непосредственное применение вышеперечисленных методов для анализа и контроля невозможно.
Данная статья посвящена исследованию продуктов питания на предмет наличия в них наночастиц с целью определения их формы, размеров и концентрации в продуктах питания.
В целом всю программу исследования можно разделить на несколько этапов, представленных на рис. 1.
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия; наночастицы; продукты питания; пробоподготовка.
Key words: atom-power microscopy; nano-particles; foodstuff; sample preparation.
На этапе отбора образца должна соблюдаться стерильность, так как продукты питания могут быть богатой питательной средой для различных микроорганизмов, что особенно актуально для таких продуктов, как молоко, соки, пиво и т. д.
Пробоподготовка - ключевой этап в исследовании, так как именно этот этап позволяет применять вышеперечисленные стандартные методы исследования. Основная цель про-боподготовки - получить препарат, который можно исследовать стандартными методами. В связи с этим в зависимости от исследуемого объекта пробоподготовка различается. В частности, при исследовании пива нужно сделать лишь серию разбавлений, а для исследования молока необходимо предварительное проведение гидролиза, диализа, центрифугирования.
Исследовать продукты питания после пробоподготовки можно различными стандартными методами. В данной работе основной метод исследования - метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). Исследуемое вещество в этом методе - раствор наночастиц в воде или другом растворителе, не содержащим посторонних веществ или содержащим их в малых количествах. Данный раствор наносят на подложку (слюда, полимер) [1] и после высыхания проводят измерения.
На этапе анализа данных осуществляют обработку информации, полученной в результате исследования. Она включает: выравнивание изображений, использование различных фильтров, применение программ для статистического анализа. На выходе получают статистические данные о форме и размерах частиц. Также можно сделать вывод о концентрации частиц при применении определенных методов.
В заключении необходимо указать такие характеристики, как размер частиц, форма частиц, их концентрация.
В эталонной нанолаборатории МГУПП проводили исследования на модельных образцах молока и пива с добавлением в них наночастиц серебра и частиц оксида титана. Выбор наночастиц серебра обусловлен их высокой бактерицидной активностью и в связи с этим использованием их в упаковке. В зависимости от типа упаковки миграция таких частиц в продукт может происходить с разной скоростью или в идеальном случае не происходить вовсе. Важное условие - нахождение наночастиц в продукте в допустимых концентрациях.
Первым продуктом, выбранным в качестве исследуемого образца, было пиво. Так как пиво не содержит большого количества минеральных солей и в целом является гомогенной системой (использовали фильтрованное пиво, не содержащее большого количества дрожжевых клеток), при его исследовании не возникло необходимости в сложной пробоподготовке. Вся пробоподготовка в данном случае представляла собой разведение исходного образца дистиллированной водой с последующим нанесением капли раствора на подложку. В качестве модельных образцов использовали растворы пива с добавлением наночастиц се-
Отбор образца
Пробопод-готовка
Проведение исследования
Анализ данных
Заключение
Рис. 1. Основные этапы исследования продуктов питания
Исходный продукт * Гидролиз Центрифугирование Диализ Проведение АСМ-измерения
Рис. 4. Пробоподготовка молока
ребра диаметром менее 100 нм. При этом было замечено, что в данных пробах могут присутствовать крупные частицы (размером порядка нескольких микрон) неизвестной природы (рис. 2), а также конгломераты наночастиц серебра.
Для того чтобы данные частицы и другие случайные дефекты поверхности не вносили искажений при статистическом анализе, достаточно лишь выбрать другую область сканирования, где подобные дефекты отсутствуют. Измерения проводили в полуконтактном режиме сканирования.
После проведения измерений обычно следует этап математической обработки. На рис. 3 приведены два типа изображений: исходное (содержащее естественный наклон поверхности) и полученное в результате математической обработки (выровненное).
Последнее изображение может быть подвергнуто анализу с помощью специальных программ для обработки данных с целью определения размеров частиц.
После проведения статистической обработки можно сделать вывод о размерах и форме частиц, присутствующих в данном образце пива.
В случае с молоком невозможно применить предыдущий подход, поскольку данный продукт изначально представляет собой устойчивую гетерогенную систему, непригодную для прямого анализа. При непосредственном исследовании подобных образцов компоненты продукта загрязняют поверхность зонда, что приводит к его порче. Для устранения данной проблемы автором данной статьи была пред-
ложена методика пробоподготовки, изображенная на рис. 4.
Основная сложность при анализе подобного рода продуктов - разрушение устойчивых компонентов без изменения размеров и формы нано-частиц. В молоке такими компонентами выступают белки и жиры. Для разрушения подобных структур были опробованы два типа гидролиза - кислотный и ферментативный.
Кислотный гидролиз заключается в добавлении к продукту соляной кислоты в 100-кратном избытке по отношению к белкам, содержащимся в продукте, и достижении конечной концентрации соляной кислоты на уровне 6М раствора. При выдерживании такой смеси при 37 0С в течение 72 ч белки, входящие в состав мембран капелек жира и в состав молока, в целом гидролизуются до ди- и трипептидов [2], что вполне достаточно для потери агрегативной устойчивости капель жира.
Для последующего отделения жиров центрифугируют гидролизат при температуре 4 °С. После проведения данной операции супернатант уже практически не содержит жиров и его можно подвергнуть дальнейшей очистке с помощью диализа.
Диализ - важнейшая составляющая процесса про-боподготовки, поскольку именно на этой стадии происходит конечная очистка раствора наночастиц от пептидов, сахаров, солей и прочих загрязнителей. В слу-
чае, если диализ не проводится и су-пернатант используется для АСМ-из-мерений, на поверхности образца появляется большое количество загрязняющих компонентов, не позволяющих определить форму и размер наночастиц. Подобная ситуация показана на рис. 5.
После проведения диализа образец представляет собой раствор на-ночастиц с небольшим содержанием примесей. Именно такой раствор применяли в дальнейшем для АСМ-измерений, аналогичных измерениям образцов пива.
К сожалению, в процессе исследования было выяснено, что добавление концентрированной соляной кислоты приводит не только к гидролизу компонентов молока, но и к агрегации наночастиц серебра. Кроме того, данный вариант гидролиза допустим только для наночастиц серебра, так как другие наночастицы могут растворяться в соляной кисло-
те. Подобное явление продемонстрировано на рис. 6.
Поскольку данный вариант гидролиза вызвал сильное изменение размеров наночастиц, было принято решение воспользоваться ферментативным гидролизом. В качестве ферментов был выбран комплекс, содержащий основные компоненты поджелудочной железы и желчи. Существенный недостаток данного метода состоит в том, что сами ферменты, являясь белками, не способны проникать через узкопористую (до 10 нм) мембрану. В связи с этим для диализа приходится использовать мембраны с диаметром пор больше 10 нм для того, чтобы обеспечить очистку наночастиц от ферментов. В результате такой пробо-подготовки невозможно проводить анализ наночастиц размером, меньше, чем размеры пор мембраны. Но несмотря на подобное ограничение данный метод с успехом позволяет анализировать множество продуктов, содержащих наночастицы размером в несколько десятков нанометров.
В результате проделанной работы были проанализированы модельные образцы молока с концентрацией наночастиц серебра 20 мг/л. Подобная концентрации была выбраны для удобства нахождения и измерения наночастиц. На рис. 7 приведено изображение наночастиц серебра в молоке.
Также в результате исследований было выяснено, что качество получаемых изображений очень сильно зависит от качества пробоподготов-ки. В частности, было установлено, что при недостаточно эффективном гидролизе на поверхности образца при его высушивании выпадают кристаллы веществ, растворенных в образце. Кроме того, при недостаточно эффективном центрифугировании невозможно отделить практически весь жир, входящий в состав продукта, что, в конечном счете, приводит к забивке мембран при проведении диализа и, следовательно, к снижению его эффективности, а также появлению крупных жировых пятен на уже высушенном образце. Данные сложности сильно затрудняют процесс идентификации наночастиц, а в некоторых случаях делают его невозможным. Но часто получить идеально очищенный образец невозможно. Для того чтобы обеспечить возможность исследования слабо загрязненных образцов можно воспользоваться различными вариантами зондовой сканирующей микроскопии. В данной работе в качестве
усовершенствованного метода использовали электросиловой вариант АСМ [3]. В качестве образца брали молоко, содержащее наноча-стицы серебра и частицы оксида титана в концентрациях 20 мг/л. В результате проделанной работы было выяснено, что с помощью данного метода можно проводить исследования достаточно загрязненных образцов. На рис. 8 представлено АСМ-изображение сигнала «высота» и «фаза» модельного образца молока с наночастицами серебра и частицами оксида титана.
При проведении данного исследования было выяснено, что, к сожалению, невозможно провести селективное распознавание частиц серебра и оксида титана.
Как было указано выше, итогом проведения исследования должен быть вывод о размерах, форме и концентрации наночастиц. Для того чтобы выяснить концентрацию на-ночастиц в продуктах питания, можно воспользоваться следующим алгоритмом:
определить форму и средний размер наночастиц с помощью метода АСМ;
определить концентрацию анализируемого вещества (основного компонента наночастиц) в продукте с помощью стандартных методов (особенно чувствительным является метод атомно-абсорбционного спектрального анализа);
рассчитать концентрацию наноча-стиц, исходя из формулы:
Снано —
3C 4рпг3
где Снано - концентрация нано-частиц в исследуемом образце; С - концентрация анализируемого вещества; р - плотность наночастиц; г- средний радиус наночас-тиц.
В данном случае принимается, что частицы имеют сферическую форму.
Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан метод пробо-подготовки образцов, содержащих коллоидные структуры на примере молока, стало возможным проводить исследования различных продуктов питания с помощью атомно-силовой микроскопии на предмет наличия в них нано-частиц.
Рис. 8. Образец молока с наночастицами серебра и частицами оксида титана: слева изображение сигнала «высота», справа - сигнала «фаза»
ЛИТЕРАТУРА
1. Повстугар, В.И. Способы фиксации высокодисперсных частиц для АСМ-исследований/В.И. Повстугар, С.Г. Быстров, С.Ф. Ломаева, С.С. Ми-хайлова//Материалы всероссийского совещания «Зондовая микроскопия - 2000». - Нижний Новгород: ИФН РАН, 2000, с. 337-341.
2. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки: пер. с англ./Т. Дэвени, Я. Гергей. -М., 1976.
3. Миронов, В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии/ В.Л. Миронов. - М.: Техносфера, 2005.
«1С. Т.К.»
представитель
концерна
ООО
Торговый непещюю ^^
EMSLAND-STÂKKE GMBH
ПРЕДЛАГАЕТ следующие пищевые добавки;
TCPÀlfM^ А Ш. " картофельный модифицированный 1V1 Ш\1т1Л)/Ш1« ■ кукурузный модифицированный
•соусов, кетчупов и майонеза для »детского литания и молочных продуктов
прпмчвплгтйл- .консервов и мясной гастрономии итои^надивд, «безалкогольныхнапитков
• кондитерских и хлебобулочных изделий
СУХОЕ КАРТОФЕЛЬНОЕ ПЮРЕ И КАРТОФЕЛЬНЫЙ ГРАНУЛЯТ
мешки по 25 кг
Спшбилгмые поставки. Вся продукция сертифицировав (49» 575-6471, 575 6570 х/ф, <49S> 573 -4083 (495) 508-85-72, 508-85-73
14И00 Россия, Московская область, г. Химки, ул. Энгельса, д. 10/19
