CC BY
28
УДК 544.2:637.141
СИНТЕЗ ВИСКЕРНОГО НАНОГИДРОКСИАПАТИТА В КАЗЕИНОВОЙ СРЕДЕ, ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКОВОГО РАСТВОРА НА ЕГО МОРФОЛОГИЮ И СТРУКТУРУ
А.В. Северин1, В.Е. Божевольнов1, И.Т. Смыков2
(кафедра радиохимии; 2ГНУ ВНИИМС Россельхозакадемии, г. Углич; e-mail: severin@ radio.chem.msu.ru)
Рассмотрен способ синтеза наночастиц гидроксиапатита (н-ГАП) в среде с биополимерными модификаторами при ультразвуковой активации процесса. В качестве модификатора предложено использовать казеин. Показано, что раствор белка в концентрации 0,2% обеспечивает получение н-ГАП в виде вискеров диаметром 2 нм и длиной до 10 нм, соответствующих нативному коллоидальному фосфату кальция мицелл казеина в молоке. Синтезированные наночастицы могут быть использованы для интенсификации технологических процессов в молокоперерабатывающей промышленности и обогащения пищевых продуктов кальцием в природной форме.
Ключевые слова: синтез, молоко, мицеллы казеина, коллоидальный фосфат кальция, гидроксиапатит.
Соединения кальция - основной компонент для формирования костных тканей животных и человека. Они присутствуют в молоке, яйцах, икре и других пищевых продуктах, из которых и получает их организм человека. Однако большое количество больных с костными травмами, остеопорозом, а также стоматологических больных нуждаются в специальных биооптимизованных кальцийсодержащих лекарственных и биологически активных средствах.
Синтетический наногидроксиапатит (н-ГАП) - одно из наиболее подходящих веществ для решения вышеуказанных задач, поскольку является естественным компонентом человеческого организма [1]. В зависимости от области применения возможно создание композиционных материалов н-ГАП с неорганическими и органическими биологически активными веществами [2]. Для решения конкретных практических задач требуется синтезировать н-ГАП с определенными размерами, наиболее близкими к его естественным функциональным размерам. Так, известно, что стабильность молока (основного естественного источника кальция для человеческого организма) как дисперсной системы обеспечивается кол -лоидальным фосфатом кальция (наночастицы н-ГАП с размером 2-5 нм), который связывает отдельные белковые молекулы в глобулы размером 100-150 нм [3, 4]. Этот факт привел исследователей разных стран к многочисленным попыткам использовать синтетический н-ГАП в целях улучшения качества молочной
продукции. Частицы такого гидроксиапатита обычно имеют размеры порядка 60-100 нм, что значительно превышает размеры его частиц в молоке. Синтез на-ночастиц н-ГАП меньших размеров связан с большими техническими трудностями из-за его чрезвычайно высокой агрегативной активности. Уменьшение размеров наночастиц можно получить при ультразвуковом воздействии на систему в процессе их синтеза [5] или при синтезе в среде с модификаторами, роль которых выполняют биополимеры [6, 7]. В данной работе для синтеза н-ГАП с размерами частиц менее 10 нм был использован основной белок молока - казеин в форме казеината натрия в разной концентрации.
Методика эксперимента
Синтез н-ГАП проводили по методике [8] в специальном реакторе, позволяющем при необходимости использовать в процессе синтеза ультразвуковое воздействие (рис. 1). Реактор представляет собой цилиндрический тефлоновый сосуд, на боковой стенке которого предусмотрено крепление высокочастотного излучателя. Подачу ортофосфорной кислоты осуществляли непрерывно с помощью специального узла по керамической трубке (диаметр 1 мм), проходящей сквозь стенку реактора напротив высокочастотного излучателя и перпендикулярно ему. Датчики рН и температуры вмонтированы в крышку реактора, через центральное отверстие которой осуществляется также дополнительное перемешивание с
Рис. 1. Схема реактора: 1 - ввод фосфорной кислоты, 2 - стенка реактора, 3 - реакционная смесь, 4 - крышка реактора, 5 - рН-электрод, 6 - низкочастотный ультразвуковой излучатель, 7 - термопара, 8 - высокочастотный ультразвуковой излучатель, 9 - якорь магнитной мешалки.
помощью лопастной мешалки или дополнительного низкочастотного излучателя. В работе был использован Р-казеинат натрия квалификации «ч.». Водные растворы модификатора готовили в концентрации 0,05%; 0,2; 1,0 и 3%. Перед проведением синтеза их интенсивно перемешивали в течение 1 ч. Далее проводили синтез н-ГАП с рН-метрическим контролем. По окончании синтеза (рН 6,5-7,0) отбирали пробы для проведения электронной микроскопии и рентге-нофазового анализа (РФА). Полученную суспензию
хранили в стеклянной таре в холодильнике. В одном из экспериментов (при концентрации казеина 0,2%) было использовано УЗ-воздействие (22,4 кГц) для большей седиментационной устойчивости получаемой суспензии.
Морфологию синтезированных наночастиц изучали методами трансмиссионной электронной микроскопии с помощью микроскопов обычного («1ео1, ШМ-100Б», Япония) и высокого («1ео1, ШМ-2100», Япония) разрешения. Образцы для электронной микроскопии готовили путем нанесения на специальную медную сеточку с формваровой пленкой капли суспензии изучаемых образцов, разбавленной дистиллированной водой в соотношении 30:1. Далее образцы высушивали на воздухе и хранили в специальных пеналах. По результатам морфологического анализа полученных микрофотографий были построены функции распределения наночастиц н-ГАП по размерам.
Рентгенофазовый анализ полученных в работе образцов осуществляли на дифрактометре «8ТАБ1/Р» (фирмы «8ТОБ»). Съемку проводили на медном аноде с СиКа1-излучением.
Седиментационную устойчивость тестировали по скорости образования осветленного слоя суспензии в мерных цилиндрах (10 мл) одинаковой геометрии при комнатной температуре.
Результаты и их обсуждение
Данные РФА показывают, что все представленные образцы являются 100%-м ГАП (рис. 2). Уши -рение линий рентгеновских дифрактограмм свидетельствует о высокой дисперсности полученных препаратов. Оценочные размеры кристаллитов (бло -
///п
///п
20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70
20
20
Рис. 2. РФА-спектры образцов ГАП-казеин: а - синтез ГАП в 0,05%-м казеине; б - синтез ГАП в 1%-м
казеине
ков), рассчитанные по данным РФА, составляют величину 12±2 нм.
Данные, полученные с помощью электронной микроскопии, представлены на рис. 3. Они иллюстрируют существенное изменение морфологии на-ночастиц гидроксиапатита, полученных в среде казеина с разной концентрацией.
Как видно из микрофотографий на рис. 3, синтез н-ГАП уже в 0,2%-м растворе казеина приводит к образованию нитевидных (вискерных) кристаллов ГАП, размеры которых уже близки к размерам естественных частиц ГАП в молоке. Об этом свидетельствуют и функции распределения полученных кристаллов по размерам (рис. 4). Ширина таких кристаллов находится в пределах 3-5 нм, что близко к предельному размеру частиц фосфата кальция в молоке или в человеческом организме. С помощью электронной микроскопии высокого разрешения («1ео1, ШМ-2100», Япония) удалось выявить, помимо вискерных, частицы н-ГАП, размер которых в точности соответствует размерам коллоидных частиц фосфата кальция в молоке (рис. 5).
а
в
- ■ ----
100 пш
Подобные морфологические характеристики на-ночастиц были получены ранее при синтезе н-ГАП в среде коллагена и альбумина [6, 7]. Поэтому можно предположить, что характер взаимодействия вискер-ных наночастиц гидрокисапаптита с молочными белками должен быть схожим с механизмом, предложенным в этих работах.
Кроме того, существуют данные о том, что присутствие казеина в реакционной смеси при образовании гидроксиапатита приводит к торможению кристаллизации гидроксиапатита из аморфного фосфата кальция [9].
Казеин способствует агрегации образующихся на-нокристаллов в любых концентрациях. Этот процесс может быть направленным (в случае малых концентраций казеина), в результате чего образуются агрегаты частиц, сросшиеся определенными гранями, или ненаправленным (образование флокулярных структур). В результате седиментационная устойчивость суспензий должна различаться, что и демонстрируют наши эксперименты по скорости образования осветленного слоя (рис. 6).
б
Рис. 3. Морфология частиц н-ГАП, образующихся в ходе синтеза в присутствии разного количества казеина: а - без казеина (ГАП0); б - в 0,05%-м растворе казеина; в - в 0,2 %-м растворе казеина; г - в 1%-м растворе казеина
F(L) a F(H) б
Рис. 4. Функции распределения частиц н-ГАП по длине (а) и ширине (б), синтезированных в растворе казеина разной концентрации (%): 1 - 1; 2 - 3; 3 - 0,2; 4 - 0,05; 5 - ГАП-УЗ10 (синтез в ультразвуковом поле по данным [5]); 6- ГАПО
(синтез без казеина)
Как видно из графиков на рис. 6, суспензия, полученная в эксперименте по синтезу ГАП в растворе казеина с использованием УЗ-воздействия, демонстрирует большую седиментационную устойчивость в течение первых 12 ч эксперимента. Данный параметр важен для дальнейшего тестирования препаратов в технологических процессах переработки молока. Поэтому в дальнейшем возможно введение в состав реакционной смеси некоторых ПАВ для предотвращения агрегации.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработан и апробирован метод синтеза вискерных наночастиц гидроксиапатита, характеризующихся большим удлинением при минимальных поперечных размерах порядка 2 нм. Определено влияние концентрации казеина и режимов ультразвукового воздействия на размеры и морфологию
Рис. 5. Частица н-ГАП «нативного» размера
V, мл
0 10 20 30
Рис. 6. Скорость образования осветленного слоя суспензий ГАП-казеин при концентрации казеина (%): 1 - 0,05; 2 - 1; 3 - 0,2; 4 - 0,2 + УЗ
синтезируемых наночастиц. Показано, что вискерные наночастицы ГАП образуются в растворах казеина с концентрацией последнего не ниже 0,2 мас.%.
Синтезированные в ходе экспериментов препараты будут исследованы в дальнейшем в ГНУ ВНИ-ИМС Россельхозакадемии (г. Углич) на предмет их практического использования в молокоперерабатыва-ющей промышленности. Можно предположить, что разработка гибкой технологии синтеза подобных на-ночастиц фосфата кальция и их использование в производстве молочных продуктов позволит не только повысить эффективность процессов переработки молока, но и существенно улучшить качество молочных продуктов, насытив их источником биологически активного кальция.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 13-08-01142 А).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мелихов И. В. Нанотехнология обеспечения «кальциевого здоровья» нации http://www.nanometer.ru/2009/03/10/ bad_110053.html (дата обращения 2009 г.).
2. Suchanek W., Yahimura M. // J. Mater. Res. 1998. Vol. 13. N 1. P. 94.
3. Lucey J.A. ADSA Foundation Scholar. Award Formation and Physical Properties of Milk Protein Gels // J. Dairy Sci. 2002. Vol. 85. P. 281.
4. Holt C., de Kruif C.G., Tuinier R., Timmins P.A. // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 2003. Vol. 213. P. 275.
5. Рудин В.Н., Северин А.В., Николаев А.Л., Гопин А.В., Бурлов П. С. // Тез. VII Междунар. науч. конф. Кинетика и механизм кристаллизации. Иваново, 2012. С. 11.
6. Галиуллина Л.Ф., Мазалева О.Н., Рудин В.Н., Салахов М.Х., Северин А.В., Силкин Н.И., Хайруллин Р.Н., Челышев Ю.А. // Ученые записки Казанского университета. Сер. Естеств. науки. 2012. Т. 154. № 3. С. 127.
7. Severin A.V., Badun G.A., Chernysheva M.G. // Moscow University Chem. Bul. 2011. Vol. 66. N 6. Р. 371.
8. Мелихов И.В., Комаров В.Ф., Божевольнов В.Е., Северин А.В., Рудин В.Н. // ДАН. 2000. 373. № 3. С. 355.
9. Van KemenadeM.J.J.M, de Bruyn P.L. // J. Coll. Interface Sci. 1989. Vol. 129. P. 1.
Поступила в редакцию 24.09.13
NANOHYDROXYAPATITE VISKER SYNTHESIS IN CASEIN MEDIUM. EFFECT OF PROTEIN SOLUTION CONCENTRATION ON MORPHOLOGY AND STRUCTURE OF GAP
A.V. Severin, V.E. Bozhevolnov, I.T. Smykov
(Division of Radiochemistry The Moscow State University, Chemistry department, Moscow, Russia; GNU VNIMS, Uglich, Russia)
The hydroxyapatite nanoparticles (n-GAP) preparation in biopolymer modifiers solutions under ultrasonic activation have been investigated. The casein as modificator was suggested. It was shown that the protein solution with concentration by 0,2% provide the visker n-GAP producing with diameter of 2 nm and length of 10 nm. This size of n-GAP is correlated to colloidal calcium phosphate in milk casein micelles. Synthesized nanoparticles can be used for intensification of technologies processes in dairy industry and food beneficiated by nature form of calcium.
Key words: synthesis, milk, casein micelles, colloidal calcium phosphate, hydroxyapatite.
Сведения об авторах: Северин Александр Валерьевич - доцент кафедры радиохимии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (severin@radio.chem.msu.ru); Божевольнов Виктор Евгеньевич - вед. науч. сотр. кафедры радиохимии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (bozh@radio.chem.msu. ru); Смыков Игорь Тимофеевич - сотр. Всероссийского научно-исследовательского института маслоделия и сыроделия Россельхозакадемии, отдел физической химии. 152613, Углич, Ярославская область, Красноармейский бульвар, д. 19 (i_smykov@mail.ru).
