CC BY
27УДК 577.21+631.522/.524 http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).201б.88б78
Метод визначення сортово! чистоти (типовосп),
§ ✓ • • «V • •
поридносп, стерильносп парли нас1ння на основ* встановлення к1льк1сного сп1вв1дношення алел1в ДНК-маркер1в
Ж. В. Вдовиченко, В. Г. Спиридонов, С. В. Хомутовська, М. Ф. Пар1И
Нац1'ональнийуниверситет бюресурав i природокористування Укртни, вул. Героев Оборони, 15, м. Кшв, Украина, 03041, е-таИ: [email protected]
Мета. Розробити принципово новий метод визначення сортово'1 чистоти (типовости), пибридности, стерильности парп'й насиння. Методи молекулярно'' бтолопИ' (екстракция пеномно'' ДНК, ПЛР из застосуванням ББ1^-маркерив, капилярний електрофорез), пенетичний та статистично-математичний анализ. Результати. Розроблено новий метод визначення сортових якостей партий насиння, що складаеться з таких етатв: одночасне видилення ДНК из репрезентативно!' сукупности насинин оци'нюванопо зразка; ПЛР та подальший анализ продуктив амплификаци'' шляхом визначення якиснопо та килькиснопо складу алелив маркерних ББ1^-послидовностей; розрахунок сортових показникив якости партии насиння з використанням експериментально отриманих спиввидношень алелив. Висновки. Розроблений метод визначення сортових якостей партий насиння дае змопу значно скоротити витрати материалив, часу та праци пид час виконання анализу. Послидовне якисне та килькисне визначення алелив у сукупному зразку партии насиння е принципово новим пидходом для встановлення сортовой' чистоти (типовости), пибридности, стерильности.
Ключов1 слова: сортова чистота, типовiсть, гiбриднiсть, стерильнкть, ДНК-маркери, ББЯ-маркери, контроль якостi партл наання, ячм!'нь.
Вступ
Сучасш генетико-селекщйш дослвдження базуються на застосуванш ДНК-маркер1в [1-3]. Також молекулярш маркери е зруч-ними для контролю якоси вщгворення сор-т1в та г1брид1в рослин. За допомогою ДНК-технологш можна локал1зувати та маркува-ти як окрем1 гени та локуси к1льк1сних ознак, так i окрем1 дгглянки хромосом, щл1 хромосоми i навiть геноми. Напрямами ви-користання ДНК-маркерiв е iдентифiкацiя та диференцiацiя особин, аналiз родинних зв'язкiв. Цей iнструмент молекулярно! бю-
Zhanna Vdovychenko http://orcnd.org/0000-0002-6070-5518 Vladislav Spyrydonov http://orcid.org/0000-0003-1197-0507 Stanislava Khomutovska http://orcid.org/0000-0003-4888-7184 Myroslav Parii
http://orcid.org/0000-0001-9877-2241
логи широко використовують в кримшал^-тицi, тваринництвi та для сортово! вдентифь каци в рослинництвi. Загалом ДНК-маркери - це будь ям полiморфнi дiлянки ДНК, ям виявляють молекулярними методами. Серед рiзних типiв ДНК-маркерiв два типи - SSR (simple sequence repeat) та SNP (single nucleotide polymorphism) - найб^ьше використовують завдяки !х широкш представленоси у геномi та високому полiморфiзму, який вони забезпечують [4, 5]. Розвиток сучасних технологiй, у тому числi й секвенування, дае змогу розробити бази даних цих маркерiв для б^ьшосп економiчно важливих видiв [6], а технологiй матричного аналiзу (Arrays) - проводити генотипування одразу за багатьма маркерами [7].
Якщо в генетичному аналiзi та шд час вден-тифшаци й визначення родинних зв'язкгв фа-хiвцi в бшьшосп випадкiв мають справу з окремими особинами, то в генетищ рослин та рослиннищга об'ектом дослвджень часто ста-ють популяци з необмеженою кiлькiстю осо-
56
СОРТОВИВЧЕННЯ ТЛ ОХОРОНЛ ПРЛВ на сорти рослин, 2016, № 4 (33)
бин - природш популяци або сорти рослин. Контролювати чистоту поовного матер1алу складшше у раз! культивування перехресно-запильних культур. Але навггь щд час роз-множення самозапильних гомозиготних культур виникае така проблема, як засм1чення поивного матер1алу шшими сортами.
Проведення анал1зу за молекулярними маркерами на р1вш популяцй' е проблемою технчного характеру. Найпоширешшим ла-бораторним методом визначення таких по-казнишв якост! партш насшня, як сортова чистота (типов1сть) або р1вень ибридносп, е електрофоретичний розподш запасних б1л-к1в насшня, як характеризуються певним пол1морф1змом, у пол1акрилам1дному гел1. Цей спос1б передбачае екстракщю бшшв з кожно! насшини та окремий ¿х розподш. За сшвввдношенням типових та нетипових б1л-кових профшей визначаеться оцшюваний показник [8, 9]. Такий спос1б, по-перше, мае недостатню роздшьну здатнсть через неви-сокий пол1морф1зм запасних бшшв, що часто призводить до неможливосп диференща-ц11 сорив [10, 11]. По-друге, вш е часо- та трудозатратним, оскшьки потребуе анал1зу не менше н1ж 50 насшин (зершвок), а за необхвдносп - до 1000 зершвок для партш добазового насшня. Для шдвищення надш-ност1 анал1зу було запропоновано ряд спосо-б1в визначення сортово! чистоти та типовост! партш насшня, як базуються на викорис-танш ДНК-маркер1в, у тому числ1 й SSR [12]. Для визначення типовост! г1брид1в соняшни-ку та кукурудзи за допомогою м1кросател1-т1в вже запроваджено м1жнародш стандарти ISO/TR 17623:2015 та ISO/TR 17622:2015. Однак, за такого шдходу кшьшсть необхвд-них теспв може збшьшуватись пор1вняно з анал1зом за б1лковими маркерами, осшльки кожний окремий генотип слвд протестувати за шлькома пол1морфними локусами. Опти-м1заци в такому анал1з1 досягають за допомогою мультиплексно! ПЛР [13]. Проте ДНК-профшь кожно! насшини зразка все р1вно доводиться анал1зувати окремо.
З огляду на наведене, для встановлення показнишв якост1 партш насшня актуаль-ним е розроблення способу визначення якс-ного та шльшсного складу алел1в ДНК-маркер1в в одному сукупному зразку. Якс-ний та к1льк1сний склад алел1в може бути встановлено одночасно або послвдовно.
Найуживашшим типом кшьшсного анал1-зу вм1сту ДНК у зразку е ПЛР у реальному час! [14], однак И застосування для найб1льш поширених та досл:щжених тишв маркер1в е проблематичним, осшльки у випадку SSR та
SNP ввдмшшсть м1ж двома алелями полягае лише в одному або шлькох нуклеотидах. Для останнього типу маркер1в розроблено систему кшьшсного анал1зу, яка передбачае викорис-тання газо-рвдинно! хроматографй' для розпо-д!лу алел1в [15]. Одночасний анал1з яшсного та кшьшсного складу мшросателггних локу-с1в в одному зразку ДНК м1г би отримати ши-роке застосування у практищ [16].
Мета дослгджепъ - розробити метод визначення сортових якостей партш насшня, зо-крема сортово! чистоти (типовостГ), ибрид-ност1, стерильност1, який би забезпечив зна-чне зниження соб1вартост1 анал1зу, а також часо- та трудозатрати на анал1з.
Материали та методика досл1*джень
Як рослинний матер1ал було використано сорти дворядного та шестирядного ячменю Hordeum vulgare L. з колекци Украшсько! лаборатори якост1 та безпеки продукци АПК (УЛЯБП АПК) (табл. 1). Загалом було про-анал1зовано 27 сорив. Серед масиву сорив для продовження експерименту була обрана пара 'Danuta'/'Barke'. Для анал1зу брали по однш типовш рослин ввд кожного сорту. Також у дослвдження був залучений ибрид першого поколшня м1ж сортами 'Danuta' та 'Barke'. Для цього було використано одну з рослин, отриманих в1д схрещування зазна-чених сорив, шсля шдтвердження ii ибрид-ного статусу за молекулярними маркерами.
Для досл:щження було обрано мшросателгг-ний локус Bmac 0127, локал1зований у 6-й хромосом!. Ампл1ф1кац1ю маркерно! дхлянки проводили з використанням ол1гонуклеотидних праймер1в, один з яких ш.с флуоресцентну мт-ку: [FAM]AACTATGTCCAGTCGTTTCC та CTTGTCGTATCATCTTATTCAGA (5'^3') [17].
Екстракц1ю ДНК зд1йснювали з паростшв на 3-5-ту добу шсля проростання за ЦТАБ-методом [18], який дае змогу отримати до-сить значну к1льк1сть геномно! нуклешово!' кислоти.
Концентрац1ю екстраговано! з рослинного матер1алу ДНК вим1рювали приладом Eppendorf Bio Photometer 6131 зддно з шструкщею. Концентрац1ю вим1рювали в одиницях нг/мкл. Отримаш дан1 стосовно концентрацл в подаль-шому дали можливгсть одержати сум1ш1 ДНК у необхвдних розведеннях.
Пол1меразну ланцюгову реакц1ю проводили в об'ем1 12,5 мкл. Реакцшна сум1ш м1сти-ла Taq-буфер 2,5 мМ MgCl2, Taq-полiмеразу: 1,25 unit, кожний з нуклеозидтрифосфапв (dNTP mix) 0,1 мМ (вс! реактиви компанп Ам-пл!сенс, РФ), кожен з праймер!в 0,5 пМ/мкл, ДНК - 50 нг. Режим ампл!ф!каци - 94 С
ISSN 2518-1017 РЬЛШТ VARIETIES STUDYING ЛПР PROTECTION, 2016, No 4 (33)
57
Рослинництво
протягом 3 хв, 58 °С - 1 хв, 72 °С - 1 хв; дал! проводили 30 цикл!в з такими параметрами: денатурац!я протягом 30 с при 94 °С, ввдпал - 30 с при 58 °С, синтез - 30 с при 72 °С; за-к!нчення - при 72 °С протягом 5 хв.
Продукти ампл!ф!кацп розпод!ляли методом кап!лярного електрофорезу за допомогою генетичного анал!затора Applied Biosystems (ABI) Hitachi 3130xl Prism Genetic Analyzer.
У результат! розгонки продукт!в ПЛР бу-ло отримано експериментальн! значення ви-соти п!к!в флуоресценци, як! св!дчать про !нтенсивн!сть флуоресцентного сигналу. Ви-соту п!к!в вим!рювали генетичним анал!за-тором в умовних одиницях UF (unit of fluorescence). Отриман! значення застосова-но для розрахунку сп!вв!дношення к!лькос-т! ДНК для двох алел!в - R (ratio), яке в свою чергу було використане для розрахун-ку частоти кожного з алел!в p та q, а також показника сортово'1 чистоти зг!дно з [16].
Результати дослиджень
Результати генотипування колекци сорт!в ячменю за локусом Bmac 0127 наведено в таблиц! 1. Оск!льки ячм!нь е самозапиль-ною культурою, то, в!дпов!дно, кожен зра-зок сорту являе собою гомозиготну л!н!ю. У процес! пол!меразно'1 ланцюгово'1 реакци з ДНК сорив продукувався лише один алель, за винятком сорту 'Бадьорий', в якого було виявлено два алел!, що може св!дчити про наявну дупл!кац!ю в геном! цього сорту. Ге-нотипування колекц!' сорт!в за локусом Bmac 0127 виявило 7 алел!в - 112, 118, 120, 122, 124, 126 та 128 п.н. Найчаст!ше трап-лявся алель 122 п.н., властивий 7 сортам з колекци. Алель 112 п.н. виявлено лише у сорту 'Barke'. Для подальших досл!джень обрали два алел! з найб!льшою ! найменшою частотою - 112 та 122 п.н. (частоти 0,037 та 0,259 в!дпов!дно).
Таблиця 1
Результати генотипування колекции сортив ячменю за локусом Bmac 0127
Po3Ml'p алеля, п.н. Ha3Ba copiy Частота алеля
112 'Barke' 0,037
118 'Freja', 'BaflbopMM' 0,074
120 '06o^oHb', 'HapiBHMM', 'KLages', 'Schuyler', 'AnnabeU' 0,185
122 'Danuta', 'HyflOBMM', 'Pejas', 'Ingrid', 'Kamiak', 'Boyer', 'Hesk' 0,259
124 'CeLinka', 'Pasadena', 'Tolar', 'Husky', 'Scarlett', 'O.A.C.21' 0,222
126 '3BepweHHfl', 'Ue3ap', 'Betzes' 0,111
128 'Jersey', 'BaKy^a', 'flwepe.no', 'BaflbopMM' 0,148
Для моделювання р!зного сп!вв!дношення двох алел!в у лабораторному зразку було приготовлено наб!р розчин!в з певною концентра-ц!ею ДНК двох сорт!в ячменю 'Danuta' та 'Barke'. Процентн! концентрацп, як! було вико-ристано, наведено в таблиц! 2. Ц! розведення моделювали сум!ш ДНК п!д час вид!лення нук-ле'ново! кислоти !з сукупност! зерн!вок сорту ячменю, що м!стить дом!шки !ншого сорту.
Застосований метод визначення сп!вв!дно-шень алел!в п!д час ПЛР анал!зу ДНК зраз-ка базуеться на тому, що к!льк!сть продук-т!в ампл!ф!кац!' в одних ! тих же умовах залежить в!д вих!дно' к!лькост! матрично' ДНК у зразку !, в!дпов!дно, к!льк!сть ампл!-ф!кованих фрагмент!в кожного алеля буде залежати в!д вих!дно'1 к!лькост! матрично'1 ДНК в!дпов!дного типу.
П!сля проведення ПЛР з набором сум!шей № 1-12 ДНК сорт!в та подальшого фраг-ментного анал!зу продукт!в ПЛР методом кап!лярного електрофорезу було отримано пари п!к!в з р!зною !нтенсивн!стю флуорес-ценц!' , як! в!дпов!дають пар! досл!джуваних алел!в 112 та 122 п.н. Електрофореграми батьк!вських сорт!в, а також к!лькох сум!-шей ДНК наведено на рисунках 1 ! 2.
112 п.н. t
100 110
122 п.н. t
120 130
а)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
100
110
120
130
б)
Рис. 1. Електрофореграма продуктив амплификации локусу Bmac 0127 з матричною ДНК сортив: а) 'Barke', б) 'Danuta'
Кр!м модельних розведень, як контрольний використовували г!брид F1 в!д схрещування в!дпов!дних сорт!в 'Barke' та 'Danuta' (розчин № 12). Сп!вв!дношення алел!в у г!брид! першо-го покол!ння становить 1 : 1, тому сп!вв!дно-шення п!к!в г!брида F1 мало в!дпов!дати сп!в-в!дношенню п!к!в сум!ш! № 6 (50 % : 50 %).
Висота п!ка (UF) св!дчить про !нтенсив-н!сть флуоресцентного сигналу, що в свою чергу св!дчить про к!льк!сть специф!чно'1 ДНК у початковому зразку. Дан! про висоту п!к!в та 1х сп!вв!дношення, як! отримали в
58
СОРТОВИВЧЕННЯ тл охорона прлв нл сорти рослин, 2016, № 4 (33)
à)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
100
112 n.H.
f
110
122 n.H. 120
130
6)
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
_^-aaâJL__
100 110 120 130
: A. 4. „aaL ..
100
110
120
130
â)
t)
Pmc. 2. EëeKTpo$operpaMa npoflyKiÏB aMnëiôiKauiï
ëOKycy Bmac 0127 3 MaTpMHHoro flHK copTiâ 'Danuta' Ta 'Barke' y cniBBiflHorneHHnx: a) 20% : 80%, 6) 50% : 50%, s) 80% : 20%, z) 90% : 10%.
xofli eKcnepHMeHTy, HaBe^eHO b Ta6ëHn;i 2. hk BHflHO 3 pncyHKa 2 i TaôëH^ 2, BHcoTa niêiâ Ôëyopec^H^ï y riSpn^a Ta b cyMimi 50 % : 50 % He Syëa o^HaKOBoro flëa oSox aëeëiâ, aêi flocëiflœyBaëH. Цe MoœHa noacHHTH cпeцн-Ôi^HicTro nËP flëa pi3HHx aëeëiâ. ToMy flëa noflaëtmnx poçpaxyHêiâ SyB BBefleHHË Koeôi-цieнт ^o^p^S^rai, ùo poçpaxoByBaBca aK
BiflHomeHHa noKaçHHêiâ ô^yopec^H^ï flëa oSox aëeëiâ (122 n.H. Ta 112 n.H.) (poç^HH № 12): 562 UF/714 UF = 0,787.
TaKHM îhhom, Koeô^ieHT ^o^p^n^cm
cTaHoBHB 0,79. ÂHKopHcToByro^H 3Ha^eHHa iHTeHcHBHocTi пiкiв ô^yopec^H^ï b cyMimi № 6 (50 % : 50 %), oTpHMaëH flyœe 6ëH3tKe 3Ha^eHHa Koeô^ieHTa ^o^p^é^crt, aK i o^iêyBaëoca: 754 UF/962 UF = 0,783.
0,01
0,1
10
100
CniBBÏflHomeHHfl bmcotm nÎKÎB ô-nyope^eH^ï 3 ypaxyBaHHAM Koeôi^eHTa nponop^MHocri
PMC. 3. 3aëeœHicTb cniBBiflHoweHHfl BMCOTM niêiB ÔëyopecueHuiï 3 ypaxyBaHHAM nponopuiMHocri
(ropwçoHTaëbHa ëorapMÔMiHHa Bicb) bi'a KiëbêicHoro cniBBiflHorneHHfl aëeëiâ y MaTpuHHié flHK (BepTMKaëbHa Bicb)
Ta6nuu,n 2
ÏepeëiK npwroToBëeHMx cyMiweé AHK flBox copTiâ 'Danuta' Ta 'Barke' 3i 3HaneHHflMM bmcotm niKiâ ôëyopecueHuiï
ça MapKepoM Bmac 0127
CyMirn BMicT flHK copTy 'Danuta', (%) BMicT flHK CopTy 'Barke', (%) BècoTa niêy Ô-nyope^eH^ï anena 122 n.H., UF BècoTa niêy Ô-nyope^eH^ï anena 112 n.H., UF CniBBiflHoweHHfl bmcotm niKiâ ô-nyope^eH^ï (anenb 122 n.H./ anenb 112 n.H. CniBBiflHoweHHfl bmcotm niêiB ô-nyope^eH^'ï 3 ypaxyBaHHAM Koeôi^ieHTa nponop^MHocTi
1 99 1 843 _ * - -
2 98 2 1190 54 22,04 28,00
3 95 5 1356 114 11,89 15,11
4 90 10 179 - - -
5 80 20 1310 514 2,55 3,24
6 50 50 754 962 0,78 1,00
7 20 80 340 1693 0,20 0,26
8 10 90 179 1812 0,10 0,13
9 5 95 68 1440 0,05 0,06
10 2 98 78 2126 0,04 0,05
11 1 99 83 2771 0,03 0,04
12 TiôpMfl F. 562 714 0,79 1,00
13 97 3 1273 74 17,20 21,86
14 15 85 284 2058 0,14 0,18
* niê He fleTeKTyBaBCA.
ISSN 2518-1017 Plant Varieties Studying and Protection, 2016, No 4 (33) 59
Pocлuннuцmвo
Ha pиcyнкy З пoкaзaнo зaлeжнicть кшь-кicнoгo вмicтy aлeлiв y мaтpичнiй ДHK ^ep-тикaльнa вгсь) вiд cпiввiднoшeння виcoти пiкiв флyopecцeнцiï з ypaxyвaнням кoeфiцi-eнтa пpoпopцiйнocтi (гopизoнтaльнa вicь). Гopизoнтaльнa вicь являе coбoю лoгapиф-мiчнy шкaлy. ^й пpийoм гpaфiчнoгo в^д^б-paжeння peзyльтaтiв oбpaнo чepeз йoгo зpyч-шсть пiд чac poбoти з дaними, щo мaють шиpoкий дiaпaзoн вapiювaння.
Плaвнicть гpaфiкa дoдaткoвo cвiдчить ^o aдeквaтнi yмoви пocтaнoвки eкcпepимeнтy тa eфeктивнicть aмплiфiкaцiï aлeлiв нeзa-лeжнo вiд кiлькicнoгo вмicтy з poздiльнoю здaтнicтю 1%. Toмy викopиcтaння cпocoбy визнaчeння вмicтy дoмiшoк cтopoнньoï ДHK y пpoбi, видiлeнoï iз cyкyпнocтi зepнiвoк, зa cпiввiднoшeнням пiкiв типoвиx тa нeтипo-виx aлeлiв ^ia; ввaжaти eфeктивним.
У poбoтi [1б] пoкaзaнo, як oтpимaнe в eêc-пepимeнтi cпiввiднoшeння кiлькocтi ДHK для двox aлeлiв - R (ratio) мoжнa викopиc-тaти для poзpaxyнкy чacтoти кoжнoгo з aлe-лiв p тa q, a тaкoж пoкaзникiв copтoвoï чте-тoти тa гiбpиднocтi. Для цьoгo пoтpiбнo зa-cтocoвyвaти фopмyли:
R = p/q (1)
q = 1 - p (2)
R
зв^и p = --(З)
1 + R
Copmoea чистота = p x 1DD% (4)
Пбридтстъ = (3-3p) x 1DD%. (б)
Зacтocoвaний мeтoд визнaчeння cпiввiднo-шбння кiлькocтi вiдпoвiдниx фpaгмeнтiв ДHK y пoчaткoвoмy зpaзкy мoжнa ввaжaти ycпiшним, якщй вoнo бyдe y пoвнiй вiдпo-вiднocтi зi cпiввiднoшeнням виcoти тк.в флyopecцeнцiï для двox aлeлiв.
Для пepeвipки тoчнocтi aнaлiзy дoдaткoвo пpигoтyвaли двi тecтoвi cyмiшi - M 1З i M 14 iз вмятом ДHK aлeлiв 122 п.н. тa 112 п.н. y K^Ko^i 9Т% : З% тa 1б% : S6% вiдпoвiд-нo. З^дго з тaблицeю 2 cпiввiднoшeння ви-coти пiкiв флyopecцeнцiï з ypaxyвaнням Koe-фiцieнтa пpoпopцiйнocтi для двox cyмiшeй дopiвнюe 21,S6 тa 0,1S. Пiдcтaвляючи цi
знaчeння y фopмyли (З) тa (4), oтpимyeмo знaчeння copтoвoï чиcтoти 9б% тa 1б% ввд-пoвiднo, щo е дyжe близьким дo знaчeнь кoнцeнтpaцiй y пpигoтoвлeниx cyмiшax.
Зa peзyльтaтaми aнaлiзy cyмiшeй M 2, 10, 11 iз вмicтoм дoмiшки 1-2% вiдпoвiднi пiки дeтeктyвaлиcя з oчiкyвaними знaчeннями iнтeнcивнocтi флyopecцeнцiï (тaбл. 2). Öe oзнaчae, щo цeй мeтoд е дocить чутливим, дae змoгy в oднiй cyкyпнiй пpoбi aнaлiзyвa-ти дo 100 нaciнин тa oтpимyвaти знaчeння copтoвoï чиcтoти з тoчнicтю 1-2%.
Пoкaзaнa пpинципoвa мoжливicть здiйcнeн-ня кiлькicнoгo aнaлiзy зa SSR-мapкepaми мae peaлiзyвaтиcя тaким чинoм: cтвopeння cиcтeми ДHK мapкepiв з виcoкoю iдeнтифi-кaцiйнoю здaтнicтю, eмпipичнe визнaчeння eфeктивнocтi romprai aмплiфiкaцiï лoкyciв, пpoвeдeння aнaлiзy з ypaxyвaнням eфeктив-rocn romprai' aмплiфiкaцiï. Для бiльшocтi ciльcькoгocпoдapcькиx кyльтyp poзpoблeнo cиcтeми мiкpocaтeлiтниx мapкepiв тa пpoвe-дeнo вивчeння пoлiмopфiзмy copтiв зa цими cиcтeмaми. З викopиcтaнням кiлькicнoгo aнaлiзy цi cиcтeми мoжyть бути aдaптoвaнi для визнaчeння ocнoвниx пoкaзникiв copTO-виx якocтeй пapтiй нaciння - типoвicть лшш тa copтoвa чиcтoтa, гiбpиднicть rnp^rn mcrn-ня, a тaкoж piвeнь cтepильнocтi зa нaявнocтi мiкpocaтeлiтниx лoкyciв, зчeплeниx iз гeнoм зaкpiплeння-вiднoвлeння. ^зитивним мo-мeнтoм зa тaкoгo типу aнaлiзy е мoжливicть пpoвeдeння мyльтиплeкcнoï ПЛP.
Kiлькicний aнaлiз зa SSR-мapкepaми мoж-нa пpoвoдити шляxoм пocлiдoвнoгo визнaчeн-ня: cпoчaткy якicнoгo cклaдy aлeлiв мapкepiв в oднiй pea^ii', a пoтiм cпiввiднoшeння тiль-ки rax aлeлiв, якi виявили пoлiмopфiзм пiд чac пepшoï peaкцiï. Bнacлiдoк зacтocyвaння тaкoï пocлiдoвнocтi aнaлiзy тльмсть peaкцiй мoжe бути змeншeнoю дo двox. Haпpиклaд, y paзi викopиcтaннi SNP aбo SSR-мapкepiв пpo-вoдитьcя пepшa мyльтиплeкcнa пoлiмepaзнa лaнцюгoвa peaкцiя, в якiй визнaчaeтьcя якic-ний ^лад aлeлiв. Ha дpyгoмy eтaпi oбиpaeть-cя oдин з мapкepiв, щo виявивcя пoлiмopф-ним, пpoвoдитьcя ПЛP тa визнaчaeтьcя кiль-
Taблuця 3
Пop1вняння к1лькocт1 нeoбx1дниx aнaл1з1в у paз1 зacтocувaння тpaдиц1Иниx мeтoд1в визнaчeння copтoвиx якocтeИ пapт1И нac1ння тa зaпpoпoнoвaнoгo мeтoду
^oci^ визнaчeння Heoбxiднa кiлькicть aнaлiзiв для виявлeння 1% дoмiшoк
Eлeктpoфopeз зaпacниx би'лки'в 100
Eлeктpoфopeз пpoдyктiв aмплiфiкaцiï ДHК-мapкepiв 100 x мльккть мapкepiв
Meтoд визнaчeння кiлькicнoгo cпiввiднoшeння aлeлiв мiкpocaтeлiтниx мapкepiв y зpaзкy ДНК Eтaпи здiйcнeння: 1) 1 мyльтиплeкcнa peaкцiя для визнaчeння якicнoгo cклaдy aлeлiв y зpaзкy, 2) 1 aбo 2 peaкцiï зa пoлiмopфними мapкepaми, виявлeними y пepшiй peaкцiï. 3a нeoбxiднocтi peaкцiю мoжнa викoнaти y 2-3-x пoвтopax
6q
СОРТОВИВЧЕННЯ тл охоронл ПРЛВ нл СОРТИ рослин, 2Q16, № 4 (33)
KicHe сшвввдношення алел1в. Для збхльшення точност1 можливим е Bapiam кiлькicного ана-ëiçy двох полiмоpфниx MapKepiB. У тaблицi 3 наведено поpiвняння кiлькоcтi необх1дних aнaлiзiв шд час застосування тpaдицiйниx ме-тод1в та зaпpопоновaного методу.
Висновки
Peaлiзaцiя методу визначення cоpтовиx якостей naprié нaciння на оcновi встановлен-ня к1льшеного cпiввiдношeння aлeлiв ДНК-мapкepiв дае змогу icтотно cкоpотити кшь-кicть ПЛР, що значно пpишвидшye та зде-шевлюе aнaлiз cоpтовиx покaзникiв якоcтi пapтiй нaciння. 1ншими пepeвaгaми за^опо-нованого методу е те, що кiлькicть локyciв, за якими буде пpоводитиcь aнaлiз, можна значно збiльшити; за необхвдносп, тест-система включала локуси, piвномipно pозподiлeнi по геному pоcлин; обсяг вибipки також може бути значно збшьшений поpiвняно з тpaди-цiйними методами i обмежуеться тiльки pоз-подшьною здaтнicтю методу визначення кшь-ксного вмicтy aлeлiв у cyмiшi ДНК. Все це значно шдвищуе доcтовipнicть aнaлiзy.
На цьому eтaпi pозpоблeння методу щоде-монcтpовaно пpинциповy можливють pозpaxy-вати вмicт певно'1 ДНК у модельнш сумттп зi 100 нaciнин з точнicтю до 1-2%. Такий метод визначення кiлькicного вмсту ДНК у зpaзкy за допомогою SSR-мapкepiв доцiльно викоpиc-товувати у cyмiшax, де пpeдcтaвлeно ДНК-фpaгмeнти двоx фiкcовaниx SSR-aлeлiв, на-щиклад для визначення гiбpидноcтi. Для визначення cоpтовоï чистоти або типовоста пapтiй нaciння, де cпeктp алел:1в може бути шиpшим, метод потpeбye додаткового доопpaцювaння.
Використана литература
1. Леонова И. Н. Молекулярные маркеры: использование в селекции зерновых культур для идентификации, интрогрессии и пирамидирования генов / И. Н. Леонова // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2013. - Том 17, № 2. - С. 314-325.
2. SivoLap Yu. M. Molecular markers and plant breeding / Yu. M. Sivolap // Cytol Genet. - 2013. - Vol. 47, Iss. 3. - P. 188-195. doi: 10.3103/S0095452713030080
3. Plant Molecular Breeding / H. J. Newbury (ed.). - Birmingham, UK : Blackwell Publ., CRC Press, 2003. - 265 p.
4. Rafalski A. Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics / A. Rafalski // Curr Opin Plant Biol. - 2002. - Vol. 5, Iss. 2. -P. 94-100. http://dx.doi.org/10.1016/S1369-5266(02)00240-6
5. Becker J. Barley microsatellites: allele variation and mapping / J. Becker, M. Heun // Plant Mol. Biol. - 1995. - Vol. 27, Iss. 4. -P. 835-845. doi: 10.1007/BF00020238
6. Edwards D. Plant genome sequencing: applications for crop improvement / D. Edwards, J. Batley // Plant Biotechnol J. - 2010. -Vol. 8, Iss. 1. - P. 2-9. doi: 10.1111/j.1467-7652.2009.00459.x
7. Gut I. G. Automation in genotyping of single nucleotide polymorphisms / I. G. Gut // Hum Mutat. - 2001. - Vol. 17, Iss. 6. - P. 475-492. doi: 10.1002/humu.1131
8. Созинов А. А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / А. А. Созинов. - М. : Наука, 1985. - 272 с.
9. Анисимова И. Н. Идентификация сортов, линий и гибридов по составу полипептидов гелиантина / И. Н. Анисимова // Сб. науч. трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции.
- 1987. - Т. 114. - С. 114-126
10. Сиволап Ю. М. ДНК-технологп в реестрацп й охорон прав на сорти рослин / Ю. М. Сиволап, Н. Е. Кожухова // Сорто-вивчення та охорона прав на сорти рослин. - 2005. - № 1. -С. 66-74. doi: 10.21498/2518-1017.1.2005.66849
11. Рибалка 0. I. Генетична гетерогент'сть сорт'в пшениц' одесько'1 селекцп за алельним складом GLI/GLU локус'в / 0. I. Рибалка, М. В. Червот'с, М. А. Литвиненко // Вкник аграрно'1 науки. - 2008. - № 2 . - С. 54-59.
12. Диференц'ац'я, пдентифшац'я, визначення типовосп та пбрид-носп ст'льськогосподарських культур за ДНК-профтлюванням : методичт рекомендац''' / М. С. Бальв1'нська, Н. Е. Волкова, 0. 0. Колесник [та тн.]. - Одеса : Астропринт, 2015. - 40 с.
13. Генетическая чистота семян - актуальный вопрос современной генетики и селекции растений / Г. Е. Акинина, Ю. Н. Тереняк, Я. Ю. Шарыпина, В. Н. Попов // Фактори експери-ментально'' еволюцн оргат'зм1'в : зб. наук. пр. - К. : УТПС, 2016. - Т. 18. - С. 56-60.
14. McPherson M. J. PCR / M. J. McPherson, S. G. Moller. - 2nd ed. -New York : Taylor & Francis Group, 2006. - P. 209-232.
15. Cheap, accurate and rapid allele frequency estimation of single nucleotide polymorphisms by primer extension and DHPLC in DNA pools / B. Hoogendoorn, N. Norton, G. Kirov [et al.] // Hum Genet. - 2000. - Vol. 107, Iss. 5. - P. 488-493.
16. Пар1'й М.Ф. Спос'б визначення сортово'' чистоти та типовосп парт'й нас'ння ст'льськогосподарських культур з викорис-танням ДНК-маркер1'в / Партй М. Ф., Вдовиченко Ж. В., Спиридонов В. Г. // Патент Укра''ни на винах'д 56555, МПК7 А 01Н 1/04. - № u 2007 11049 ; Заявлено 08.10.2007 ; Опублъ ковано 25.01.2011, Бюл. № 7. 2011.
17. A simple sequence repeat-based linkage map of barley / L. Ramsay , M. Macaulaya, S. degli Ivanissewch [et al.] // Genetics. - 2000. - Vol. 156, No. 4. - Р. 1997-2005.
18. A rapid and simple method for small scale DNA extraction in Agavaceae and other tropical plants / M. Keb-Llanes, G. Gonzalez, B. Chi-Manzanero, D. Infante // Plant Mol. Biol. Rep. -2002. - Vol. 20, No. 3. - P. 299a-299e.
References
1. Leonova, I. N. (2013). Molecular markers: implementation in crop plant breeding for identification, introgression, and gene pyramiding. Vavilovskij Zurnal Genetiki i Selekcii [Vavilov Journal of Genetics and Breeding], 17(2), 314-325. [in Russian]
2. Sivolap, Yu. M. (2013). Molecular markers and plant breeding. Cytol Genet., 47(3), 188-195. doi: 10.3103/S0095452713030080
3. Newbury, H. J. (Ed.). (2003). Plant Molecular Breeding. Birmingham, UK: Blackwell Publ., CRC Press.
4. Rafalski, A. (2002). Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics. Curr Opin Plant Biol., 5(2), 94-100. doi: 10.1016/S1369-5266(02)00240-6
5. Becker, J., & Heun, M. (1995). Barley microsatellites: allele variation and mapping. Plant Mol. Biol., 27(4), 835-845. doi: 10.1007/BF00020238
6. Edwards, D., & Batley, J. (2010). Plant genome sequencing: applications for crop improvement. Plant Biotechnol J., 8(1), 2-9. doi: 10.1111/j.1467- 7652.2009.00459.x
7. Gut, I. G. (2001). Automation in genotyping of single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat., 17(6),475-492. doi: 10.1002/humu.1131
8. Sozinov, A. A. (1985). Polimorfizm belkov i ego znachenie v genetike iselektsii [Polymorfism of proteins and its importance in genetics and breeding]. Moscow: Nauka. [in Russian]
9. Anisimova, I. N. (1987). Identification of varieties, lines and hybrids for the composition of helianthine polypeptides. Sbornik nauchnych trudov po prikladnoy botanike, genetike i selektsii [Proceedings on Applied Botany, Genetics and Breeding], 114, 114-126. [in Russian]
ISSN 2518-1017 РЬЛШТ VARIETIES STUDYING ftND PROTECTION, 2016, No 4 (33)
61
Рослинництво
10. Syvolap, Yu. M., & Kozhukhova, N. E. (2005). DNA techniques in the registration and protection of plant varieties rights. Sortovivcenna ohor. prav sorti roslin [Plant Varieties Studying and Protection], 1, 66-74. doi: 10.21498/25181017.1.2005.66849. [in Ukrainian]
11. Rybalka, 0. I., Chervonis, M. V., & Lytvynenko, M. A. (2008). Genetic heterogeneity of wheat varieties developed in Odesa for allelic composition of GLI/GLU loci. Visnyk ahrarnoi nauky [Bulletin of Agricultural Science], 2, 54-59. [in Ukrainian]
12. Balvinska, M. S., Volkova, N. E., Kolesnyk, 0. 0., Solodenko, A. Ye., & Chebotar, S. V. (2015). Dyferentsiatsiia, identyfikatsiia, vyznachennia typovosti ta hibrydnosti silskohospodarskykh kultur za DNK-profiliuvanniam [Differentiation, identification, determination of typicality and hybridity of cultivated crops for DNA profiling]. Odesa: Astroprynt. [in Ukrainian]
13. Akinina, G. E., Terenyak, Yu. N., Sharypina, Ya. Yu., & Popov V. N. (2016). Genetic purity of seeds - actual question of modern genetics and plant breeding. Fakt. eksp. evol. org. [Factors in experimental evolution of organisms], 18, 56-60. [in Russian]
14. McPherson, M. J., & Moller, S. G. (2006). PCR (pp. 209-232). (2nd ed.). New York: Taylor & Francis Group.
15. Hoogendoorn, B., Norton, N., Kirov, G., Williams, N, Hamshere, M. L., Spurlock, G., ... O'Donovan, M. C. (2000). Cheap, accurate and rapid allele frequency estimation of single nucleotide polymorphisms by primer extension and DHPLC in DNA pools. Hum Genet., 107(5), 488-493.
16. Parii, M. F., Vdovychenko, Zh. V., & Spyrydonov, V. H. (2011). Method for determining varietal purity and typicalness of lots of seed of farm crops using dna-markers. Ukraine patent for invention, MI1K7 A 01H 1/04. - No. u 2007 11049. [in Ukrainian].
17. Ramsay, L., Macaulaya, M., degli Ivanissevich, S., MacLean, K., Cardle, L., Fuller, J., ... Waugh, R. (2000). A simple sequence repeat-based linkage map of barley. Genetics, 156(4), 1997-2005.
18. Keb-Llanes, M., Gonzales, G., Chi-Manzanero, B., & Infante, D. (2002). A rapid and simple method for small scale DNA extraction in Agavaceae and other tropical plants. Plant Mol. Biol. Rep., 20(3), 299a-299e.
УДК 577.21+631.522/.524
Вдовиченко Ж. В., Спиридонов В. Г., Хомутовская С. В., Парий М. Ф.* Метод определения сортовой чистоты (типичности), гибридности, стерильности партий семян на основе установления количественного соотношения аллелей ДНК-маркеров // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. - 2016. - № 4. -С. 56-62. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).2016.88678
Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, ул. Героев Обороны, 15, г. Киев, Украина, 03041, "e-mail: [email protected]
Цель. Разработать принципиально новый метод определения сортовой чистоты (типичности), гибридности, стерильности партий семян. Методы молекулярной биологии (экстракция геномной ДНК, ПЦР с применением SSR-маркеров, капиллярный электрофорез), генетический и статистически-математический анализ. Результаты. Разработан новый метод определения сортовых качеств партий семян, состоящий из следующих этапов: одновременное выделение ДНК из репрезентативной совокупности семян оцениваемого образца; ПЦР и дальнейший анализ продуктов амплификации путем определения качественного и количественного состава аллелей маркерных SSR-последовательностей; расчет сортовых показателей
качества партии семян с использованием экспериментально полученных соотношений аллелей. Выводы. Разработанный метод определения сортовых качеств партий семян позволяет значительно сократить расход материалов, времени и труда при выполнении анализа. Последовательное качественное и количественное определение аллелей в совокупном образце партии семян является принципиально новым подходом для установления сортовой чистоты (типичности), гибридности, стерильности.
Ключевые слова: сортовая чистота, типичность, гибридность, стерильность, ДНК-маркеры, SSR-маркеры, контроль качества партии семян, ячмень.
UDC 577.21 + 631,522 / .524
Vdovychenko, Zh. V., Spyrydonov, V. H., Khomutovska, S. V., & Parii, M. F.* (2016). Method for determination of varietal purity (typicality), hybridity, sterility of seed lots based on the establishment of the quantitative ratio of alleles of DNA markers. Sortovivcenna ohor. prav sorti roslin [Plant Varieties Studying and Protection], 4, 56-62. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).2016.88678
National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, 15 Heroiv Oborony Str., Kyiv, Ukraine, 03041, *e-mail: [email protected]
Purpose. To develop a conceptually new method for determination of varietal purity (typicality), hybridity, sterility of seed lots. Methods of molecular biology (genomic DNA extraction, PCR with SSR markers application, capillary electrophoresis), genetic, statistical, mathematical analysis. Results. New method for determining the varietal qualities of seed lot was developed that consists of the following steps: simultaneous DNA extraction from a representative sample of aggregated seeds; PCR and further analysis of the amplification products by determination of the qualitative and quantitative composition of SSR-markers' alleles; cal-
culation of values of varietal seed lot quality using experimentally derived allele ratios. Conclusions. The developed method for determining varietal qualities of seed lots allows to reduce significantly the consumption of materials, time and labor during the analysis. Consistent qualification and quantification of alleles in the total sample of a seed lot is a conceptually new approach to establish varietal purity (typicality), hybridity, sterility.
Keywords: varietal purity, typicality, hybridity, sterility, DNA markers, SSR markers, quality control of seed lots, barley.
Hadiuuina 18.10.2016
62
СОРТОВИВЧЕННЯ ТА ОХОРОНА ПРЯВ Hfl СОРТИ РОСЛИН, 2016, № 4 (33)
