CC BY
47УДК 602.6:633.34 http://dx.doi.Org/10.21498/2518-1017.13.3.2017.110709
Використання SSR-MapKepie для диференф'ацн нових сорлв col (Glycine max (L.) Merr.)
Л. M. Присяжнюк*, С. I. Мельник, Ю. В. Шилкова, I. 0. С'галова, А. П. 1ваницька
Укртнський институт експертизи copmie рослин, вул. Генерала Родимцева, 15, м. Kuis, 03041, Укра1на, *e-mail: prysiazhniuk_l@ukr.net
Мета. Достдити молекулярно-генетичний пол1'морф1'зм нових сорп'в co'i за допомогою SSR-MapKepiß (simple sequence repeat) щодо можливосп застосування його для експертизи сорлв рослин на вщм^нкть, oднopiднicть та стаб^ьт'сть. Методи. Молекулярно-генетичний анал1'з нуклеТнових кислот, кластерний анал1'з. Результати. Наведено результати достджень молекулярно-генетичного пол1'морф1'зму 25 сорлв со!' за м1'кросател1'тними маркерами з використанням пол1'меразно'1 ланцюговоТ реакцп'Т. Анал1'з продукт1'в ампл1'ф1'кац1'1 св1'дчить, що за вс'ма досл1'джуваними SSR-маркерами внутршньосортовий пол1морФ1зм cпocтepiгавcя в сорту 'Алжда', за локусами Satt 228 та Satt 726 - у сорту 'Арнка', за локусами Satt 063 та Satt 726 - у сорту 'Фурю', який було враховано в подальших достдженнях деяких генотитв. ГИд час оц'нки пол1морФ1зму достджуваних сорлв визначено, що частоти ^ентифкованих алeлiв були в межах в1д 0,02 до 0,1 залежно в1д мiкpocатeлiтнoгo локусу. За допомогою кластерного анал!зу визначено гeнeтичнi дистанцИ м1ж сортами. Biдcтань м1ж б^ьшктю сорлв, зокрема в 59 випадках, становила 3,61, 3,16 та 2,83, ц1 значення генетичних дистанц'й були найпоширеншими в дослщжуват'й ви61рц1 сорлв. Висновки. Анал!з молекулярно-генетичного пол1морФ1зму свщчить, що серед 25 дослщжуваних сорлв найб^ьш пол1морФними були 10, що необхщно враховувати тд час Тх подальшо'Т iдeнтифiкацiТ. Визначено, що iдeнтифiкoванi алел! р!вном!рно пpeдcтавлeнi у ви61рц1 дослщжуваних сорлв соТ, про що свщчить високий iндeкc пол1морФносл локусу (0,83-0,94). Пд час оц'нки генетичних дистанц'й м1ж сортами було встановлено, що найбтш схожими за локусами виявилися сорти, генетичт дистанцИ' м1ж якими становили 2,00, в1дм1нними - 3,87. Таким чином, маркерна система, яка складаеться з чотирьох мжросателпних локус'в - Satt 063, Satt 114, Satt 228 та Satt 726, е ефективною для визначення вщмжносл м1ж дocлiджуваними сортами соТ.
Нлючов! слова: молекулярно-генетичний пол1'морф1'зм, маркерна система, генетичт дистанцп, мiкpocаmелimнi локуси.
Вступ
Щороку в усьому CBiTi в селекцшш про-грами ибридизаци со! (Glycine max (L.) Merr.) залучають тисячi лiнiй та сотнi елгт-них соpтiв [1-5]. У процес селекцй новi й полiпшенi сорти можуть бути посиленi нови-ми джерелами генетичних pесуpсiв. Тому критери добору селекцiйного мaтеpiaлу та сорив за умови ix реестраци потpiбно роз-глядати не лише за aгpономiчною цiннiстю, а й з позици ¿хнього генетичного piзномaнiт-тя [6-8]. Сортове piзномaнiття соpтiв зазви-чай оцiнюють за маркерними морфолоични-ми ознаками. Соя, поpiвняно з багатьма видами сльськогосподарських рослин, мае
Larysa Prysiazhniuk
http://orcid.org/0000-0003-4388-0485 Serhii Melnyk
http://orcid.org/0000-0002-5514-5819 Yuliia Shytikova
http://orcid.org/0000-0002-1403-694X Iryna Sihalova
http://orcid.org/0000-0001-7736-6121 Alla Ivanitskaya
http://orcid.org/0000-0003-3987-4728
ввдносно низький piвень генетично! вapia-бельностi [9-11]. Тому розроблення пiдxодiв до дифеpенцiaцГi' та iдентифiкaцГi' сорив ще! культури е актуальним для генетико-селек-цiйниx дослiджень i захисту авторських прав.
Добору ефективно! системи диференщаци присвячено багато pобiт учених науково-до-слiдниx установ в Укра!ш та за кордоном, за результатами яких у со'! виявлено високий piвень полiмоpфiзму за мшросателгтними локусами (SSR) [12-15]. Такий шдхвд забез-печуе пiдвищення ефективностi експертизи соpтiв, осшльки результати ще! експертизи тiсно пов'язаш з проблемами об'ективно! оцiнки сортового мaтеpiaлу [16-18].
Мета дослгджень - дослвдити молекуляр-но-генетичний полiмоpфiзм нових сорив со! за допомогою SSR-мapкеpiв (simple sequence repeat) щодо можливосп застосування його для експертизи сорив рослин на ввдмшшсть, одноpiднiсть та стабшьшсть.
Материали та методика досл1*джень
Maтеpiaлом для дослiдження були 25 сорив со! культурно! украшсько! та шоземно! селекцй': 'Aбелiнa', 'Алшда', 'Apнiкa', 'Бер-
кана', 'ДХ 530', 'Кано', 'Гебо', 'М1лешум', 'ДХ 618', 'Монарх', 'ОАЦ Калшсо', 'ОАЦ Лейкв'ю', 'ОАЦ Медок', 'Перлина', 'Норанда', 'Фурю', 'Карра', 'Аляска', 'ПР 1309004', 'Api-са', 'Нордша', 'Амадеус', 'Сг Айдер', 'Сг ср Ш-кор', 'Асука'. Bибipка для дослвджень включала по 30 генотишв кожного сорту. Для ви-дiлення ДНК з насiнини застосували катюн-ний детергент ЦТАБ (цетилтриметиламонш бpомiд), дворазове очищення сумiшшю хло-pофоpм-iзоамiловий спирт та розчином ета-нолу [19-20].
Молекулярно-генетичний полiмоpфiзм сорив со! дослiджували за допомогою ПЛР (по-лiмеpазноi' ланцюгово! реакцп) зi сжциф:ч-ними праймерами за чотирма мшросателгг-ними локусами (МС-локуси) - Satt 114, Satt 228, Satt 726, Satt 063 (табл. 1), ям були обрат на основi аналiзу ¿хнього шдек-су полiмоpфностi у дослiдженнях минулих рошв [12].
ПЛР проводили на амплiфiкатоpi TC-Y CreaCon (USA). Реакцiйна сумш мiстила 100 нг сумарно! рослинно! ДНК, сольовий буфер (10 мМ Tris-HCl, pH 9,0; 50 мМ KCl; 0,01% Triton Х-100), 1,5-2,5 мМ MgCl2; по 200 мкМ дезоксинуклеотидтpифосфатiв (дНТФ), по 0,2-0,5 мкМ кожного з прайме-piв та одну одиницю Taq-полiмеpази. Загаль-ний об'ем сумiшi становив 20 мкл.
Для кожно! пари пpаймеpiв застосовували так1 темпеpатуpно-часовi параметри ПЛР: крок 1 (початкова денатуращя) 94 °С - 2-3 хв; крок 2 (напрацювання специфiчних продук-тiв реакцп): денатуpацiя 93 °С - 30 с; габри-дизацiя пpаймеpiв 50-55 °С - 60 с; елонгащя 72 °С - 60 с; юлькгёть циклiв - 35; крок 3 (кшцева елонгацiя) 72 °С - 3 хв.
Продукти реакцп амплiфiкацii вiзуалiзу-вали методом електрофорезу в 2% агарозно-му гелi у 0,5 X ТБЕ (тpiс-боpатний буферний розчин) за загальноприйнятою методикою з бромистим етидieм [19]. Електрофорез проводили протягом 1,5 год за напруженосп електричного поля 5 B/см.
Результати електрофоретичного розподшу пpодуктiв ПЛР визначали в ультрафюлето-вому свiтлi та фiксували за допомогою систе-ми документування гелiв, що складаеться з тpансiлюмiнатоpа та вiдеосистеми з цифровою камерою. Розмip отриманих амшлшо-нiв визначали вiдносно маркера молекуляр-но! маси з використанням комп'ютерно! про-грами TotalLab v2.01.
Для характеристики генетично! структури досл1джуваних соpтiв со! розраховували часто-ти детектованих алелiв за кожною парою прай-меpiв. З метою оцшки ступеня вдентифшовано! мiнливостi в популяцп та здатностi маркера визначати piзницю мiж генотипами розраховували PIC (polymorphism information content) -щдекс пол:1морфност1 локусу за формулою:
PIC = 1 -
, Р2
де pu - частота ¿-того алеля для l локусу [20].
Здатшсть маркерно! системи з чотирьох мшросателиних локуив диференщювати до-слвджеш сорти оцшювали на основ! кластерного анал1зу з використанням програми STATISTICA 12. Сорти групували за допомогою незваженого методу середшх зв'язшв [21-23].
Результати досл1*джень
Для дослвдження молекулярно-генетично-го пол1морф1зму сорив со! проанал1зовано чо-тири мшросателггш. локуси Satt 726, Satt 063, Satt 114 i Satt 228.
Виб1рка в межах кожного дослвдженого сорту складалася з тридцяти шдиввдуальних зразк!в ДНК, як! об'еднували в сумш! по шгсть у кожнш, що становило п'ять сумшей ДНК для кожного сорту, та проводили ПЛР.
На рисунку 1 представлено отримаш непо-л!морфш алел! для сорив со! 'ОАЦ Медок' та 'ОАЦ Калшсо' за локусом Satt 063, тобто ге-нотипи в сум!ш! в яких не виявлено пол! морф!зму за локусом Satt 063, мають у своему склад! алель одного розм!ру.
Характеристика праймер!*в SSR-локусiв coi
Таблиця 1
li
Ha3Ba npaMMepa Нуклеотидна посл1'довт'сть праймер1'в 5'.......3' CG-склад, % Температура пбридизацпт, °C Очшуваний розм1'р ампл1'кон1'в, п. н.
Satt 726 - F* Satt 726 - R** gcgTTTTTAgTATggATAATgTTTT qcqAAqqqAcAAqAqTqAT 21,7 52,6 50 170-280
Satt 063 - F Satt 063 - R AAATgATTAAcAATgTTTATgAT ACTTacATcAaTTAATAAcAA 17,4 28,6 50 95-210
Satt 114 - F Satt 114 - R gggTTATccTccccAATA ATATqqqATqATAAqqTqAAA 50,0 33,3 55 75-130
Satt 228 - F Satt 228 - R TcATAAcgTAAgAgATggTAAAAcT cATTATAAgAAAAcgTgcTAAAgAg 32,0 32,0 50 200-270
*F - прямий праймер; **R - зворотний праймер.
270 СОРТОВИВЧЕННЯ та охоронл ПРАВ на сорти рослин, 2017, Т. 13, №3
100 п.н.->
2____
167 п.н. <- 140 п.н.
М
1
2 3 4
5
6
7
8 9
10
Рис. 1. Електрофоретичний розпод1'л алелей МС-локуса Satt 063 для сорп'в со! 'ОАЦ Медок' та 'ОАЦ Кал1*псо' у сум1шт ДНК шести генотит'в:
М - маркер молекулярноТ маси Thermo Scientific O'RangeRuler 20 bp DNA Ladder; 1-5 - продукти ампл1ф1кац11 ДНК сум1Ш1 шести генотит'в сорту соТ 'ОАЦ Медок'; 6-10 - продукти амплтфткацпТ ДНК сумш1 шести генотитв сорту соТ 'ОАЦ Кал1псо'
У pa3i виявлення пол1морф1зму всередиш cyMimi для встановлення алельного стану локусу проводили ПЛР кожного зразка, що входив до 11 складу. Електрофоретичш спект-ри алелей, iдентифiковaних для сорту со! 'ПР1309004' за МС-локусом Satt 114 наведено на рисунку 2а.
За результатами aнaлiзy деяких генотитв сорту 'ПР1309004' отримано електрофоретичний розпод1л, який в1дображае алельний склад МС-локусв генотипiв, що входять до cyмiшi п1д номерами 1 та 2. Результати aнaлiзy шди-в1дуальних зразшв сорту 'ПР1309004' за МС-локусом Satt 114 наведено на рисунку 2б.
115 п.н.
86 п.н.
100 п.н.
М 1 2 3 4 5 а
Ж» .-. /
М 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 М 16 17
б
Рис. 2. Електрофоретичний розпод1*л алелей МС-локуса Satt 114 для сорту со! 'ПР1309004':
а) у сум1Ш1 ДНК шести генотитв; б) окремих генотитв. М - маркер молекулярноТ маси Thermo Scientific O'RangeRuler 20 bp DNA Ladder; 1-17 - продукти ампл1фжац1"Т ДНК сорту соТ 'ПР1309004'
Анал1з сввдчить, що з 25 дослвджуваних сорт1в пол1морфними виявилися ввд 4 (за ло-кусом Satt 063) до 9 (за локусом Satt 114) сорив. Найб1льший р1вень пол1морф1зму встановлено для локуив Satt 114 та Satt 726 - 9 та 7 сорив ввдповвдно мали по два i б1ль-ше алелей за цими маркерами (рис. 3).
Згiдно з отриманими даними у певних сорив со! спостер^ався внутр^ньосорто-вий полiморфiзм: за всiма дослiджуваними МС-локусами у сорту 'Алшда', за локусами Satt 228, Satt 726 - у сорту 'Арнша', за локусами Satt 063 та Satt 726 - у сорту 'Фу-рю'. Таким чином, у разi застосування оцш-ки полiморфiзму для створення молекуляр-но-генетичних формул сортiв со! або встановлення !хньо! автентичноси потрiбно враховувати внутрiшньосортовий полiмор-фiзм.
Bнacлiдок проведених доcлiджень отримано aлелi cпецифiчних розм:р:в у межах кожного МС-локусу (табл. 2).
25 -г"
5 20
"о
■р 15 о. о и
¡5 10 и
-Q
5
1Ш
Satt 063 Satt 114 Satt228 Satt 726 ■ Псш'морфш □ Не пол1'морфт
Рис. 3. Розпод1л сорпв со! за МС-локусами в!*дпов1*дно до к'лькосл пол1'морфних сортов
Таблиця 2
Алелъ щентифжоват у copTiB coi за МС-локусами
Назва локусу К'льк'сть алелей, шт. Розм1'р алелей, п. н. Р1С
Satt 114 10 77; 82; 86; 92; 96; 100; 110; 115; 123; 126 0,83
Satt 228 18 207; 218; 221; 223; 226; 233; 234; 236; 237; 240; 247; 248; 251; 255; 263; 265; 267; 269 0,94
Satt 726 17 188; 200; 205; 209; 215; 220; 225; 229; 233; 240; 245; 250; 255; 258; 268; 270; 275 0,91
Satt 063 15 105; 108; 112; 127; 130; 133; 140; 145; 150; 154; 156; 162; 167; 180; 200 0,90
Найб!льшу шльмсть алелей - 18 - вияв-лено серед досл!джуваних сорт!в у Satt 228, 1хнш розм!р становив в!д 207 до 269 п. н., найменшу - 10 алелей - у МС-локусу Satt 114, розм!р яких вар!ював ввд 77 до 126 п. н.
Частота вдентифшованих алелей була в межах ввд 0,02 до 0,1 залежно ввд дослщжу-ваного локусу (рис. 4).
Частота алелей, !дентиф!кованих за локу-сами Satt 228 та Satt 063, становила ввд 0,02 до 0,14, проте б!льш!сть виявлених алел!в мали частоту 0,04. Для МС-локусу Satt 063 частота вар!ювала в межах 0,020,16. Найб!льше коливання значень частоти алелей виявлено за локусом Satt 114 - ввд 0,02 до 0,26.
Отже, отриман! висок! значення !ндексу пол!морфноси локусу (табл. 2), як! були в межах в!д 0,83 до 0,94 (що в середньому ста-новить 0,89), св!дчать про те, що !дентиф!ко-
ван! алел! р!вном!рно представлен! у ц!й ви-б!рщ дослвджуваних сорив со!.
Для диференщаци сорив на основ! резуль-тат!в ПЛР анал!зу за чотирма м!кросател!т-ними маркерами проводили кластерний ана-л!з, який ввдображае генетичш дистанци м!ж сортами (рис. 5).
За даними анал!зу генетичних дистанц!й м!ж дослвджуваними сортами со!, найб!ль-ша вщстань спостер!галася м!ж сортами 'Аляска' та 'Алшда' - 3,87. У м!ру зб!льшен-ня спорвдненоси сорив 1хш генетичш ввд-сташ зменшуються. Для дослвджень найспо-рвднешшими виявились сорти з! значенням 2,00: 'ДХ 530' та 'Абелша', 'ОАЦ Лейкв'ю' та 'Монарх', 'Сг Ср Шкор' та 'Гебо'. М!ж б!ль-шкстю дослвджуваних сорив, зокрема в 59 1хшх парах, ввдстань становила 3,61, 3,16 та 2,83, щ значення генетичних дистанцш виявились найпоширешшими в дослвджуванш виб!рц! сорт!в. Варто звернути увагу, що сор-ти 'Карра' та 'Амадеус', як! утворюють при-леглий до сорив 'Гебо' та 'Сг Ср Шкор' кластер, м!ж собою перебувають на однаковому р!вн! близькост!.
Враховуючи те, що абсолютно однаковими вважають об'екти з цифровим виразом генетичних дистанцш «нуль», або ж як! е максимально близькими до нуля, а абсолютно р!зними - з найб!льшим значенням, можна зробити висновок, що за отриманими роз-рахунками сорти е досить ввддаленими та в!дм!нними м!ж собою.
Результати !ерарх!чно'1 класифшаци у ви-гляд! ф!логенетичного дерева наведено на рисунку 6.
0,25
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 К'льк'сть алелей, шт. □ Satt 228 □ Satt 063 □ Satt 726 □ Satt 114
Рис. 4. Розподм частоти алелей за МС-локусами coi'
272
сортовивчЕння ТА охоронл прлв на сорти рослин, 2017, Т. 13, №3
'Алинда 'Арника 'Беркана 'ДХ 530 'Кано 'Гебо 'Милениум 'ДХ 618 'Монарх 'ОАЦ Калипсо 'ОАЦ Лейкв'ю 'ОАЦ Медок
'Абелина' 3,16 3,16 3,00 2,00 2,65 2,83 3,16 2,83 2,45 2,65 2,45 2,45
'Алинда' 3,16 3,61 3,46 3,61 3,16 3,46 3,46 3,46 3,61 3,46 3,16
'Арника' 3,00 3,46 3,32 3,16 3,16 2,83 2,83 3,32 2,83 2,83
'Беркана' 3,32 2,83 2,65 3,32 2,24 3,00 3,16 3,00 2,65
'ДХ 530' 3,00 3,16 3,46 3,16 2,83 2,65 2,83 3,16
'Кано' 2,65 3,00 2,65 3,00 2,45 3,00 3,00
'Гебо' 3,16 2,45 2,83 3,00 2,83 2,83
'Милениум' 3,16 3,16 3,32 2,83 3,16
'ДХ 618' 2,83 3,00 2,83 2,45
'Монарх' 3,00 2,00 2,83
'ОАЦ Калипсо' 3,00 3,00
'ОАЦ Лейкв'ю' 2,83
'ОАЦ Медок'
'Перлина'
'Норанда'
'Фурио'
'Карра'
'Аляска'
'ПР 1309004'
'Ариса'
'Нордика'
'Амадеус'
'Сг Айдер'
'Сг ср Пикор'
'Перлина 'Норанда 'Фурио 'Карра 'Аляска 'ПР 1309004 'Ариса 'Нордика 'Амадеус 'Сг Айдер 'Сг ср Пикор 'Асука
'Абелина' 2,65 2,83 2,83 2,83 3,32 2,65 3,00 3,00 2,83 2,83 2,83 2,83
'Алинда' 3,61 3,74 3,74 3,46 3,87 3,61 3,61 3,61 3,46 3,46 3,46 3,46
'Арника' 3,32 3,46 3,46 3,16 3,32 3,61 3,32 3,32 3,16 3,16 2,83 3,46
'Беркана' 3,16 3,32 3,32 2,65 3,46 3,16 3,16 2,83 2,65 3,00 2,65 3,00
'ДХ 530' 3,00 3,16 3,16 3,16 3,32 3,32 3,00 3,32 3,16 3,16 3,16 3,16
'Кано' 3,16 3,32 3,32 2,65 3,16 3,16 3,16 2,83 3,00 2,65 2,65 2,65
'Гебо' 3,00 3,16 2,83 2,45 3,32 3,32 3,00 2,65 2,45 2,83 2,00 2,83
'Милениум' 3,32 3,16 3,46 3,16 3,61 3,61 3,00 3,32 3,16 2,83 3,16 3,46
'ДХ 618' 3,00 3,16 3,16 2,45 3,32 3,32 3,00 2,24 2,83 2,83 2,45 2,83
'Монарх' 2,65 2,83 2,83 2,83 3,32 3,00 3,00 3,00 2,83 2,83 2,83 2,83
'ОАЦ Калипсо' 3,16 3,00 3,32 3,00 2,83 3,16 2,83 3,16 3,00 2,65 3,00 3,00
'ОАЦ Лейкв'ю' 2,65 2,45 2,83 2,83 3,32 3,00 3,00 3,00 2,83 2,45 2,83 2,83
'ОАЦ Медок' 3,00 3,16 3,16 2,83 2,65 3,00 2,65 3,00 2,45 2,45 2,83 3,16
'Перлина' 3,00 3,00 3,00 3,46 3,16 3,16 3,16 3,00 3,00 3,00 3,00
'Норанда' 3,16 2,83 3,61 3,32 3,00 3,32 3,16 3,16 3,16 2,83
'Фурио' 2,83 3,61 3,32 3,32 3,32 2,45 3,16 2,83 3,16
'Карра' 3,32 3,32 3,00 2,65 2,45 2,83 2,45 2,83
'Аляска' 3,16 2,45 3,46 3,00 2,65 3,00 3,61
'ПР 1309004' 3,46 3,16 3,32 3,00 3,32 3,32
'Ариса' 3,16 2,65 2,65 3,00 3,32
'Нордика' 3,00 3,00 2,65 3,00
'Амадеус' 2,45 2,45 3,16
'Сг Айдер' 2,83 2,83
'Сг ср Пикор' 2,83
Рис. 5. Генетичт дистанц!*! м!*ж досл!*джуваними сортами coi на основ! анал!*зу МС-локус1'в
На ochobí отримано! дендрограми визна-чено 9 кластер1в за мшросателггними маркерами Satt 063, Satt 114, Satt 228 та Satt 726, як! сформован! сортами 'Абелша' та 'ДХ 530', 'Монарх' i 'ОАЦ Лейкв'ю', 'Беркана' та 'ДХ 618', 'Гебо' та 'Сг Ср Шкор', 'Кано' та 'ОАЦ Калшсо', 'ОАЦ Медок' i 'Сг Айдер', 'Аляска'
та 'Аргса', 'Алшда' та 'Аршка', 'Карра' та 'Ама-деус'.
За анал!зом дендрограми встановлено, що менш спор1дненими за досл1джуваними МС-локусами були сорти 'Алшда' та 'Аршка'. Б1ль-ший р!вень близькосл. виявили сорти 'Кано' та 'ОАЦ Калшсо', 'ОАЦ Медок' i 'Сг Айдер', 'Аляс-
Рис. 6. Розпод1л сорп'в coi' за ступеней спор1дненосп' на основт анал1зу МС-локуа'в
ка' та 'Ар!са', як! перебувають на одному р!вн!. Сорти со!, як! вцдязняються за генетичними маркерами Satt 063, Satt 114, Satt 228 та Satt 726, розм!щуються в р!зних блоках класте-р!в та е найбшьш вщдаленими один в!д одного.
Для диференщаци 25 дослвджених сорив со! можна рекомендувати використання мшро-сателиних локусв Satt 114, Satt 228, Satt 726 та Satt 063.
Висновки
Внасл!док досл!дження молекулярно-гене-тичного пол!морф!зму нових сорив со! за мш-росател!тними маркерами встановлено, що з 25 дослвджуваних сортiв найбшьш полморф-ними виявились сорти 'Алшда', 'Аршка', 'Астер', 'Беркана', 'КСБ 939', 'ОАЦ Аватар', 'Но-ранда', 'Фурю', 'Аляска', 'ПР 1309004' за локу-сом Satt 726 та сорти 'Ал!нда', 'ДХ 530', 'Кано', 'М!лен!ум', 'Перлина', 'Норанда', 'ПР 1309004', 'Нордша' та 'Асука' - за локусом Satt 114. Тому необхвдно враховувати внутршньосортовий пол!морф!зм шд час вдентифшаци тих сорив, в яких наявн! к!лька алел!в одного локуса.
Визначено, що вдентифшоваш алел! МС-локус!в досить р!вном!рно представлен! у ви-б!рц! сорт!в, про що св!дчить високий !ндекс пол!морфноси локусу (0,83-0,94). Внаслвдок кластерного анал!зу отримано 9 кластер!в, що об'еднують под!бш сорти. Зидно з оцшкою ге-нетичних дистанцш дослвджуваних сорив со! було визначено, що найбшьш под!бними за ло-кусами Satt 063, Satt 114, Satt 228 та Satt 726 виявилися сорти, генетичш дистанци м!ж якими становили 2,00: 'ДХ 530' та 'Абел!на', 'ОАЦ Лейкв'ю' та 'Монарх', 'Сг Ср Шкор' ! 'Гебо'. Результати цих дослвджень були вико-
ристаш для створення бази даних молекуляр-
но-генетичного пол1морф1зму дослвджених
сорив со! з метою ¿х вдентифшацл.
Використана литература
1. Hudcovicova M., Kraic J. Utilisation of SSRs for characterisation of the Soybean (Glycine max (L.) Merr.) genetic resources. Czech J. Genet. Plant Breed. 2003. Vol. 39, No. 4. P. 120-126.
2. Tasma I. M., Warsun A., Asadi A. Development and Characterization of F2 Population for Molecular Mapping of Aluminum-Tox-icity Tolerant QTL in Soybean. J. AgroBiogen. 2008. Vol. 4, No. 1. P. 1-8. doi: 10.21082/jbio.v4n1.2008.p1-8
3. Li Y., Sun S., Zhong C. et al. Genetic mapping and development of co-segregating markers of RpsQ, which provides resistance to Phytophthora sojae in soybean. Theor. Appl. Genet. 2017. Vol. 130, Iss. 6. P. 1223-1233. doi: 10.1007/s00122-017-2883-7.
4. Рамазанова С. А. Идентификация сортов сои (Glycine max L.) с использованием микросателлитных локусов ДНК. Масличные культуры. Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. 2016. Вып. 2. С. 63-67.
5. Абугалиева С. И. Генетическое разнообразие сои (Glycine max (L.) Merrill). Биотехнология. Теория и практика. 2013. № 4. С. 13-19. doi: 10.11134/btp.4.2013.2.
6. Jun T.-H., Michel A. P., Mian M. A. Development of soybean aphid genomic SSR markers using next generation sequencing. Genome. 2011. Vol. 54, Iss. 5. P. 360-367. doi: 10.1139/g11-002
7. Mulato B. M., M^ler M., Zucchi M. I. et al. Genetic diversity in soybean germplasm identified by SSR and EST-SSR markers. Pesq. Agropec. Bras. 2010. Vol. 45, No. 3. P. 276-283. doi: 10.1590/S0100-204X2010000300007
8. Tasma I. M., Satyawan D., Warsun A. et al. Phylogenetic and Maturity Analyses of Sixty Soybean Genotypes Used for DNA Marker Development of Early Maturity Quantitative Trait Loci in Soybean. J. AgroBiogen. 2011. Vol. 7, No. 1. P. 37-46. doi: 10.21082/jbio.v7n1.2011.p37-46
9. Dong D., Fu X., Yuan F. et al. Genetic diversity and population structure of vegetable soybean (Glycine max (L.) Merr.) in China as revealed by SSR markers. Genet. Resour. Crop Evol. 2014. Vol. 61, Iss. 1. P. 173-183. doi: 10.1007/s10722-013-0024-y
10. Гончаров Ю. 0., Деркач К. В., Абра1'мова 0. £. та 1'н. 1нфор-мативтсть SSR-маркерп'в при досл1'джент генетичного пол1'морф1'зму лтнтй кукурудзи. Фактори експерименталь-но1 еволюци орган1'зм1'в : зб. наук. пр. Кий'в, 2016. Т. 19. С. 112-116.
11. Gavioli E. A. Molecular Markers: Assisted Selection in Soybeans. Soybean - Genetics and Novel Techniques for Yield Enhancement / D. Krezhova (ed.). Rijeka, Croatia : InTech, 2011. Vol. 9. P. 155-180. doi: 10.5772/18934
12. Волкова H. E., Брик 0. Ф., Венгер A. M. 1дентиф1'каф'я сорлв сот культурной (Glycine max (L.) Merr) та аналИз гет'в, що ко-дують субодиниц глпцишну. 36ipHUK наук. праць СГ1-НЦНС. 2015. Вип. 25. С. 114-119.
13. Присяжнюк Л. M., Коровко 1.1., Король Л. В., Шип'кова Ю. В. Диференц'ац'я сорлв сот на основИ молекулярно-генетич-ного полИморфИзму. Роль наукових досл1'джень в забезпечен-Hi процеав iHHoeau,iuHoio розвитку аграрного виробниц-тва Укртни : матер. Всеукр. наук.-практ. конф. молодих вчених i спец'алкпв (м. Дт'про, 25 травня 2016 р.). Ви'нни-ця : Жлан-ЛТД, 2016. С. 32-33.
14. Волкова Н. E. Молекулярт маркери в генетицИ, селекцИТ та наси'нництв'' бобових культур (огляд). 36ipник наук. праць СГ1-НЦНС. 2015. Вип. 26. С. 99-106.
15. Волкова Н. E. Молекулярт маркери для експертизи сорлв на вИдмИннИсть, однори'дт'сть i стаб"'льт'сть у систем"' UPOV. 36ipник наук. праць СГ1-НЦНС. 2014. Вип. 23. С. 50-56.
16. Valliyodan B., Ye H., Song L. et al. Genetic diversity and genomic strategies for improving drought and waterlogging tolerance in soybeans. J. Exp. Bot. 2017. Vol. 68, Iss. 8. P. 1835-1849. doi: 10.1093/jxb/erw433
17. Akond M., Liu S., Schoener L. et al. SNP-Based Genetic Linkage Map of Soybean Using the SoySNP6K Illumina Infinium BeadChip Genotyping. J. Plant Genome Sci. 2013. Vol. 1, No. 3. P. 80-89. doi: 10.5147/jpgs.2013.0090
18. Tantasawat P., Trongchuen J., Prajongjai T. et al. SSR analysis of soybean (Glycine max (L.) Merr.) genetic relationship and variety identification in Thailand. AJCS. 2011. Vol. 5, Iss. 3. P. 283-290.
19. Методика проведення квалИфшацИйноТ експертизи сорлв рослин на придаттсть до поширення в УкраТт. Методи виз-начення показнимв якосл продукцИТ рослинництва / за ред. С. 0. Ткачик. ВИнниця : Жлан-ЛТД, 2015. 160 с.
20. РоТк М. В., Сиволап Ю. М., Петюх Г. П. та Ин. Визначення мо-лекулярно-генетичного полИморфИзму роду Beta L. за допо-могою полИмеразноТ ланцюговот реакцИТ : метод. рекоменд. КиТв : ПолИграфКонсалтинг, 2007. 27 с.
21. Ермантраут E. Р., Присяжнюк 0. I., Шевченко I. Л. Статис-тичний аналИз агрономИчних дослИдних даних в пакел Statistica 6.0. КиТв : ПолИграфКонсалтинг, 2007. 55 с.
22. Everitt B. S., Landau S., Leese M., Stahl D. Cluster Analysis. (5th ed.). Chichester : Wiley, 2011. 346 р. doi: 10.1002/9780470977811
23. Дроздов В. И. Инструкция по использованию пакета Statistica 6.0. Курск : Изд-во ЮЗГУ, 2010 . 74 с.
References
1. Hudcovicovi M., & Kraic, J. (2003). Utilisation of SSRs for characterisation of the soybean (Glycine max (L.) Merr.) genetic resources. Czech J. Genet. Plant Breed., 39(4), 120-126.
2. Tasma, I. M., Warsun, A., & Asadi, A. (2008). Development and Characterization of F2 Population for Molecular Mapping of Aluminum-Toxicity Tolerant QTL in Soybean. J. AgroBiogen, 4(1), 1-8. doi: 10.21082/jbio.v4n1.2008.p1-8
3. Li, Y., Sun, S., Zhong, C., Wang, X., Wu, X., & Zhu, Z. (2017). Genetic mapping and development of co-segregating markers of RpsQ, which provides resistance to Phytophthora sojae in soybean. Theor. Appl. Genet., 130(6), 1223-1233. doi: 10.1007/s00122-017-2883-7
4. Ramazanova, S. A. (2016). Identification of soybean (Glycine max L.) cultivars using microsatellite DNA loci. Maslichnye kul'tury. Nauchno-tekhnicheskiy byulleten' VNIIMK [Oil Crops. Scientific and technical bulletin of All-Russia Research Institute of Oil Crops], 2, 63-67. [in Russian]
5. Abugalieva, S. I. (2013). Genetic diversity of soybean (Glycine max (L.) Merrill). Biotekhnologiya. Teoriya i praktika [Biotechnology. Theory and Practice], 4, 13-19. doi: 10.11134/btp.4.2013.2. [in Russian]
6. Jun, T.-H., Michel, A. P., & Mian, M. A. (2011). Development of soybean aphid genomic SSR markers using next generation sequencing. Genome, 54(5), 360-367. doi: 10.1139/g11-002
7. Mulato, B. M., Mqller, M., Zucchi, M. I., Quecini, V., & Pinheiro, J. B.
(2010). Genetic diversity in soybean germplasm identified by SSR and EST-SSR markers. Pesq. Agropec. Bras. 2010. Vol. 45, No. 3. P. 276-283. doi: 10.1590/S0100-204X2010000300007
8. Tasma, I. M., Satyawan, D., Warsun, A., Yunus, M., & Santosa, B.
(2011). Phylogenetic and Maturity Analyses of Sixty Soybean Genotypes Used for DNA Marker Development of Early Maturity Quantitative Trait Loci in Soybean. J. AgroBiogen. 7(1), 37-46. doi: 10.21082/jbio.v7n1.2011.p37-46
9. Dong, D., Fu, X., Yuan, F., Chen, P., Zhu, S., Li, B., ... Zhu, D. (2014). Genetic diversity and population structure of vegetable soybean (Glycine max (L.) Merr.) in China as revealed by SSR markers. Genet. Resour. Crop Evol., 61(1), 173-183. doi: 10.1007/s10722-013-0024-y
10. Honcharov, Yu. O., Derkach, K. V., Abraimova 0. Ye., Satarova, T. M., Veselianska, K. V., Halatsan, S. V., ... Tyshkovska, T. 0. (2016). Informativity of SSR-markers in the investigations of maize lines genetic polymorphisms. Fakt. eksp. evol. org. [Factors in experimental evolution of organisms], 19, 112-116. [in Ukrainian]
11. Gavioli, E. A. (2011). Molecular Markers: Assisted Selection in Soybeans. In D. Krezhova (Ed.), Soybean - Genetics and Novel Techniques for Yield Enhancement (Vol. 9. pp. 155-180). Rijeka, Croatia: InTech. doi: 10.5772/18934
12. Volkova, N. E., Bryk, 0. F., & Venher, A. M. (2015). Identification of soybean varieties (Glycine max (L.) Merr) and analysis of genes encoding subunit glycinins. Zbirnyk naukovykh prats SHI-NTsNS [Collected scientific articles of PBGI-NCSCI], 25, 114-119. [in Ukrainian]
13. Prysiazhniuk, L. M., Korovko, I. I., Korol, L. V., & Shytikova Yu. V. Differentiation of soybean varieties based on molecular genetic polymorphism. In Rol naukovykh doslidzhen v zabez-pechenni protsesiv innovatsiinoho rozvytku ahrarnoho vyrobnyt-stva Ukrainy: materialy Vseukrainskoi naukovo-praktychnoi kon-ferentsiimolodykh vchenykh ispetsialistiv [The role of scientific research in ensuring the processes of innovative development of agrarian production of Ukraine: Proc. of the All-Ukrainian applied research conference of young scientists and specialists] (pp. 32-33). May 25, 2016, Dnipro, Ukraine. [in Ukrainian]
14. Volkova, N. E. (2015). Molecular markers in genetics, breeding and seed production of legumes (review). Zbirnyk naukovykh prats SHI-NTsNS [Collected scientific articles of PBGI-NCSCI], 26, 99-106. [in Ukrainian]
15. Volkova, N. E. (2014). Molecular markers for the examination of varieties for distinctness, uniformity and stability used in UPOV. Zbirnyk naukovykh prats SHI-NTsNS [Collected scientific articles of PBGI-NCSCI], 23, 50-56. [in Ukrainian]
16. Valliyodan, B., Ye, H., Song, L., Murphy, M., Shannon, J., & Nguyen, H. (2017). Genetic diversity and genomic strategies for improving drought and waterlogging tolerance in soybeans. J. Exp. Bot., 68(8), 1835-1849. doi: 10.1093/jxb/erw433
17. Akond, M., Liu, S., Schoener, L., Anderson, J. A., Kantartzi, S. K., Meksem, K., ... Kassem, M. A. (2013). SNP-Based Genetic Linkage Map of Soybean Using the SoySNP6^ Illumina Infinium BeadChip Genotyping. J. Plant Genome Sci., 1(3), 80-89. doi: 10.5147/jpgs.2013.0090.
18. Tantasawat, P., Trongchuen, J., Prajongjai, T., Jenweerawat, S., & Chaowiset, W. (2011). SSR analysis of soybean (Glycine max (L.) Merr.) genetic relationship and variety identification in Thailand. AJCS, 5(3), 283-290.
19. Tkachyk, S. 0. (Ed.). (2015). Metodyka provedennia kvalifikat-siinoi ekspertyzy sortiv roslyn na prydatnist do poshyrennia v Ukraini. Metody vyznachennia pokaznykivyakostiproduktsii ro-slynnytstva [Regulations on the procedure and the conduct of qualification tests for suitability of crop varieties for dissemination in Ukraine. Methods of determining quality indices of crop products]. Vinnytsia: Nilan-LTD. [in Ukrainian]
20. Roik, M. V., Syvolap, Yu. M., Petiukh, H. P., Shaiuk, L. V., Ba-biazh, A. I., & Bilous, N. V. (2007). Vyznachennia molekuliarno-
henetychnoho polimorfizmu rodu Beta L. za dopomohoiu poli-meraznoi lantsiuhovoi reaktsii [Detection of molecular genetic polymorphism of the genus Beta L. using PCR-analysis]. Kyiv: PolihrafKonsaltynh. [in Ukrainian] 21. Ermantraut, E. R., Prysiazhniuk, O. I., & Shevchenko, I. L. (2007). Statystychnyi analiz ahronomichnykh doslidnykh danykh v paketi Statistica 6.0 [Statistical analysis of agro-
nomic study data using the Statistica 6.0 software suite]. Kyiv: PolihrafKonsaltynh. [in Ukrainian]
22. Everitt, B., Landau, S., Leese, M., & Stahl, D. (2011). Clusteranalysis. (5th ed.) Chichester: Wiley. doi: 10.1002/9780470977811
23. Drozdov, V. I. (2010). Instruktsiya po ispolzovaniyu paketa Statistica 6.0 [Manual for using the Statistica 6.0]. Kursk: Izda-telstvo YuZGU. [in Russian]
УДК 602.6: 633.34
Присяжнюк Л. M.*, Мельник С. И., Шитикова Ю. В., Сигалова И. А., Иваницкая А. П. Использование SSR-маркеров для дифференциации новых сортов сои (Glycine max (L.) Merr.) // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. 2017. Т. 13, № 3. С. 269-279. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.13.3.2017.110709
Украинский институт экспертизы сортов растений, ул. Генерала Родимцева, 15, г. Киев, 03041, Украина, *e-mail: prysiazhniuk_l@ukr.net
Цель. Исследовать молекулярно-генетический полиморфизм новых сортов сои с помощью SSR-маркеров в отношении возможности применить его для экспертизы сортов на отличие, однородность и стабильность. Методы. Молекулярно-генетический анализ нуклеиновых кислот, кластерный анализ. Результаты. Приведены результаты исследований молекулярно-генетического полиморфизма 25 сортов сои по микросателлитным маркерам с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Анализ продуктов амплификации показал, что по всем исследуемым SSR-маркерам внутрисортовой полиморфизм наблюдался у сорта 'Алинда', по локусам Satt 228 и Satt 726 - у сорта 'Арника', по локусам Satt 063 и Satt 726 - y сорта 'Фурио', который учитывался в последующих исследованиях некоторых генотипов. При оценке полиморфизма исследуемых сортов определено, что частоты идентифицированных аллелей составляли от 0,02 до 0,1 в зависимости от микроса-теллитного локуса. С помощью кластерного анализа определены генетические дистанции между сортами. Расстояние между большинством сортов, в частности в 59 случаях,
составляло 3,61, 3,16 и 2,83, эти значения генетических дистанций были самыми распространенными в исследуемой выборке сортов. Выводы. Анализ молекулярно-гене-тического полиморфизма свидетельствует, что из 25 исследуемых сортов наиболее полиморфными оказались 10, что необходимо учитывать при их дальнейшей идентификации. Определено, что идентифицированные аллели равномерно представлены в выборке исследуемых сортов сои, о чем свидетельствует высокий индекс полиморфности локуса (0,83-0,94). В результате оценки генетических дистанций между сортами было установлено, что наиболее похожими по локусам оказались сорта, генетические дистанции между которыми составляли 2,00, различными - 3,87. Таким образом, маркерная система, которая состоит из четырех микросателлитных локусов Satt 063, Satt 114, Satt 228 и Satt 726, является эффективной для определения разницы между исследуемыми сортами сои.
Ключевые слова: молекулярно-генетический полиморфизм, маркерная система, генетические дистанции, микросателлитные локусы.
UDC 602.6:633.34
Prysiazhniuk, L. M.*, Melnyk, S. I., Shytikova, Yu. V., Sihalova, I. O., & Ivanytska, A. P. (2017). Application of SSR markers to differentiate new varieties of soybean (Glycine max (L.) Merr.). Plant Varieties Studying and Protection, 13(3), 269-279. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.13.3.2017.110709
Ukrainian Institute for Plant Variety Examination, 15 Henera Rodymtseva Str., Kyiv, 03041, Ukraine, *e-mail: prysiazhniuk_l@ukr.net Purpose. To study the molecular genetic polymorphism in ticularly in 59 cases, was 3.61, 3.16 and 2.83, these values of
new soybean varieties using SSR-markers as for the possibility to apply it for examination of varieties for difference, uniformity and stability. Methods. Molecular genetic analysis of nucleic acids, cluster analysis. Results. The results of study of molecular genetic polymorphism in 25 varieties of soybean through microsatellite markers using polymerase chain reaction were presented. Analysis of the amplification products has showed that for all the studied SSR-markers intra-species polymorphism was observed in the 'Alinda' variety, for the loci Satt 228 and Satt 726 - in the 'Arnica' variety, for the loci Satt 063 and Satt 726 - in the 'Furio' variety, which was taken into account in further studies of some genotypes. When assessing polymorphism in the studied varieties, it was determined that the frequencies of the identified alleles were ranging from 0,02 to 0,1 that depended on the microsatellite locus. Using cluster analysis, genetic distances were determined between varieties. The distance between many varieties, par-
genetic distances prevailed in the studied sample of varieties. Conclusions. Analysis of molecular genetic polymorphism showed that 10 varieties were the most polymorphic among 25 studied ones, that should be taken into account in their further identification. It was determined that the identified alleles were evenly represented in the sample of studied soybean varieties, as evidenced by a high polymorphic index of the locus (0.83-0.94). According to the evaluation of genetic distances between varieties, it was found that the varieties were the most similar by loci when the genetic distances between them were 2.00, and the varieties were the most different when the distances were 3.87. Thus, the marker system, which consists of four microsatellite loci such as Satt 063, Satt 114, Satt 228 and Satt 726, is effective for defining the difference between studied soybean varieties.
Keywords: molecular genetic polymorphism, marker system, genetic distances, microsatellite loci.
Hadiuwëa / Received 26.06.2017 flozodœeHO do dpyKy/ Accepted 17.08.2017
