МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ РОДАНИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1994 УДК 615.31:547.284.31-015.4.07

О. В. Шехтер, 3. И. Жолдакова, О. О. Синицына, Л. X. Мухамбетова МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ РОДАНИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва

Важным этапом изучения токсического действия ксенобиотиков является анализ процессов, связанных с их метаболизмом. Токсичность ацетонциангидрина (АЦГ) — соединения, применяющегося в химической промышленности, изучена недостаточно, особенно в плане биотрансформации.

Цель настоящей работы — исследование скорости биотрансформацин АЦГ в эксперименте. Известно, что это соединение нестойкое и в организме гидролизуется до токсичных цианид-ионов. Детоксикация последних, осуществляемая ферментом роданезой и протекающая путем вытеснения сульфит-иона из молекулы тиосульфата, приводит к образованию роданидов ¡2, 4—6]:

СН

-K=C-S +so3

На основании изложенного можно предположить, что одним из критериев, позволяющих судить о скорости деградации и детоксикации АЦГ в организме, может являться количество роданид-ионов. Для определения содержания роданидов в биологических жидкостях предложены различные методы [1, 7—11]; из них наибольший практический интерес представляют спектрофотометрические методы анализа [1, 7, 11]. Большинство из них основано на взаимодействии роданидов с бромом, приводящим к образованию бром-циана:

SCN+ 4Вгг + 4НгО--GNBr + 7Вг + + 8Н

Последний после удаления избытка брома при действии соответствующих реактивов превращается в полиметиновый краситель. Следует отметить, что тот же принцип используется и для определения цианидов [3, 7, 11], но, судя по данным литературы, цианиды очень неустойчивы и с учетом большого разведения исследуемых проб их присутствие не влияет существенно на результаты определения роданидов [11]. Тем не менее в данном случае при анализе количества роданидов, образующихся в процессе биотрансформации АЦГ после гидролиза органической молекулы, нам представлялось необходимым исключить возможную примесь цианидов для получения более точных результатов.

С этой целью мы разработали модификацию спектро-фотометрического способа определения роданид-ионов, основанного на получении полиметинового красителя, пригодную для определения содержания роданидов в сыворотке крови и моче. Данная работа посвящена анализу роданидов в сыворотке крови. Удаление следов цианидов в виде НСЫ осуществляли нагреванием смеси разбавленной сыворотки с трихлоруксусной кислотой при 35—37 °С (температура кипения НСЫ — 24 °С). Бромциан, полученный взаимодействием роданидов, содержащихся в анализируемой пробе с бромом, после удаления избытка брома гидразинсульфатом посредством реакции с пиридин-бензидиновым реактивом превращается в производное глутаконового альдегида, окрашенное н красный цвет. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре при 530 нм при толщине слоя I см

Реактивы. 1. 60% раствор пиридина: 60 мл свежепе-регнанного пиридина растворяют в 40 мл дистиллированной воды и прибавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты. 2. 2 % раствор гидрохлорида бензидина: 1 г гидрохлорида бензидина растворяют в смеси 40 мл дистиллированной воды и 10 мл 10 % соляной кислоты с последующей фильтрацией. 3. Насыщенный раствор бромной воды: 3 мл брома растворяют в 200 мл дистиллированной воды и выдерживают до максимального растворения брома. 4. 0,5 % раствор гидразинсульфата: 0,5 г гидразинсульфата растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Ход определения'. К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 0,4 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 15 % раствора трихлоруксусной кислоты. Полученную смесь выдерживают 15 мин при 35—37 °С и центрифугируют при 7000 об/мин в течение 15 мин. Затем отбирают 0,5 мл надосадочной жидкости и разбавляют 4,5 мл дистиллированной воды. К 1 мл полученного раствора приливают 0,2 мл насыщенной бромной воды, перемешивают и после 5-минутной выдержки при комнатной температуре прибавляют 0,5 мл 0,5 % раствора гидразинсульфата, тщательно перемешивая. Полученный обесцвеченный раствор смешивают с 1,3 мл пиридин-бензидинового реактива, состоящего из смеси 60 % раствора пиридина и 2 % раствора гидрохлорида бензидина в соотношении 4:1. Через 15 мин определяют оптическую плотность. Окраска устойчива в течение 10—15 мин.

Количество роданидов рассчитывали с помощью градуиро-вочного графика; диапазон концентраций стандартных растворов роданистого калия составлял 0,1—3,0 мг/л, считая на роданид-ион.

Данный метод был использован для определения содержания роданидов в сыворотке крови крыс, получавших разные дозы АЦГ в условиях кратковременного опыта, а также в сыворотке интактных животных. Следует отметить, что в доступной нам литературе сведения о содержании эндогенных роданидов в сыворотке крови крыс отсутствуют. В сыворотке крови людей количество эндогенных роданидов колеблется в пределах 0,44 —1,14 мг/л [1].

Поскольку при поступлении АЦГ в организм содержание роданидов в сыворотке изменяется в зависимости от скорости гидролиза и детоксикации данного соединения, а гидролиз АЦГ ускоряется в щелочной среде, введение АЦГ in vivo проводили в кислом (рН 6,0) и щелочном (рН 8,0) растворах. В кислых растворах (негидролизо-ванный АЦГ) использовали дозы 1/5, 1/10 и 1/20 LOso, в щелочных (гидролизованный АЦГ) — 1/5 Lüso. Сыворотку отбирали через 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 и 6,0 ч.

Результаты исследований показали, что скорость образования роданид-ионов зависит от формы вводимого АЦГ (см. рисунок). Так, после введения негидролизованного АЦГ пик содержания роданидов наблюдается через 2 ч, а под действием гидролизованного АЦГ — через 15 мин. Кроме того, количество роданидов в сыворотке крови находится в прямой зависимости от дозы: со снижением дозы уменьшалась абсолютная величина содержания тиоцианатов (в дозе 1/5 L-Dso— 3,32 мг/л; 1/10 LD50 — 1,98 мл/л; 1/20 LOso — 1,82 мг/л). Однако если при введении максимальной дозы негидролизованного АЦГ количество роданидов достоверно увеличивалось уже через 15 мин (с 1,37 до 1,75 мг/л), то при воздействии меньших доз — через 30 мин. После достижения пика содержание роданидов начинает снижаться и к 6 ч в дозах 1/10 и 1/20 LDso достигает контрольных величин. В дозе 1/5 LD5o через 6 ч количество тиоцианатов в сыворотке крови подопытных крыс было достоверно выше, чем в контроле.

Различия в скорости детоксикации негидролизованного и гидролизованного АЦГ, по-видимому, связаны с тем, что при поступлении в организм этого соединения в неизмененном виде необходимо какое-то время для его гидролиза до цианид-иона (1-я стадия метаболизма), которым и определяется токсичность АЦГ. Кроме того, о полном метаболизме АЦГ в организме до CN" свидетельствует достоверное увеличение содержания роданидов в сыворотке крови после введения негидролизованного вещества, так как роданеза действует только на свободные цианид-ионы, но не реагирует с CN-rpyn-пами, содержащимися в молекуле органического соединения [6, 12].

Выводы. 1 Предлагаемый метод позволяет судить о скорости метаболизма и выведения АЦГ из организма и может

Работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу.

Динамика изменения содержания роданидов в сыворотке крови белых крыс после однократного введения разных доз АЦГ.

По оси абсцисс — время (в ч); по оси ординат — содержание роданидов (в мг/л). / - 1/5 Ша при рН 6.0. 2 — 1/10 1Л>50 при рН 6.0. 3— 1/20 ЬО50 при рН 6.0. 4 — 1/5 ЬОи при рН 8.0.

быть использован для изучения скорости биотрансформации данного соединения.

2. Данный метод отражает зависимость концентрации роданидов от дозы воздействия АЦГ.

3. Метод прост для выполнения, исключает возможность присутствия примеси цианидов, мешающих определению, предусматривает использование традиционной аппаратуры и небольшого объема доступного биоматериала (сыворотки крови, мочи) и реактивов и может быть рекомендован для оценки опасности воздействия АЦГ на организм при эколого-гигиенической экспертизе.

Литература

1. Алексиев А. А., Стефанов Б. Ф., Ангелова М. Г. // Гиг. и сан.— 1986,—№ 6.— С. 68.

2. Биогенез чужеродных соединений / Под ред. Л. М. Ги-нодмана.— М., 1965.

3. Герасимов И. В. // Суд.-мед. эксперт.— 1979.— № 3.— С. 38.

4. Голиков С. Н., Саноцкий И. В., Тиунов Л. А. Общие механизмы токсического действия.— Л., 1986.— С. 176.

5. Кнапик 3., Ганьчиц Г. // Гиг. труда.— 1981.— № II.— С. 55—57.

6. Мецлер Д. Биохимия.—М., 1980,—Т. 3.—С. 131.

7. Aldridge W. N. // Analyst.— 1945.— Vol. 70.—P. 474.

8. De Brabander H. F., Verbehe R. //J. Chromatogr.— 1977.— Vol. 138,—P. 131.

9. Giraudi G., Grillo С. // Analyt. chirn. Acta.— 1981.— Vol. 128.— P. 169.

10. Landis J., Rebec В. M., Pardue H. ¿.//Analyt. Chem — 1977,— Vol. 29,— P. 785.

11. Petligrew A. R., Fell G. S. // Clin. Chem.— 1972.— Vol. 18,— P. 996.

12. Sörbo B. H. // Acta chem. scand.—1953.—Vol. 7,— P. 1137.

Поступила 17.09.93

Дискуссии и отклики читателей

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1993 УДК 613.632-092.9-07'!

И. М. Трахтенберг, М. Н. Коршун, Л. М. Краснокутская, А. Н. Западнюк

О ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ИНТЕРПРЕТАЦИИ ДАННЫХ ХРОНОТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ

ВЕЩЕСТВ (по поводу статьи А. Ф. Ковалева1)

Институт медицины труда АН и Минздрава Украины, Киев

Многочисленные публикации о колебаниях токсичности и лабораторно диагностируемых биологических эффектов действия химических веществ в зависимости от времени суток введения веществ в организм экспериментальных животных зачастую сопровождаются предложениями (выводами) о необходимости использовать данные хронотоксичности при обосновании гигиенических нормативов изученных соединений в воздухе рабочей зоны. Так поступил и автор статьи, послужившей поводом для настоящего отклика. Но располагает ли он достаточно убедительными данными и аргументами в пользу такого вывода?

Для установления факта зависимости токсичности веществ (речь идет о бензойной и салициловой кислотах и 4 производных последней) от времени введения их в организм лабораторных животных автор в фиксированные «временные точки» (5, II, 16 и 22 ч) вводил крысам вещества в дозах, ранее установленных как ЬО50. Но в статье ни слова не говорится о том, к какому «временному отрезку» (или «точке») приурочены эти величины. Поскольку Ьбьо не может быть в принципе вневременной, то одно из двух: либо это «среднесуточная ЬОйо», полученная при условии постановки развернутого опыта с введением каждой «испытанной дозы» веществ 2 животным в те же «временные точки» (в этом случае суммарно на каждую такую «испытанную дозу» в диа-

1 Гигиена и санитария.— 1993.— № 1.— С. 64.

назоне от LD0 до LDioo будет приходиться по 2X4=8 животных), либо это LD50, установленная при введении веществ утром, натощак, примерно в 9—10 ч, как это обычно имеет место. В первом случае правомерно использовать эту «среднесуточную LDso» для выяснения хронотоксичности веществ. Во втором случае LD50 несет на себе отпечаток времени введения изучаемых веществ, и по логике вещей соответствующая информация (а именно результат опыта с введением LD50 каждого вещества 8 животным в то же время, к которому приурочено ее установление) должна войти в общую хронологическую цепочку экспериментальных данных со всеми вытекающими из этого последствиями. Зададимся вопросом: а если бы такой опыт был поставлен. Идеальным с точки зрения теории и закона больших чисел был бы эффект гибели 4 животных из 8 (4/8, или 50%). Однако при столь малом числе животных на испытанную дозу эффект 3/8 (5/8) практически столь же вероятен (/7=0,218), как и эффект 4/8 (р=0,273); вероятность эффектов 2/8 (или 6/8) намного ниже (р=0,109), но и такую возможность исключить нельзя |6]. Доверительный интервал эффекта 4/8 при 95 % вероятности колеблется в очень широком диапазоне — от 0,15 до 0,84 и соответствует возможной гибели от 2 до 6 животных, взятых в группу, что подтверждает сказанное выше и с чем мы нередко встречаемся в эксперименте. А коль так, то данные в отношении салициловой кислоты вообще непоказательны. Если же приведенные автором данные сопоставить с теоретически