CC BY
18
Общепринятый метод
Схема выделения S. typhi из питьевой воды
Метод мембранных фильтров
1-й вариант
2-й вариант
Проба воды, 1 л
*
Посев в 1 л селенитового бульона двойной концентрации, распределение на 4 объема по 0,5 л
Проба воды, 1 л
Проба воды, 1 л
Фильтрация через мембранный фильтр № 3
Фильтрация через мембранный фильтр № 3
Посев в 20—50 мл селенитового бульона обычной концентрации
Инкубация в течение 24 ч при 37°С Инкубация в течение 24 ч при 37°С
Посев с каждого объема на 3 чашки с висмутсульфитным агаром
Посев на 3 чашки с висмутсульфитным агаром
Инкубация 1—2 чашек висмутсулъфит-ного агара с мембранными фильтрами в течение 24 ч при 37 °С
¡■^Инкубация в течение 24 ч при 37 °С Инкубация в течение 24 ч при 37 °С
УДК 613.32: [579.842.11:578.81 )-078
|£. Л. Ловцевич\, Р. А. Дмитриева, А. Е. Недачин, Л. А. Мышляева, Т. В. Доскина, Н. Г. Нечипоренко, Н. М. Корнилова
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИФАГОВ В ПИТЬЕВОЙ ВОДЕ
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
В соответствии с принятыми в СССР документами санитарного законодательства оценка эпидемической безопасности водных объектов в отношении возбудителей кишечных инфекций проводится по косвенным бактериальным показателям. Однако если бактерии группы кишечных ^алочек являются надежным косвенным показателем эпидемической безопасности питьевой воды в отношении патогенных энтеробактерий, то в отношении энтеровирусов они не всегда адекватны. В последние годы для рекреационных вод и для воды источников централизованного водоснабжения в качестве индикаторов вирусного загрязнения используются бактериофаги кишечной палочки — колифаги [1, 2]. При са-нитарно-микробиологическом анализе этих вод проводится прямое выделение колифагов из 10 мл воды, так как их уровень в них составляет десятки, сотни и более бляшкообразуюших единиц в 1 л (БОЕ/л).
Что касается питьевой воды, то в связи с отсутствием методов обнаружения единичных колифагов в 1 л до настоящего времени не представлялось реальным изучить возможность использования колифагов в качестве индикаторов энтеровирусов при санитарно-микробиологиче-ском исследовании этого водного объекта.
В связи с изложенным выше целью настоящих исследований являлась разработка метода определения минимального количества колифагов (единичные вирионы в 1 л) в питьевой воде.
В основу разработанного метода определения колифагов в питьевой воде был положен метод обогащения (подращивания), традиционно применяемый в бактериологических исследованиях слабозагрязненных водных объектов.
Экспериментальные исследования проводили на модели ДНК-содержащего колифага Ть Последний был выбран в качестве модели в связи с тем, что ДНК-содержащие бактериофаги наиболее распространены в природных водах, при этом, по данным ряда авторов, частота их выделения колеблется от 80 до 100 % в зависимости от степени загрязнения исследуемого объекта сточными водами. Рабочие концентрации фага в эксперименте составляли от 0,5—1 до 5-104 БОЕ/ /л.
В качестве бактерии-детектора был использован штамм Е. coli В АТСС 11 303, полученный из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов. Образцы воды для экспериментальных исследований отбирали из водопроводной сети города и подвергали стерилизации путем автокла-вирования. В качестве обогатительной среды ис-
Содержание колнфага Ti в пробах исследуемой воды. Объяснения в тексте.
пользовали мясопептонный бульон (МПБ) с десятикратным содержанием соли и пептона (на 1 л мясной воды добавляли 100 г пептона и 50 г хлорида натрия).
Методика постановки эксперимента заключалась в следующем. В емкости с 1 л стерильной водопроводной воды вносили модельный колифаг до конечных концентраций 5-Ю4, 5-Ю3, 5-102, 5-Ю1, 5, 1—0,5 БОЕ/л. Экспериментально зараженные пробы воды, содержащие колифаг в концентрациях более 500 БОЕ/л (5- 10'f и 5 • 103 БОЕ/ /л), исследовали прямым выделением фага из 1 мл, содержащие 5-Ю2, MO2, 5-Ю1 БОЕ/л, прямым выделением фага из 5 мл пробы. Выделение колифагов проводили методом агаровых слоев по Грациа [3]. Параллельно пробы воды, содержащие модельный колифаг в концентрациях 5 -102, МО2, 5-101, 5 и 1—0,5 БОЕ/л, исследовали методом обогащения. Для этого из каждой исходной пробы воды отбирали аликвоты объемом 10, 20, 50, 100, 200 и 500 мл, добавляли к ним взвесь 18-часовой бактериальной культуры (Е. coli) до слабой опалисценции и 10-кратный МПБ до 10 % концентрации. После инкубации в течение 18—24 ч при 37 °С из каждой аликвоты отбирали пробы объемом 10—15 мл, обрабатывали хлороформом для освобождения от
Сравнительная оценка методов выделения колифагов из воды
Метод Количество БОЕ в 1 л при различных разведениях колнфага
1 О-2 ю"2-7 ю-3 1СГ4 Ю-".7
Обогащения Прямой 450 110 50 48 5 4 2 2
Примечание. — определения не проводили.
бактериальной флоры по общепринятой методике [4] и каждую пробу (по 1 мл) исследовали 4-кратно на наличие колифага.
Данные, полученные в эксперименте по количественному определению колифага Т| в пробах водопроводной воды, содержащей различные концентрации фаговых частиц, представлены #а рисунке. На оси абсцисс отложены разведения с различными концентрациями колифага в эк-^ спериментально зараженных пробах воды, на оси ординат: слева — содержание (в БОЕ/л) колифага в 1 л исследуемой пробы воды, справа — объемы аликвот, которые отбирали из исходной воды и исследовали прямым методом (от 1 до 5 мл) или методом обогащения (от 10до500мл); дроби: в числителе — число определений с положительным результатом (от 0 до 4), в знаменателе — общее число определений (4). Прямая отражает содержание колифага, при этом верхняя часть ее проходит через три точки, полученные прямым методом выделения колифага. Далее она проходит между точками, соответствующими 100 % выделению (4 из 4), и точками, соответствующими частичному выделений фага (3 из 4, 2 из 4, 1 из 4 определений), полученными при использовании метода обогащения объемов 10, 20, 50, 100, 200, 500 мл.
Как видно на рисунке, положительные результаты методом обогащения были получены начиная с минимальной концентрации (1 БОЕ) в исследуемом объеме. На основании результатов экспериментальных исследований была получена следующая зависимость концентрации колифага (в БОЕ/л) от объема исследуемой воды: 20 мл — 50, 50 мл — 20, 100 мл — 10, 200 мл — 5, 500 мл — 2.
Искомое количество колифага определяется по наименьшему объему, из которого был выделен колифаг. Например, при исследовании объемов 10, 20 и 50 мл положительной на колифаг окв залась проба объемом 50 мл, следовательно, концентрация колифага составляет 20 БОЕ/л; при использовании объемов 100, 200, 500 мл положи- i тельными на колифаг были пробы объемами 200 и 500 мл, концентрация колифага 5 БОЕ/л.
В экспериментах были проведены также специальные исследования по сравнительной оценке методов выделения колифагов (прямого и обогащения). Для этого исследовали пробы воды, содержащие колифаг в таких предельных концентрациях, при которых возможно еще их прямое определение (5-102 и МО2 БОЕ/л). Из проб воды с концентрацией модельного микроорганизма 5-Ю2 БОЕ/л выделяли колифаг путем прямого посева по 5 мл всего контролируемого объема — 5, 10, 20 и 50 мл. В аликвотах объемами 10, 20 и 50 мл, отобранных из исходных проб с такой же концентрацией фага, параллель- « но проводили выделение колнфага методом обогащения, как указано выше. Аналогично исследовали пробы, содержащие фаг в концентрации
1-Ю2 БОЕ/л, но при этом исследовали аликво-ты объемами 10, 20, 50 и 100 мл. Результаты, полученные при использовании двух методов, достоверно значимо не различались (см. таблицу).
Разработанный метод был апробирован в на-%фных условиях при исследовании питьевой воды централизованного и нецентрализованного ^ водоснабжения. Исследования осуществляли в октябре месяце в IV климатическом поясе. При выборе оптимальных объемов для динамического наблюдения исследуемых объемов первичный анализ проводили с использованием всех объемов, указанных на рисунке (5—500 мл). На основании полученных результатов в дальнейших исследованиях могут быть использованы только объемы 500, 200 и" 100 мл.
Исследовано 45 проб питьевой воды: 35 централизованного и 10 нецентрализованного водоснабжения. Результаты исследований показали,
что содержание колифагов в пробах составляло от 2—5 до 10—20 БОЕ/л исследуемой воды.
Внедрение методов выделения единичных колифагов из больших объемов питьевой воды позволяет подойти к их оценке как индикатора вирусного загрязнения этого объекта и разработать его регламент, обеспечивающий эпидемическую безопасность воды в отношении кишечных вирусных инфекций.
Литература
1. ГОСТ 2761—84 ОПГ. Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. Гигиенические, технические требования и правила выбора.
2. ГОСТ 17.1.5.05—80 ОПГ. Гигиенические требования к зонам рекреации водных объектов.
3. Гольдфарб Д. М. Бактериофагия. — М., 1961.
4. Методические рекомендации по санитарно-вирусологиче-скому контролю объектов окружающей среды.— М., 1982.
Поступила 02.11.86
УДК 57.083.13:519.24
'Я. А. Вакараш, А. И. Потапов, Г. И. Пономарева, В. А. Смирнов
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА МАТЕМАТИЧЕСКОГО ПЛАНИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Молдавский НИИ гигиены и эпидемиологии, Кишинев
Конструирование питательных сред для индикации микроорганизмов — возбудителей инфекционных болезней — осуществляется в основном так называемым методом «проб и ошибок», сущность которого состоит в интуитивном подборе ингредиентов сред, создающих максимум условий роста для патогенных микроорганизмов и минимум для развития сапрофитной микрофлоры. Способ создания питательных сред далек от «^совершенства. Подбср компонентов и их оптимального соотношения требует проведения большого числа опытов, кратность которых возрастает с увеличением числа компонентов среды. При этом не всегда удается выявить потенциальные возможности среды и учесть действие каждого ее компонента и их сочетания.
В последние годы при проведении научных исследований все большее применение получают математические методы планирования экспериментов с использованием матричных схем [1, 2, 4, 6—9]. Известен способ оптимизации питательных сред методом математического планирования, состоящий из двух этапов [3]. На первом этапе ставятся опыты по плану полного факторного эксперимента для определения значимости всех исследуемых факторов с учетом количественной характеристики каждого из них. После анализа полученных результатов проводится оптимизация уровней и соотношения существенных факторов на фоне выбранного постоянного уровня остальных. Однако оптимизация сред по
такой схеме громоздка, сопряжена с постановкой ряда последовательных экспериментов до получения оптимальных вариантов сред. Схема-матрица названного выше способа обширна, охватывает сравнительно большое количество ингредиентов и поэтому с успехом может быть использована при оптимизации сред многокомпонентного состава.
В литературе описан другой подход к математическому планированию экспериментов по оптимизации химико-технологических процессов, а также кинетики химических реакций [4]. Матрица эксперимента данного метода базируется на так называемом «латинском квадрате», хорошо зарекомендовавшем себя и нри оптимизации питательных сред для культур клеток.
Цель настоящей работы заключается в применении метода математического планирования эксперимента для конструирования питательных сред, используемых в медицинской микробиологии.
С использованием данного метода, а также специально разработанной программы для ЭВМ нами предпринята попытка изучить возможность оптимизации питательных сред, применяемых для индикации к диагностики инфекционных заболеваний.
Суть метода заключается в постановке опытов согласно матричной схеме, состоящей из 25 комбинаций веществ, которые берутся в 5 уровнях. Указанные варианты сред испытывают-
