CC BY
150
№ 6 - 2010 г. 14.00.00 медицинские науки
УДК 616.15:577.112.854-076
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
12 2 2
О.Н. Потеряева , Г.С. Русских , А.С. Чернышева , П.В. Мокрушников
1ГОУВПО «Новосибирский государственный медицинский университет»(г. Новосибирск) 2Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН (г. Новосибирск)
Матриксные металлопротеиназы (ММП) - эндопептидазы, участвующие в ремоделировании соединительной ткани. Деградация межклеточного матрикса необходима для протекания многих физиологических процессов: эмбриогенез,
морфогенез, ангиогенез и др. Целью исследования была отработка метода определения активности ММП в сыворотке, анализ активности ММП в крови здоровых лиц и больных с различными патологическими состояниями. Активность ММП-2,7 в образцах сыворотки крови определяли с использованием флуоресцентного субстрата. За 100 % принималось содержание ММП в сыворотке крови здоровых лиц. У больных сахарным диабетом 2 типа наблюдалось достоверное снижение активности ММП на 36 %, среди больных с низким содержанием инсулина в крови активность снижалась на 53 % по сравнению с контрольной группой. Больные с хроническими гепатитами (ХГ) без цирроза печени имели показатели активности ММП сравнимые с контрольной группой. ХГ с циррозом печени сопровождались увеличением активности ММП на 50 %. У больных с Т- и В-клеточными неходжкинскими лимфомами до лечения активность ММП возрастала на 80 %. Полихимиотерапия приводила к достоверному снижению сывороточной активности ММП, которая оставалась выше, чем в контрольной группе на 36 %. Таким образом, развитие патологических состояний сопровождается изменением активности ММП. Определение активности ферментов в сыворотке крови может служить прогностическим критерием течения заболевания.
Ключевые слова: метод определения активности матриксных металлопротеиназ в сыворотке крови
Потеряева Ольга Николаевна - доктор медицинских наук, профессор кафедры общей и биоорганической химии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», е-mail: Olga [email protected]
Русских Галина Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии НИИ биохимии СО РАМН, e-mail: Russkikh_g@ soramn.ru
Чернышева Анна Сергеевна - научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии клетки НИИ биохимии СО РАМН, e-mail: Russkikh_g@ soramn.ru
Мокрушников Павел Валентинович - кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии клетки НИИ биохимии СО РАМН, e-mail: Russkikh_g@ soramn.ru
Введение. Класс протеиназ представлен цистеиновыми, сериновыми, аспартильными и металлозависимыми протеазами. Матриксные металлопротеиназы (ММП) относятся к семейству Zn2+- и Са2+-зависимых эндопептидаз, участвующих в ремоделировании соединительной ткани посредством разрушения ее органических компонентов при физиологических значениях рН. Свое название ММП получили за способность специфически гидролизовать основные белки межклеточного матрикса [3]. Основные положения структуры, функции и регуляции ММП приведены в обзоре О. Н. Потеряевой [1]. Деградация межклеточного матрикса (ММ) необходима для протекания многих физиологических процессов: эмбриогенез, морфогенез, ангиогенез, инволюция ткани, миграция, адгезия и др. Особое место отводится ММП в процессах образования новых сосудов, связанных с инвазией, ростом и метастазированием опухоли [4]. Нарушение регулируемой деградации ММП может приводить к развитию многих патологических состояний. Установлена корреляция между протеолитической активностью ММП, их тканевыми ингибиторами и накоплением внеклеточного матрикса [2].
Целью исследования была отработка метода определения активности ММП в сыворотке крови и оценка данного показателя у практически здоровых лиц и больных с различными патологическими состояниями.
Материалы и методы исследования. Активность ММП-2,7 в образцах сыворотки крови определяли с использованием флуоресцентного субстрата МСА-Pro-Ley-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2 (ICN Biomedicals Inc., Calbiochem, USA), представляемого производителем специфическим субстратом по отношению к ММП-2,7. Однако, по мнению Nagase et al. [3], чей метод был использован в данной работе, субстрат позволяет определять общую активность всех присутствующих ММП.
Приготовление маточного раствора субстрата: 1 мг МСА растворяли в 1 мл
диметилсульфоксида. Рабочий раствор субстрата готовился ex tempore: 10 мкл субстрата растворяли в 8 мл Tris-HCl буфере, рН 7,5, содержащем 0,15 М NaCl, 10 мМ CaCl2, 0,05 % Brig-35 и 0,02 % раствор азида натрия. В качестве стандарта использовали раствор метилкумариламида (МСА) с концентрацией 1 мкмоль/л.
Ход реакции: к 200 цл рабочего раствора субстрата добавляли 20 цл неразведенной сыворотки крови, смесь инкубировали 60 мин при 37 °С. Остановку реакции проводили 900 цл 3 % раствора уксусной кислоты. Измерение проводили на спектрофлуориметре (Shimadzu RF-5301 PC, Япония) при экстинции 325 nm, эмиссии 393 nm. Активность выражали в мкмоль МСА/л/ч.
Активность (А) рассчитывали по формуле:
где Ео - экстинция опыта, Ек - экстинция контроля, С - концентрация стандарта, Vc,^ - общий объем смеси в пробирке, цл; экстинция стандарта, Vф - объем биологической жидкости, содержащей фермент, цл.
Сыворотка крови была получена у больных (сахарный диабет (СД) 2 типа, хронический гепатит), которые проходили лечение в клинике ГУ НЦКЭМ СО РАМН (гл. врач Долгова Н.А.), Городском онкогематологическом центре г. Новосибирска у больных с Т- и В-клеточными неходжкинскими лимфомами (гл. врач, д.м.н., профессор Шпагина Л.А.). Исследование проводили в соответствии с этическими нормами Хельсинской декларации (2000). У всех пациентов было получено письменное информированное согласие на проведение обследования. Группу контроля составили клинически здоровые разовые доноры.
Концентрацию инсулина в сыворотке крови измеряли конкурентным методом ИФА («DRG», Германия). Биохимические показатели сыворотки крови измеряли на автоанализаторе КОНЕЛАБ (ТермоЛабСистем, США).
Полученные результаты обрабатывали с использованием пакета программ STATISTICA (ver. 6.0). Определяли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (m); различия между группами оценивали с помощью t - критерия Стьюдента и считали значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования. ММП являются секреторными ферментами, в структуре всех представителей имеется сигнальный пептид необходимый для успешной секреции ММП из клетки [1]. Это обстоятельство позволяет судить об активности фермента при исследовании сыворотки крови.
Данные активности ММП были выражены в процентах в связи с тем, что исследование проводилось в течение нескольких лет (2004-2010), использовались субстраты различных фирм, измерение проводилось на различных приборах. За 100 % принималось содержание ММП в сыворотке крови контрольной группы (см. табл.).
Активность ММП при различных патологических состояниях
№ Больные Активность ММП, % Достоверность
1 Контрольная группа (п = 40) 100,0 ± 9,2 —
2 СД 2 типа (п= 56) 64,0 ± 12,0 Р1-2 < 0,05
3 СД 2 типа с низким содержанием инсулина (п = 31) 47,0 ± 36,5 Р1-3 < 0,001
4 Хронический гепатит без цирроза печени (п = 24) 98,0 ± 11,6 —
5 Хронический гепатит с циррозом печени (п = 19) 150,4 ± 14,0 Р1-5 < 0,001
6 Т- и В-клеточные неходжкинские лимфомы (п = 31) 179,6 ± 18,0 Р1-6 < 0,001
7 Неходжкинские лимфомы с благоприятным исходом до лечения (п = 15) 212,5 ± 17,5 Р1-7 < 0,001
8 Неходжкинские лимфомы с благоприятным исходом после полихимиотерапии (п = 15) 136,5± 14,0 Р1-8 < 0,05 Р7-8 < 0,05
У больных СД 2 типа наблюдалось достоверное снижение активности ММП на 36 %. Среди больных были выделены две группы: первая - с высоким и вторая - с низким содержанием инсулина в крови. Концентрация инсулина в 1-й группе - 1700 ± 230 пкмоль/л; во 2-й - 232 ± 80,9 (Р < 0,01). У больных второй группы наблюдали большее снижение активности ММП (на 53 %) по сравнению с контрольной группой.
Больные с хроническими гепатитами (ХГ) без цирроза печени имели показатели активности ММП сравнимые с контрольной группой. У больных ХГ с циррозом печени наблюдали увеличение активности ММП на 50 %.
У больных с Т- и В-клеточными неходжкинскими лимфомами (до лечения) наблюдали увеличение активности ММП на 80 %. Среди них были выделены группы больных с благоприятным и неблагоприятным исходом течения заболевания. В группе больных с благоприятным исходом (до лечения) увеличение активности было в два раза выше по сравнению с контрольной группой. После полихимиотерапии в этой группе наблюдали достоверное снижение сывороточной активности ММП, которое оставалось выше, чем в контрольной группе на 36 %.
Выводы. Развитие патологических состояний сопровождается изменением активности ММП. Хронический гепатит, трансформирующийся в цирроз, характеризуется повышением активности ММП-2,7, которое коррелирует с появлением холестаза у больных (увеличение общего билирубина и активности щелочной фосфатазы, R = 0,9). У больных СД 2 типа наблюдается достоверное снижение активности ММП, причем значительное снижение активности фермента коррелирует со снижением в крови С-пептида (R = 0,8). У больных с лимфопролиферативными заболеваниями наблюдали увеличение активности ММП по сравнению с группой контроля. Самая высокая активность наблюдалась в группе пациентов с благоприятным прогнозом. После лечения активность фермента снижалась. Полученные данные свидетельствуют об участии ММП в патогенезе многих заболеваний. Определение активности ММП в сыворотке крови может служить прогностическим критерием течения заболевания.
Список литературы
1. Потеряева О.Н. Матриксные металлопротеиназы : строение, регуляция, роль в развитии патологических состояний (обзор литературы) / О. Н. Потеряева // Медицина и образование в Сибири : электронный научный журнал. - 2010. - № 5. - Режим доступа: (http://ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=449)
2. Baker A. B. Metalloproteinase inhibitors : biological actions and therapeutic opportunities / A. Baker, D. Edwards, G. Murphy // J. Cell. Science. - 2002. - Vol. 115. - P. 3719-3727.
3. Nagase H. Matrix Metalloproteinases / H. Nagase, J. Woessner // J. Biol Chem. -1999. - Vol. 274, N 31. - Р. 21491-94.
4. Visse R. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases : structure, function, and biochemitry / R. Visse, H. Nagase // Circulation Res. - 2003. - N 2. - P. 827-839.
METHOD FOR MARTIX PROTEINAS ACTION DETERMINATION IN BLOOD SERUM
12 2 2
O.N. Poteryaeva , G.S. Russkikh , J.S. Chernysheva , P.V. Mokrushnikov
1SEIHPE “Novosibirsk State Medical University ” (c. Novosibirsk)
2Institution of Russian Medical Sciences Academy Scientific-Research Institute of biochemistry SD RAMS (c. Novosibirsk)
Matrix metal-proteinases (MMP) - endopeptidases, are participating in re-modeling of connective tissue. Degradation of inter-cellular matrix is necessary for physiological processes vitality : embryogenesis, morphogenesis, angiogenesis etc. The aim of research was to practice the method for MMP activity in serum, analysis of MMP activity in healthy people's blood and in patients' with different pathological states. Activity of MMP-2,7 is determined in serum samples with fluorescent substance. Contents of MMP in blood serum of healthy people was equal to 100 %. Patients with diabetes of type 2 fairly showed 36 % MMP activity reduction, patients with low insulin in blood showed 53 % activity reduction compared to control group. Patients with chronic hepatitis (CG) without liver cirrhosis had MMP activity level compared to the control group. CG with liver cirrhosis were followed by 50 % MMP activity increase. In patients with T- and B-cell non- Hodgkin lymphomas MMP activity showed 80 % increase before treatment. Poli - chemotherapy resulted in MMP true serum activity reduction, remaining 36 % higher than in control group. So, the change of MMP activity influences the development of pathological states. The definition of fermentation activity in serum may be the prognostic criteria of disease's course.
Keywords: method for determination of matrix proteinases' activity in blood serum
About authors:
Poteryaeva Olga Nikolaevna - doctor of medical sciences, professor of General and bio-organic chemistry department SEI HPE «Novosibirsk State Medical Uninersity», e-mail: Olga [email protected]
Russkikh Galina Sergeevna - candidate of biological sciences, senior scientific worker at the laboratory of medical biotechnology NRI of biochemistry SD RAMS, e-mail: Russkikh_g@ soramn.ru
Chernysheva Anna Sergeevna - scientific worker at the laboratory of molecular cell biology SRI of biochemistry SD RAMS, e-mail: [email protected]
Mokrushnikov Pavel Valentinovich - candidate of physical - mathematic sciences, senior scientific worker at laboratory of molecular cell biology NRI of biochemistry SD RAMSPAMH, e-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Poteriaeva O.N.Matrix proteinases : structure, regulation, role in the development of
pathological states(literature review) O.N. Poteryaeva // Medicine and Education in Siberia :electronic scientific journal. - 2010. - № 5. - Access
regimen:(http://ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=449)
2. Baker A. B. Metalloproteinase inhibitors : biological actions and therapeutic opportunities / A. Baker, D. Edwards, G. Murphy // J. Cell. Science. - 2002. - Vol. 115. - P.3719-3727.
3. Nagase H. Matrix Metalloproteinases / H. Nagase, J. Woessner // J. Biol Chem. - 1999. -Vol. 274, N 31. - P. 21491-94.
4. Visse R. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases : structure, function, and biochemitry / R. Visse, H. Nagase // Circulation Res. - 2003. - N 2. - P. 827-839.
