CC BY
69
№ 5 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 615.276-099:615.244
ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ВОДНО-СПИРТОВОГО ЭКСТРАКТА ДИСПЕРГИРОВАННОЙ БЕРЕСТЫ ПРИ ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ ПАРАЦЕТАМОЛОМ
О. Р. Грек1. В. В. Ивановаы. М. А. Карпов1, Ю. В. Лигостаева1. В. И. Шарапов1.
О. Н. Потеряева13. А. В. Шишканова1
1ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск) 2ГБУЗ НСО «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи № 2»
(г. Новосибирск) 3ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН (г. Новосибирск)
В эксперименте на крысах с токсическим гепатитом, вызванным ацетаминофеном, изучено гепатозащитное действие водно-спиртового экстракта, полученного из предварительно диспергированной бересты (ЭБД) с размером частиц от 100 до 400 нм. Животные были разделены на 4 группы по 10 особей в каждой. Животным I группы вводили парацетамол, II группы — карсил в дозе 100 мг/кг, III группы — ЭБД в дозе 100 мг/кг, IV группы — служили позитивным контролем. ЭБД и препарат сравнения карсил профилактически вводили в течение 3-х суток однократно; на 4-е и 5-е сутки в/ж вводили парацетамол в дозе 200 мг/кг; на 7-е сутки после введения парацетамола животных выводили из эксперимента. В крови определяли активность АлТ, содержание белковых фракций, активность металлопротеаз (ММП-2,7). В срезах печени подсчитывали численную плотность двуядерных гепатоцитов (N81), объемные плотности (¥у) очагов некрозов и дистрофически измененных гепатоцитов. Полученные данные свидетельствуют о способности ЭБД стимулировать репаративный процесс в паренхиме печени крыс в большей степени по сравнению с эффектом препарата карсил, что связано не только с усилением процесса деления гепатоцитов, но и, вероятно, активированием внутриклеточных процессов репаративной регенерации.
Ключевые слова: парацетамол, токсический гепатит, экстракт диспергированной бересты, карсил.
Грек Олег Рувимович — доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 236-09-02
Иванова Виктория Валерьевна — аспирант кафедры фармакологии ГБОУ ВПО
«Новосибирский государственный медицинский университет», врач ультразвуковой диагностики ГБУЗ НСО «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи № 2», e-mail: vik02051982@ya.ru
Карпов Михаил Александрович — кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-09-02
Лигостаева Юлия Валерьевна — аспирант кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: benna89@mail.ru
Шарапов Виктор Иванович — доктор медицинских наук, профессор кафедры медицинской химии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-65-41
Потеряева Ольга Николаевна — доктор медицинских наук, профессор кафедры медицинской химии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии ФГБУ «НИИ биохимии», e-mail: Olga_Poteryaeva@mail.ru
Шишканова Алевтина Владимировна — кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 236-09-02
Введение. В сухом экстракте бересты содержится более 70 % бетулина — пентациклического тритерпенового спирта ряда лупана. Как было установлено, бетулин и его производные обладают широким спектром фармакологической активности — противовоспалительной, гепатозащитной, антитоксической, противоопухолевой и др. [1, 2]. С целью увеличения выхода экстрактивных веществ нативная береста подвергалась механическому измельчению до размеров фракций от 100 до 400 нм с последующим получением водно-спиртового экстракта.
Цель исследования: изучить влияние сухого экстракта, полученного после предварительного диспергирования нативной бересты на модели острого токсического повреждения печени, вызванного внутрижелудочным введением парацетамола.
Материалы и методы. Исследовали гепатотропное действие водно-спиртового экстракта, полученного из предварительно диспергированной бересты (ЭБД) с размером частиц от 100 до 400 нм. Токсическое поражение печени моделировали у крыс-самцов массой 200-250 г путем внутрижелудочного (в/ж) введения парацетамола в крахмальной слизи.
Животные были разделены на 4 группы по 10 особей в каждой. Животные I группы получали только парацетамол (негативный контроль), II группы — препарат сравнения карсил в дозе 100 мг/кг (референсная группа), III группы — экстракт диспергированной бересты (ЭБД) в дозе 100 мг/кг, IV группы — служили позитивным контролем (интактные животные). ЭБД и препарат сравнения карсил («Sopharma») профилактически вводили в течение 3-х суток однократно; на 4-е и 5-е сутки в/ж вводили парацетамол (ОАО «Верофарм») в дозе 200 мг/кг; на 7-е сутки после введения парацетамола животных выводили из эксперимента.
Перед декапитацией животных лишали корма на 12 ч, забор материала проводили в утренние часы. Все манипуляции с лабораторными животными проводили, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1986). Животных содержали в пластмассовых клетках (по 10 особей) в стандартных условиях вивария при естественном освещении, на гранулированном комбикорме «ПК 120-3» («Лабораторснаб») и воде ad libitum. Животных декапитировали под эфирным наркозом.
В сыворотке крови измеряли активность матриксных металлопротеаз (ММП-2,7) по методу Nagase et al. (1994), белковые фракции оценивали методом электрофореза на ацетат-целлюлозных пленках, общий белок определяли биуретовым методом. Концентрацию билирубина, мочевины, АлТ определяли с использованием наборов (PLIVA-Lachema Diagnosticum, Чехия). Для светооптического исследования печени ткань фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Для дальнейшей гистологической обработки вырезали из большой доли печени образцы толщиной 5-7 мм путем поперечного рассечения, подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе MICROM («Карл Цейс», Германия): обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации с последующей заливкой в парафиновые блоки. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином Лилли-Майера и 1 % эозином на автомате HMS-70 (время окраски — 1 ч 15 мин). Морфометрию выполняли в соответствии с ранее разработанными морфометрическими методами и критериями [4, 5]. При помощи морфометрической сетки из 25-ти точек (16 квадратов), вставленной в окуляр, подсчитывали численную плотность двуядерных гепатоцитов (Nai) в паренхиме печени на единицу тестовой площади 1600 мкм2, объемные плотности (Vv) очагов некрозов и дистрофически измененных гепатоцитов.
Статистическую обработку данных проводили методами параметрической статистики с использованием пакета программ Microsoft Excel с определением среднего значения (M), ошибки среднего (m). Различия между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента t. Результаты считали достоверными при p < 0,05.
Результаты исследования. На 7-е сутки после введения парацетамола в сыворотке крови снижается содержание альбумина (48,82 ± 0,97 — 41,81 ± 0,87; р < 0,001) и у-глобулина (13,23 ± 0,57 — 10,71 ± 0,58; р < 0,01) по сравнению с контролем.
На фоне профилактического введения карсила и ЭБД концентрация альбумина в сыворотке крови повышается (парацетамол — 41,81 ± 0,87; карсил + парацетамол 46,06 ± 0,93; р < 0,01; ЭБД + парацетамол — 44,19 ± 0,8; р < 0,01). В отличие от группы крыс с введением карсила, профилактическое введение ЭБД не сопровождается снижением содержания в сыворотке у-глобулина (карсил + парацетамол — 9,9 ± 0,55; ЭБД + парацетамол — 11,1 ± 0,79). При введении парацетамола активность АлТ в сыворотке повышалась в 4,2 раза по сравнению с группой контроля (2,31 ± 0,29 и 0,55 ± 0,05 ммоль/л/час, р < 0,05 соответственно), содержание прямого билирубина увеличивалось на 63 %, мочевины — на 22,3 % по сравнению с контролем (р < 0,05).
На фоне профилактического введения карсила активность АлТ снижалась в 2 раза, содержание мочевины — в 1,4 раза, концентрация прямого билирубина оставалась повышенной. Профилактическое введение ЭБД приводило к снижению активности АлТ в сыворотке в 2,2 раза, содержание прямого билирубина — в 3,4 раза, мочевины — в 1,6 раза. Активность в сыворотке ММП-2,7 при введении парацетамола возрастала до 259,7 ± 14,7 по сравнению с контролем 190,4 ± 11,35; р < 0,001. На фоне профилактического введения карсила парацетамол не вызывал достоверных изменений активности ММП-2,7 (контроль — 190,4 ± 11,35; карсил + парацетамол — 180,9 ± 7,22; р
> 0,05). Профилактическое введение ЭБД сопровождалось дальнейшим снижением активности ММП-2,7 (контроль — 190,4 ± 11,35; ЭБД + парацетамол — 171,0 ± 2,77). Внутрижелудочное введение парацетамола крысам на 7-е сутки сопровождалось выраженными деструктивными изменениями в паренхиме печени крыс. Макроскопически печень у животных 1-й группы была тусклой, дряблой по консистенции. При гистологическом исследовании печени животных 1-й группы обнаруживали обширные поля центролобулярных некрозов, объёмная плотность которых достигала 49 %, а объёмная плотность гепатоцитов в состоянии вакуольной дистрофии, вплоть до баллонной дистрофии, составляла 43,9 % (см. табл.). При этом численная плотность двуядерных гепатоцитов была на 15 % меньшей, в сравнении с величиной аналогичного показателя у интактных животных, свидетельствуя об угнетении процесса репаративной регенерации на клеточном уровне в печени у крыс, получавших парацетамол.
Токсическое повреждение печени крыс парацетамолом на фоне предварительного введения водно-спиртового ЭБД (М ± т)
Группы животных № групп Дистрофия гепатоцитов, У^, % Некроз гепатоцитов, Уу1, % Нормальная ткань, % Двуядерные гепатоциты, ^
Контроль парацетамол 1 49,13 ± 1,91 43,91 ± 2,49 6,96 ± 0,89 1,43 ± 0,03
Карсил + парацетамол 2 69,22 ± 1,31 18,48 ± 1,05 12,3 ± 1,08 2,63 ± 0,14 Р1-2 < 0,05
ЭБД + парацетамол 3 64,06 ± 1,67 Р2-3 < 0,05 16,4 ± 0,55 Р2-3 > 0,05 19,54 ± 1,17 Р2-3 < 0,05 3,17 ± 0,17 Р2-3 < 0,05
Контроль интактные 4 2,11 ± 0,65 0,09 ± 0,15 97,8 ± 0,65 1,68 ± 0,11
У животных 2-й и 3-й групп макроскопически печень была плотно-эластической консистенции и имела красно-коричневую окраску. Некротизированные гепатоциты встречались диссеминированно в центральных отделах печеночных долек, на их периферии, а также перисинусоидально. Объёмная плотность некрозов гепатоцитов была в 2,4 и в 2,7 раз соответственно меньшей, в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных 1-й группы. При этом в паренхиме печени животных 2-й и 3-й групп преобладали дистрофические изменения гепатоцитов в виде мелко-и крупновакуольной дистрофии. Примечательно, что в паренхиме печени животных 3-й группы объёмные плотности некрозов и дистрофически измененных гепатоцитов были на 11,3 и 7,5 % соответственно меньшими, в сравнении с таковыми у животных 2-й группы. Объёмная плотность неизмененных гепатоцитов у животных, которым профилактически вводили ЭБД, была на 37 % большей, чем у животных с предварительным введением карсила, при этом и численная плотность двуядерных гепатоцитов у крыс, получавших ЭБД, было на 7 % больше в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных, получавших карсил.
Обсуждение результатов. Данные эксперимента свидетельствуют о менее выраженных токсических эффектах парацетамола на фоне профилактического введения как карсила, так и ЭБД, очевидно, в связи со стимулированием репаративного процесса в паренхиме печени, что подтверждается большей численной плотностью двуядерных гепатоцитов в печени животных 2-й и 3-й групп (в 1,8 и в 2,8 раз соответственно), в сравнении с таковой у животных 1-й группы и интактных животных.
Полученные данные свидетельствуют также о способности ЭБД стимулировать
репаративный процесс в паренхиме печени крыс в большей степени при сравнении с эффектом препарата сравнения карсилом, что связано не только с усилением процесса деления гепатоцитов, но и, вероятно, активированием внутриклеточных процессов репаративной регенерации. Снижение активности в крови индикаторного фермента цитолиза — аланинаминотрансферазы и большая сохранность белоксинтетической функции также свидетельствуют о значительном снижении токсического действия парацетамола на ткань печени в условиях предварительного введения ЭБД и карсила.
В литературе активно обсуждается роль матриксных металлопротеаз как индикаторов деструктивных процессов [6-9]. Нами показано значительное повышение в крови активности ММП-2,7 после введения парацетамола, что коррелирует с тяжестью поражения печени. Парацетамол на фоне профилактического введения ЭБД и карсила не вызывал гиперпродукции матриксных металлопротеаз. Активность ММП-2,7 на фоне карсила сохранялась на уровне интактных, на фоне ЭБД была ниже на 11 % чем у интактных, что свидетельствует о снижении деструктивных процессов в печени при острой интоксикации ацетаминофеном. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности ЭБД стимулировать репаративный процесс в паренхиме печени крыс в большей степени при сравнении с эффектом используемого лекарственного средства карсил, что связано не только с усилением процесса деления гепатоцитов, но и, вероятно, активированием внутриклеточных процессов репаративной регенерации.
Списоклитературы
1. Влияние бетулоновой кислоты и её производного (3-оксо-20-лупен-28-оил)-3-аминопропионовый кислоты на структуру печени мышей
с лимфомой RLS / Н. А. Жукова, Д. Е. Семенов, И. В. Сорокина [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2005. — Т. 140, № 9. — С. 348-351.
2. Изучение гепатопротекторного действия растительного экстракта бересты при экспериментальном гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом [Электронный ресурс] / В. В. Иванова, Ю. В. Лигостаева, О. Н. Потеряева [и др.] // Фундаментальные исследования. — 2013. — № 3. — URL :
http://rae.m/fs/?section=content&op=show_article&article_id=10000536
3. Nagase H. Design and characterization of a fluorogenic substrate selectively hydrolyzed by stromelys 1 (matrix metalloproteinase-3) / H. Nagase, C. G. Fields, G. B. Fields // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269, N 33. — P. 20952-20957.
4. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия : руководство / Г. Г. Автандилов. — М. : Медицина, 1990. — 384 с.
5. Шкурупий В. А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терапия / В. А. Шкурупий. — М. : Изд-во РАМН, 2007. — 536 с.
6. Collagenase, cathepsin B and cathepsin L gene expression in the synovial membrane
of patients with early inflammatory arthritis / G. Cunnane [et al.] // Rheumatology. — 1999.
— Vol. 38. — P. 34-42.
7. Circulating Matrix Metalloproteinases 1, 2, 9 and Their Inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 as Serum Markers of Liver Fibrosis in Patients With Chronic Hepatitis C: Comparison With PIIINP and Hyaluronic Acid / V. Leroy [et al.] // American J. Gastroenterology. — 2004.
— Vol. 99. — P. 271-276.
8. Evaluation of a panel of non-invasive serum markers to differentiate mild from moderate-to-advanced liver fibrosis in chronic hepatitis C patients / K. Patel [et al.] // J. Hepatol. — 2004. — Vol. 41, N 6. — P. 935-942.
9. Matrix Metalloproteinases 2 and 9 Are Markers of Inflammation but Not of the Degree
of Fibrosis in Chronic Hepatitis C / S. Reif [et al.] // Digestion. — 2005. — Vol. 71, N 2. — P. 124-130.
HEPATOPROTECTIVE EFFECT OF AQUEOUS-ALCOHOLIC EXTRACT OF DISPERSED BIRCH BARK AT ACUTE POISONING WITH PARACETAMOLUM
O. R. Grek1. V. V. Ivanova1-2. M. A. Karpov1. Y. V. Ligostaeva1. V. I. Sharapov1. O. N. Poteryaeva13.
A. V. Shishkanova1
1SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.) 2SBHE NR «City clinical hospital of emergency medical service № 2» (Novosibirsk c.) 3FSBE «Scientific Research Institute of Biochemistry» (Novosibirsk c.)
Hepatoprotective effect of aqueous-alcoholic extract received from previously dispersed birch bark (EBB) with a size of particles from 100 to 400 nanometers is studiedn experiment on rats with the toxic hepatitis caused by acetaminophen. Animals were divided into 4 groups on 10 individuals in everyone. Animal of the I groups were injected Paracetamolum, the II groups — carsil in a dose of 100 mg/kg, the III groups — EBB in a dose of 100 mg/kg, the IV groups — served as positive control. EBB and preparation of comparison called carsil was preventively injected within 3 days once; on the 4th and 5th days i/v Paracetamolum in a dose of 200 mg/kg; for the 7th day after Paracetamolum introduction to animals brought out of experiment. ALT activity, maintenance of albuminous fractions, activity of metalproteases (MMP-2,7) was defined in blood. In sections of liver numerical density of two-nuclear hepatocytes (Nai), volume densities (Vv) of necroses centers and dystrophically changed hepatocytes were counted. The obtained data testify to EBB ability to stimulate reparative process in parenchyma of liver at rats more in comparison with effect of carsit preparation that is connected not only with intensifying of process of division of hepatocytes, but also with probably activation of intracellular processes of reparative neogenesis.
Keywords: Paracetamolum, toxic hepatitis, extract of dispersed birch bark, carsit.
About authors:
Grek Oleg Ruvimovich — doctor of medical science, professor, head of pharmacology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 236-09-02
Ivanova Victoria Valerievna — post-graduate student of pharmacology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», ultrasonographer at SBHE NR «City clinical hospital of emergency medical service № 2», e-mail: vik02051982@yandex.ru
Karpov Mikhail Aleksandrovich — candidate of medical sciences, senior teacher of pathological anatomy chair of at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 225-09-02
Ligostayeva Julia Valerievna — post-graduate student of pharmacognosy and botany chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: benna89@mail.ru
Sharapov Victor Ivanovich — doctor of medical sciences professor of medical chemistry chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 222-66-541
Poteryaeva Olga Nikolaevna — doctor of medical science, professor of medical chemistry chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», leading researcher of molecular biology laboratory at FSBE «Scientific Research Institute of Biochemistry», e-mail: olga_poteryaeva@mail.ru
Shishkanova Alevtina Vladimirovna — candidate of medical science, senior teacher of chair of pharmacology, clinical pharmacology and evidentiary medicine at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 236-09-02
List of the Literature:
1. Influence of betulon acid and its derivative (3-oxo-20-lupen-28-oil) — acid 3-aminopropion on structure of liver of mice with RLS lymphoma / N. A. Zhukova, D.E. Semenov,
I. V. Sorokina [etc.] // Bulletin exper. biology and medicine. — 2005. — V. 140, № 9. — P. 348-351.
2. Studying of hepatoprotective effect of plant extract of birch bark at the experimental hepatitis caused by four-chloride Carboneum [electron resource] / V. V. Ivanova,
Y. V. Ligostayeva, O. N. Poteryaeva [etc.] // Basic researches. — 2013. — № 3. — URL: http://rae.ru/fs/? section=content&op=show_article&article_id=10000536
3. Nagase H. Design and characterization of a fluorogenic substrate selectively hydrolyzed by stromelys 1 (matrix metalloproteinase-3) / H. Nagase, C. G. Fields, G. B. Fields // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269, N 33. — P. 20952-20957.
4. Avtandilov G. G. Medical morphometry: guidance / G. G. Avtandilov. — M.: Medicine, 1990.
— 384 P.
5. Shkurupy V. A. Tuberculosis granulomatosis. Cytophysiology and address therapy / V. A. Shkurupy. — M.: Publishing house of the Russian Academy of Medical Science, 2007.
— 536 P.
6. Collagenase, cathepsin B and cathepsin L gene expression in the synovial membrane
of patients with early inflammatory arthritis / G. Cunnane [et al.] // Rheumatology. — 1999.
— Vol. 38. — P. 34-42.
7. Circulating Matrix Metalloproteinases 1, 2, 9 and Their Inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 as Serum Markers of Liver Fibrosis in Patients With Chronic Hepatitis C: Comparison With PIIINP and Hyaluronic Acid / V. Leroy [et al.] // American J. Gastroenterology. — 2004.
— Vol. 99. — P. 271-276.
8. Evaluation of a panel of non-invasive serum markers to differentiate mild from moderate-to-advanced liver fibrosis in chronic hepatitis C patients / K. Patel [et al.] // J. Hepatol. — 2004. — Vol. 41, N 6. — P. 935-942.
9. Matrix Metalloproteinases 2 and 9 Are Markers of Inflammation but Not of the Degree
of Fibrosis in Chronic Hepatitis C / S. Reif [et al.] // Digestion. — 2005. — Vol. 71, N 2. — P. 124-130.
