CC BY
43
№ 3 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 577.112.854/.856:576.382-018.46
ВЛИЯНИЕ ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ НА СЕКРЕЦИЮ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ КЛЕТКАМИ КОСТНОГО МОЗГА
Т. А. Ткаченко1. А. Ю. Печенкина1. О. Н. Потеряева12. Г. С. Русских1. А. Н. Дударев1. С. В.
Давыденко1. И. Ф. Усынин1
ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН (г. Новосибирск) 2ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
Матриксные металлопротеиназы (ММП) участвуют в ремоделировании соединительной ткани. Целью исследования было изучение влияния липопротеинов, аполипопротеина А-! (апо А-1), интерлейкина-3 (ИЛ-3), тетрагидрокортизола, дегидроэпиандростеронсульфата и их комплексов на активность ММП клетками костного мозга. Активность ММП определяли флуоресцентным субстратом. Установлено, что при добавлении к клеткам гормонов и ИЛ-3 активность фермента в среде инкубации увеличивалась в 1,5 раза, апо А-1 и их комплексов секреция ММП возрастала более чем в 3 раза. Впервые показано, что апо А-1 наряду с цитокинами и гормонами является важным фактором, регулирующим секрецию ММП в костном мозге.
Ключевые слова: липопротеины крови, аполипопротеин А-1, матриксные металлопротеиназы, тетрагидрокортизон, интерлейкин-3, дегидроэпиандростеронсульфат.
Ткаченко Татьяна Александровна — аспирант, младший научный сотрудник, ФГБУ «НИИ биохимии», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Печенкина Анна Юрьевна — аспирант, младший научный сотрудник, ФГБУ «НИИ биохимии», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Потеряева Ольга Николаевна — доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской химии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: [email protected]
Русских Галина Сергеевна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУ «НИИ биохимии», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Дударев Алексей Николаевич — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУ «НИИ биохимии», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 333-54-81,
e-mail: [email protected]
Давыденко Сергей Владимирович — аспирант, младший научный сотрудник, ФГБУ «НИИ биохимии», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Усынин Иван Федорович — доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной биологии клетки ФГБУ «НИИ биохимии», г. Новосибирск, рабочий телефон: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Введение. Семейство матриксных металлопротеиназ (ММП) состоит из 20-ти энзимов, способных расщеплять почти все компоненты внеклеточного матрикса соединительных тканей. ММП относятся к семейству цинк- и кальций-зависимых эндопептидаз. Эти ферменты играют важную роль во многих физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, морфогенез, репродукция и ремоделирование тканей, дифференцировка и пролиферация клеток, а также в различных патологических процессах: артритах, сердечно-сосудистых заболеваниях, злокачественном росте и др. Синтезируются и секретируются ММП рядом клеток: фибробластами, эпителиальными клетками, фагоцитами, лимфоцитами и онкогенно-трансформированными клетками. За способность этих ферментов специфически гидролизовать основные белки внеклеточного матрикса они и получили своё название ММП [8]. По структурной организации и субстратной специфичности ММП можно разделить на коллагеназы (ММП-1, -8 и -13), желатиназы (ММП-2 и -9) и стромелизины (ММП-3 и -10). Они могут различаться способом активации проферментов и особенностями взаимодействия с эндогенными ингибиторами [3].
Ранее в НИИ биохимии было показано, что липопротеины высокой плотности в комплексе со стероидными гормонами значительно усиливают скорость биосинтеза белка и ДНК в клетках печени. Механизм этого явления связан с участием резидентных макрофагов в метаболизме плазменных липопротеинов и гормонов, что сопровождается образованием биологически активных продуктов — апопротеина А-1 (апо А-1) и тетрагидрокортизола (ТГк), оказывающих регуляторное влияние на экспрессию генов в паренхимных клетках. Не исключено, что подобный механизм активации клеток с участием липопротеинов может иметь место и в других тканях [7].
Цель исследования: изучить влияние липопротеинов плазмы крови, апо А-1 (основного белкового компонента ЛПВП), интерлейкина-3 (ИЛ-3), тетрагидрокортизола, дегидроэпиандростеронсульфата (ДГЭА-С) и их комплексов на активность ММП в культуре клеток костного мозга.
Материалы и методы исследования. Исследования были проведены на самцах половозрелых крыс линии Вистар массой 200-250 г, полученных из вивария СО РАМН (г. Новосибирск). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755).
Под лёгким эфирным наркозом крыс декапитировали. В стерильных условиях клетки костного мозга выделяли из бедренной кости и ресуспендировали в обогащённой среде ЯРМ1-1640. Подсчёт выделенных клеток проводили в камере Горяева. Клетки костного
мозга культивировали в 24-луночных планшетах при 37 °С в СО2-инкубаторе.
Плазма крови была получена от пациентов клиники ГУ НЦКЭМ СО РАМН с их согласия на дальнейшие исследования, согласно этическим стандартам, разработанным в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации 1964 года.
Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) выделяли из плазмы крови методом ультрацентрифугирования, основанным на процедуре, предложенной Хавелом и соавт. [7]. Плотность плазмы доводили до нужного значения путём добавления раствора бромистого калия. Центрифугирование проводили на ультрацентрифуге «Optima L-90K, Beckman-Coulter» (Австрия) с использованием ротора 70.1 Ti при 40 000 об/мин 24 ч. Получали три основные фракции липопротеинов: ЛПОНП (0,94 < d < 1,006 г/мл), ЛПНП (1,006 < d < 1,063 г/мл) и ЛПВП (1,063 < d < 1,21 г/мл). Делипидирование липопротеинов проводили методом экстракции смесью бутанол-диизопропиловый эфир (1:3) из расчёта 2 объёма смеси на 1 объём раствора ЛПВП с последующим центрифугированием [4, 6]. Полученный белок диализовали против фосфатного буфера 24 ч, стерилизовали фильтрованием и хранили при —20 °С. Чистоту изолированного белка оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле [8].
Активность ММП-2,7 в полученном материале определяли с использованием флуоресцентного субстрата МСА-Pro-Ley-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2 (Calbiochem, США) по методу Nagase et al. [5]. В качестве стандарта использовали раствор метилкумариламида (МСА). Активность ММП выражали в мкмоль МСА/л/ час.
Полученные результаты обрабатывали с использованием пакета программ STATISTICA (ver. 6.0). Определяли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (m); различия между группами оценивали с помощью t — критерия Стьюдента и считали значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования. В бессывороточной среде клетки костного мозга спонтанно секретируют ММП, активность которой через 24 часа составила 9,8 ± 0,71 мкмоль/л/час. При культивировании клеток костного мозга с ЛПОНП активность ММП имела максимальное значение — 14,5 ± 1,75 мкмоль/л/час. Добавление ЛПНП к клеткам в среде инкубации увеличивало секрецию фермента и составило 13,1 ± 1,1 мкмоль/л/час. ЛПВП не изменяли активность фермента ММП и оставались на уровне контроля — 10,8 ± 0,68 мкмоль/л/час (рис. 1).
1£ -
III
Контроль ЛПОНП ЛПНП
Рис. 1. Влияние ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП на секрецию ММП с клетками костного мозга
При добавлении к клеткам костного мозга ТГк (10-6 М) или апо А-I (20 мкг/мл) активность фермента в среде инкубации увеличивалась в 1,5 (16,9 ± 0,92 мкмоль/л/час, р < 0,05) и в 3 раза (26,1 ± 1,32 мкмоль/л/час, р < 0,01) соответственно. Липопротеины плазмы крови, наряду с транскортином, являются важной транспортной формой стероидных гормонов [2]. Учитывая данный факт, нами были исследовано влияние апо А-I и ТГк на секрецию ММП клетками костного мозга. Предварительное связывание апо А-I с гормоном приводило к увеличению активности фермента — 28,0 ± 1,21 мкмоль/л/час, р < 0,01. При добавлении к клеткам ДГЭА-С (10-6 М) активность фермента в среде инкубации составляла 15,7 ± 4,8 мкмоль/л/час, но в комплексе ДГЭА-С + апо А-I активность увеличивалась до 35,5 ± 6,0 мкмоль/л/ час, р < 0,01. Добавление ИЛ-3 (10-6 М) к клеткам костного мозга приводило к увеличению секреции ММП, активность составила 17,4 ± 1,51 мкмоль/л/час, тогда как совместное введение ИЛ-3 + апоА-I увеличивало активность до 22,1 ± 2,10 мкмоль/л/час, р < 0,01 (рис. 2).
Рис. 2. Влияние апо А-!, ТГк, ИЛ-3, ДГАЭ-С и их комплексов на секрецию ММП клетками костного мозга: 1) контроль; 2) апо А-1; 3) ТГк; 4) комплекс апо А-1 + ТГк; 5) ДГАЭ-С; 6) комплекс апо А-1 + ДГАЭ-С; 7) ИЛ-3; 8) комплекс апо А-1 + ИЛ-3
Выводы. ММП являются секреторными ферментами, в структуре которых имеется сигнальный пептид необходимый для успешной секреции ММП из клетки [3], что позволяет сделать вывод об активности фермента в клетках костного мозга. Апо А-1 увеличивает секрецию ММП в костном мозге, причем его эффект превосходит действие ТГк. Комплекс апо А-1 с ТГк обладает высокой биологической активностью, усиливая секрецию ММП вдвое в клетках костного мозга.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что липопротеины крови и апопротеин А-1, наряду с цитокинами и гормонами, являются важным фактором, регулирующим секрецию ММП в костном мозге. Причём во всех случаях его эффект превосходит действие гормонов (ТГК и ДГЭА-С), ИЛ-3 или увеличивает их действие при совместном введении. Стимулирующее влияние белка на продукцию инсулина и секрецию ММП в островках Лангерганса, изолированных из поджелудочной железы крыс, нами было показано ранее [1].
Список литературы
1. Панин Л. Е. Влияние плазменных липопротеинов на секрецию инсулина островками Лангерганса поджелудочной железы / Л. Е. Панин, О. Н. Потеряева, Г. С. Русских // Бюл. СО РАМН. - 2010. - Т. 30, № 2. - С. 28-32.
2. Транспорт стероидных гормонов липопротеидами сыворотки крови / Л. Е. Панин, Л. М. Поляков, А. В. Розуменко, Н. Г. Биушкина // Вопр. мед. химии. — 1988. — № 5.
— C. 56-58.
3. Потеряева О. Н. Матриксные металлопротеиназы: строение, регуляция, роль в развитии патологических состояний (обзор литературы) / О. Н. Потеряева // Медицина и образование в Сибири : сетевое издание. — 2010. — № 5. — Режим доступа : (http://ngmu.ru/cozo/mos/artide/text_fulLphp?id=449).
4. Пыхтина М. Б. Разработка эффективных способов выделения нативного аполипопротеина А-I человека из плазмы крови / М. Б. Пыхтина, И. Д. Иванов, А. Б. Беклемишев // Биофармацевтический журнал. — 2012. — Т. 4. — № 6. — С. 37-45.
5. Усынин И. Ф. Механизмы формирования фенотипической гетерогенности гепатоцитов / И. Ф Усынин, Л. Е. Панин // Биохимия. — 2008. — Т. 73, № 4. — С. 453-468.
6. Cham B. E. A solvent system for delipidation of plasma or serum without protein precipitation without protein precipitation / B. E. Cham, B. R. Knowlee // J. Lipid. Research.
— 1976. — Vol. 17. — Р. 176-181.
7. Havel R. J. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum / R. J. Havel, H. Eder, J. Bragdon // J. Clin. Invest. — 1955.
— Vol. 34, N 7. —P. 1345-1353.
8. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. — 1970. —Vol. 227. — P. 680-685.
9. Nagase H. Matrix Metalloproteinases / H. Nagase, J. Woessner // J. Biol. Chem. — 1999.
— Vol. 274, N 31. — Р. 21491-94.
INFLUENCE OF LIPOPROTEINS OF BLOOD PLASMA ON SECRETION OF MATRIX METALLOPROTEINASE OF MARROW CELLS
T. A. Tkachenko1. A. Y. Pechenkina1. O. N. Poteryaeva12. S. G. Russkikh1. A. N. Dudarev1. S. V.
Davydenko1.1. F. Usynin1
1FSBE «SRI of biological chemistry» SB RAMS (Novosibirsk c.) 2SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.)
Matrix metalloproteinases (MMP) participate in remodeling of a connecting tissue. Studying of influence of lipoproteins, A-I apolypoprotein (apo A-I), interleukin-3 (IL-3), tetrahydrohydrocortisone, dehydroepiandrosteronesulfate and their complexes on activity of MMP marrow cells was a research objective. Activity of MMP was determined by fluorescent substrate. It is established that at addition to cells of hormones and IL-3 activity of enzyme in the environment of incubation was enlarged by 1,5 times, apo A-I and their complexes secretion of MMP increased more than in 3 times. It was shown for the first time that apo A-I along with cytokines and hormones is the important factor regulating secretion of MMP in marrow.
Keywords: blood lipoproteins, A-I apolipoprotein, matrix metalloproteinases, tetrahydrocortisone, interleukin-3, dehydroepiandrosteronesulfate.
About authors:
Tkachenko Tatyana Aleksandrovna — post-graduate student, junior researcher at FSBE «SRI of biological chemistry» SB RAMS, office phone: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Pechenkina Anna Yurevna — post-graduate student, junior researcher at FSBE «SRI of biological chemistry» SB RAMS, office phone: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Poteryaeva Olga Nikolaevna — doctor of medical science, professor of medical chemistry chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: [email protected]
Russkikh Galina Sergeevna — candidate of biological science, senior research associate at FSBE «SRI of biological chemistry» SB RAMS, office phone: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Dudarev Alexey Nikolaevich — candidate of biological science, senior research associate at FSBE «SRI of biological chemistry» SB RAMS, office phone: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
Davydenko Sergey Vladimirovich — post-graduate student, junior researcher at FSBE «SRI of biological chemistry» SB RAMS, office phone: 8 (383) 333-54-81, e-mail:
Usynin Ivan Fedorovich — doctor of biological science, head of the laboratory of molecular cytobiology at FSBE «SRI of biological chemistry» SB RAMS, office phone: 8 (383) 333-54-81, e-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Panin L. E. Influence of plasma lipoproteins on insulin secretion by Langergans's islands of pancreas / L. E. Panin, O. N. Poteryaeva, G. S. Russians // Bulletin of the SB RAMS.
— 2010. — V. 30, № 2. — P. 28-32.
2. Transport of steroid hormones lipoproteins of blood serum / L. E. Panin, L. M. Polyakov, A. V. Rozumenko, N. G. Biushkina // Questions of medical chemistry. — 1988. — № 5. — P. 56-58.
3. Poteryaeva O. N. Matrix metalloproteinase: a structure, a regulation, a role in development of pathological states (the review of literature) / O. N. Poteryaeva // Medicine and education in Siberia: network edition. — 2010. — № 5. — Access mode(http://ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=449).
4. Poteryaeva O. N. Matrix metalloproteinase: a structure, a regulation, a role in development of pathological states (the review of literature) / O. N. Poteryaeva // Medicine and education in Siberia: network edition. — 2010. — № 5. — Access mode(http://ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=449).
5. Usynin I. F. Mechanisms of formation of fenotypic heterogeneity of hepatocytes / I. F Usynin, L. E. Panin // Biochemistry. — 2008. — V. 73, № 4. — P. 453-468.
6. Cham B. E. A solvent system for delipidation of plasma or serum without protein precipitation without protein precipitation / B. E. Cham, B. R. Knowlee // J. Lipid. Research.
— 1976. — Vol. 17. — P. 176-181.
7. Havel R. J. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum / R. J. Havel, H. Eder, J. Bragdon // J. Clin. Invest. — 1955.
— Vol. 34, N 7. —P. 1345-1353.
8. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. — 1970. —Vol. 227. — P. 680-685.
9. Nagase H. Matrix Metalloproteinases / H. Nagase, J. Woessner // J. Biol. Chem. — 1999.
— Vol. 274, N 31. — P. 21491-94.
