CC BY
32
Непосредственный эффект АЛХТ распространенных форм рака различной степени химиорезистентности
Форма опухоли, стадия Число больных Стабилизация Частич- ный эффект
регрессия
Рак молочной железы 7 Менее Менее Более
25 % 50 % 50%
IV стадия:
условно резистентная 1 2
резистентная 1 2
нелеченая 1
Немелкоклеточный рак лег-
кого 7
IV стадия:
центральный 3 1 1
III стадия:
центральный 1 1
Рак яичка
IV стадия:
резистентная 1
Итог о... 15 7 5 3
матический эффект в сочетании с объективными показателями регрессии метастазов различных локализаций без признаков прогрессирования со стороны оставшихся очагов).
В 3 наблюдениях минимальной распространенности (плоскоклеточный рак левого легкого с метастазом' в правое, центральный плоскоклеточный рак правого легкого ТЗЫ2МХ, отечно-инфильтра-тивная форма рака молочной железы Т4Ы2М-)-) достигнута частичная регрессия.
При анализе эффективности АЛХТ рака молочной железы у больных, перенесших многокурсовую химиотерапию, учитывали (из анамнеза) чувствительность процесса к стандартной химио-. терапии. Наблюдения разделили по степени резистентности на условно резистентные — отсутствие признаков объективного эффекта в ответ на
1—2 курса полихимиотерапии с адриамицином и резистентные — прогрессирование в ответ на 1 курс и более полихимиотерапии с адриамицином.
У 3 больных с условно резистентными формами объективный эффект выражался в сокращении размеров опухолевых узлов и самой железы, уменьшении ее инфильтрации, отека кожи, уменьшении и стабилизации уровня плеврального экссудата, сокращении размеров региональных и отдаленных лимфоузлов, числа и размеров метастазов в кожу.
У 3 женщин с резистентными формами, находящихся перед началом лечения в состоянии средней тяжести, эффект проявился в купировании болевого синдрома, уменьшении или нивелировании метастазов в кожу, торможении плевральной экссудации, положительной рентгенодинамики со стороны метастазов в легкие. В одном наблюдении синхронного рака обеих молочных желез (слева рецидив на фоне постлучевого фиброза железы Т4Ы1М1ЬУМ по типу «панцирного рака») объективный эффект прослежен не был. Выполнена двухсторонняя мастэктомия. Гистологически:
2-я (слева) и 1-я (справа) степени лечебного патоморфоза.
При АЛХТ немелкоклеточного рака легкого объективный эффект выражался в уменьшении размеров опухолевых очагов, корневых и медиасти-
нальных лимфоузлов, улучшении вентиляции соответствующих отделов легких, а стало быть, и функциональных показателей.
При резистентной форме рака яичка удалось нивелировать картину кишечной непроходимости и почечной недостаточности, уменьшить (в 8 раз) уровень а-фетопротеина в крови (см. таблицу).
Заметно улучшалось и субъективное состояние больных (на 1—2 степени), особенно при раке легких, как впрочем, и метастатическом их поражении за счет улучшения вентиляции ^нивелирования вторичных воспалительных реакций.
Проводили определение иммунологического статуса больных до АЛХТ и через 2—3 нед после ее проведения. Экспрессию дифференцировочных • антигенов субпопуляций лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD22) определяли в реакции непрямой имму-. ;-нофлюоресценции с помощью моноклональных антител серии ИКО. Реакцию учитывали на проточном цитофлюориметре «Facscan». Определяли также функциональную активность лимфоцитов в реакции бласттрансформации.на фитогемагглюти-;-нин и уровень сывороточных Ig.
Оказалось, что эффективная АЛХТ сопровож-■ далась повышением относительного содержания - CD3, CD4, CD8, соотношения CD4/CD8, CD22 лимфоцитов; повышалась также и функциональная активность лимфоцитов, изменения содержания сывороточных Ig носили разнонаправленный характер.
Таким-образом, разработанный способ может быть отнесен к адоптивной иммунохимиотерапии, поскольку наряду с проведением стандартной химиотерапии в полном ее объеме АЛХТ позволяет достичь позитивных изменений со стороны показателей противоопухолевого иммунитета. Положительные результаты клинического использования АЛХТ при генерализованных формах рака различной степени химиорезистентности позволяют сделать вывод о целесообразности применения подхода в комбинированном и комплексном лечении местнораспространенных форм рака.
ЛИТЕРАТУРА
1. Трапезников Н. Н., Буашдзе Л. Н., Черное 3. В., Када-гидзе 3. Г. // Вопр. онкол.— 1976.— № 3.— С. 6.
2. Петров Р. В. Иммунология.— М., 1989.— С. 96—98.
3. Kadagidze Z. G., Svet-Moldavski G. J. // J. nat. Cancer Inst.— 1971:—Vol. 46.—P. 921.
4. Cheena, Herst, 1979. // Комбинированное и комплексное лечение больных со злокачественными опухолями.— М., 1989,— С. 58.
Поступила 27.07.91
© О. А. СЕДЕЛЬНИКОВА, 1991 УДК 616.006.04-076.5.-078.7
О. А. Седельникова
МЕТОД ИММУНОЦИТОХИМЙИ В ОПРЕДЕЛЕНИИ МУЦИНОПОДОБНЫХ АНТИГЕНОВ ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
НИИ клинической онкологии
В настоящее время проводится множество работ, посвященных определению антигенного состава опухолей’или изучению специфичности новых моноклональных антител (МКАТ) на гистологиче-
ских срезах. Гораздо реже, особенно в отечествен; ных 'публикациях, описывается практика внедрения иммуноцитохимических методов в цитологические исследования, ,,Тем не менее это важно, поскольку применениё иммуноцитохимии в цитологии позволяет получить дополнительную информацию' о злокачественности или доброкачественности опухоли,, уровне клеточной дифференцировки, гистогенезе опухоли, прогнозе и потенциальной ВОЗ; можности оперативного" вмешательства. :
В нашем исследовании требовалось установить специфичность МКАТ, выработанных к антигенам семейства эпителиальных муцинов (ИКО-21, 22, 25, 29, 84, 85, РМЖ-1, 2), к опухолям молочной железы в цитологических препаратах, МКАТ были получены в лаборатории клинической радиоиммунологии и лаборатории экспериментальной диагностики опухолей ВОНЦ АМН СССР. Первоначально мы пытались использовать стандартную иммуноморфологическую методику [3], которая с успехом применяется для работы на парафиновых и криостатных срезах. Но ряд моментов (способ хранения и фиксации материала, состав и кон-: центрация реагентов, используемы* Для разлйч-; ных реакций) оказался непригодным для нашего материала. При обработке таким образом цитологических мазков клетки часто разрушались,- продукт реакции выявлялся очень слабо или не выявлялся совсем, довольно выраженным было неспецифическое связывание. Поэтому мы попытались модифицировать предлагаемый метод посредством внесения некоторых нюансов из иммуно-цитохимической методики, используемой для ти-пирования лимфоидных и кроветворных клеток -1.1], а также эмпирическим подбором условий протекания реакции.
Цель данной работы ^ описание модифицированной йммуноцитохимической методики, используемой для определения муциноподобных антигенов в опухолях и предопухолевых процессах молочной железы.
Материалом для исследований послужили маз-кй-отпечатки с операционного материала (фибро-аденоматоз, фиброаденома и рак молочной железы) от 20 больных, а также мазки, полученные при диагностическом пунктировании тонкой иглой 10 женщин с подозрением на рак или предраковые заболевания молочной железы. Использовались непрямая и'ммунопероксидазная техника (в качестве вторых антител мы брали пероксидаз-ные- конъюгаты против мыши НИИЭМ
им. Н. Ф. Гамалеи, Москва) и РАР-метод (антитела против мыши и РАР-комплекс фирмы «Оакораиэ», Дания).
Тщательно приготовленные мазки-отпечатки с операционного материала и пункционный материал, равномерно распределенный по предметному стеклу, высушивали на воздухе 2—3 ч. Затем стекла маркировали и заворачивали в алюминиевую фольгу для того, чтобы при разморозке препаратов исключить лизис клеток (образовавшийся конденсат локализуется на поверхности фольги). Считается, что нефиксированные мазки могут храниться в таком виде в морозильной камере при температуре —18—20 °С без утраты антигенных свойств до .4 мес и дольше, по некоторым источникам до 1 года [1, 4, 6]. Мы использовали замороженные препараты в течение недели.
Препараты доставали ,из морозильной камеры, через 15—20'мин вынимали из фольги и приступали к этапу-фиксации для сохранения локализации и целостности антигена. В поисках наиболее подходящего фиксатора .мы использовали пары 10 % формалина, ацетон и смесь ацетон-метанол (1:1). Наилучшая сохранность морфологии клеток и исследуемых антигенов наблюдалась при фиксаций ацетон-мётанолом в течение 3 мин. Затем препараты промывали 2 раза по 3 мин в фосфатносолевом буфере (ФСБ), pH 7,2—7,4 (на 1 л дистиллированной воды 0,41 г КН2Р04, 1 г Ыа2НР04, 8,5 г ЫаС1). На стеклах очерчивали участки для нанесения реактивов; после каждой •промывки избыток влаги вокруг них удаляли фильтровальной бумагой.
Для ингибиции эндогенной пероксидазы,' часто не применяемой для работы на срезах, использовали смесь метанол — 3 % перекись водорода в соотношении 5:1. Ингибировали 30 мин во влажной камере при комнатной температуре. Дальнейшую промывку, как и все последующие, осу^ ществляли следующим образом: вначале препараты промывали легкой струей ФСБ, а затем их споласкивали в 2 сменах буфера. С целью блокирования рецепторов неспецифического связывания на 20 мин наносили разведенную в 10 раз ФСБ человеческую сыворотку IV группы [2] или нормальную кроличью сыворотку.
Промыв препараты, производили инкубацию с МКАТ в разведении 1:100 на протяжении часа. Следующие этапы — инкубация с использованием антител против мыши, меченных пероксидазой (непрямой метод), а также антител против ^
Рис. 1. Положительное окрашивание комплекса эпителиальных клеток молочной железы МКАТ ИКО-84 (пунктат). .; ,.
Продукт реакции локализуется в цитоплазме и п<? мембране клеток, ободком окружает весь комплекс. ХМО.
Рис. 2. а — положительное окрашивание опухолевых клеток молочной железы МКАТ ИКО-25 (мазок с операционного материала).
Продукт реакции в виде гомогенного окрашивания и темных гранул в цитоплазме клеток. Х400; б — контрольный препарат.
мыши и РАР-комплекса (РАР-метод) — продолжались по 1 ч каждый; за инкубацией следовала промывка. Все реагенты наносились на очерченные на стекле участки по 20—40 мкл.
Пероксидазу проявляли по модифицированному способу [5] (2,5 мл ФСБ, 1,5 мг 3,3-диамино-бензидина (ДАБ), 10 мкл 33% перекиси водорода). Мы применяли ДАБ фирмы «Sigma», США.
Через 15—20 мин препараты отмывали под струей холодной водопроводной воды и докрашивали ядра клеток гематоксилином Караци 7 мин или азуром-П (1 г сухой краски на 1 л дистиллированной воды, pH 6,7—7,2) 3 мин. Такая кратковременная окраска не влияет на выраженность и цветовые вариации пероксидазной реакции.
Преимуществами предлагаемой модификации иммуноцитохимической методики являются: 1) хорошая сохраннрсть морфологии клеток; 2) четкое проявление пероксидазной реакции и возможность оценки ее интенсивности; 3) уменьшение неспе-. цифического связывания.
Следует отметить, что непрямая иммуноперокси-дазная техника и РАР-метод дали сходные результаты во всех случаях. По предварительным данным, МКАТ ИКО-25 и ИКО-84 давали положительную реакцию почти во всех цитологических препаратах. Темно- или светло-коричневый продукт реакции локализовался в виде гранул на клеточной мембране и в цитоплазме или ободка вокруг отдельных эпителиальных клеток или их групп (рис. 1,2). Подобная картина наблюдалась в мазках-отпечатках с операционного материала при проверке МКАТ РМЖ-1 (при работе с пунк-ционными мазками это антитело не применялось). Положительные реакции с остальными МКАТ очень сильно варьировали.
Таким образом, применение описанной модифицированной методики и МКАТ указанной специфичности действительно может служить способом определения муциноподобных антигенов в цитологических препаратах опухолей и предопухолевых состояний молочной железы. Для окончательного заключения о выявлении панелью испытываемых антител этих антигенов в клетках
опухолей молочной железы и других органов с учетом их гистологического типа, доброкачественности или злокачественности, а также для решения вопроса о диагностической ценности выявления муциноподобных антигенов в пунктатах необходимы дальнейшие исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Иммуноцитохимия и моноклональные антитела в онкогематологии / Под ред. В. Г. Пинчука, Д. Ф. Глузмана.— Киев, 1990.
2. Кулевич Е. Е., Пискунова Т. В., Иванов П. К., Ананьев В. С. // Арх. пат.— 1989.—№ 7.— С. 20—25.
3. Полак Дж., Ван Нордан С. // Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы.— М., 1987.
4.' Dearnaley D. Р., То А. С. W., Husan О. А. N. et al. // Lancet.— 1984.— Vol. 7, N 1.— P. 39.
5. Graham R. C., Karnovsky M. J. // J. Histochem. Cytochem.— 1966,—Vol. 13,—P. 150—152.
6. Johuston W. W. U Acta Cyt.— 1987,—Vol. 31, N S.-Р. 537—556.
Поступила 28.03.91
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1991 УДК 618.19-006.6-097-053.84
Н. С. Чобанян, В. П. Летягин, Е. В. Савельева, Т. Н. Заботина, А. Ю. Барышников, 3. Г. Кадагидзе
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ЛИМФОЦИТОВ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА, БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
НИИ клинической онкологии
В последнее время широкое распространение получило определение иммунологического статуса с помощью моноклональных антител (МКА), которые упростили и унифицировали иммунологические исследования. В лаборатории клинической радиоиммунологии создан набор МКА, позволяющих оценивать иммунологический статус организма в норме и при различной патологии [1—3].
Иммунофенотипический анализ позволяет выявить роль различных популяций иммунокомпе-тентных клеток в развитии противоопухолевого иммунитета у больных раком, в том числе и раком молочной железы — РМЖ [10, 11].
