CC BY
54
иохиМичЕского
Ep-CAM
жидкостей и смывов
______________,_____,_____ист научной части1; директор2;
И.Г. Терентьев, д.м.н., зав. кафедрой онкологии1;
О.В. Уткин, зав. лабораторией молекулярной биологии и биотехнологии3; технический директор2; "" Ю. Фурминская, научный сотрудник лаборатории клинической цитологии4; Е.С. Федосеева, младший научный сотрудник лаборатории клинической цитологии4; М.В. Савостикова, к.м.н., зав. лабораторией клинической цитологии4
приволжский исследовательский медицинский университет, пл. Минина, 10/1, Н. Новгород, 603005; 2НПП «Биочип», ул. Нобеля, 7, помещение 14, Москва, Сколково, 143026; Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, ул. Малая Ямская, 71, Н. Новгород, 603950; "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина, Каширское шоссе, 24, Москва, 115478
Цель исследования — оценить возможности тест-системы «Биочип-SER» для анализа экспрессии антигена Ep-CAM методом флюоресцентной иммуноцитохимии.
Материалы и методы. Проведено 64 цитологических, 64 стандартных иммуноцитохимических (СИЦХ) и 64 флюоресцентных иммуноцитохимических (ФИЦХ) исследования с использованием тест-системы «Биочип-SER» 59 пациентам (45 выпотов и 19 смывов с органов брюшной полости). Работу выполняли в 4 этапа: 1-й этап — цитологическое исследование; 2-й этап — СИЦХ; 3-й этап — ФИЦХ на тест-системе «Биочип-SER»; 4-й этап — контрольное цитологическое исследование с использованием тест-системы «Биочип-SER». СИЦХ проводили с моноклональным антителом (МКАТ) к эпителиальному антигену Ep-CAM, ФИЦХ — с МКАТ к эпителиальному антигену Ep-CAM, конъюгированному с флюорохромом Alexa Flour 488.
Результаты. ФИЦХ-исследование, выполненное с использованием тест-системы «Биочип-SER», показало 100% диагностическую чувствительность, специфичность теста составила 89%.
Заключение. ФИЦХ-исследование, проведенное с МКАТ к антигену Ep-CAM, конъюгированному с Alexa Flour 488, на тест-системе «Биочип-SER» является надежным методом диагностики опухолевого процесса в выпотных жидкостях, что позволяет рекомендовать его для широкого применения как в специализированных учреждениях, так и в первичном диагностическом звене.
Ключевые слова: метастатический выпот; тест-система «Биочип-SER»; иммуноцитохимическое исследование; флюоресцентное иммуноцитохимическое исследование; антиген Ep-CAM; Ber-EP4; Alexa Flour 488.
Как цитировать: Zinoviev S.V., Terentiev I.G., Utkin O.V., Furminskaya E.Yu., Fedoseeva E.S., Savostikova M.V. Biochip-SER test system for fluorescent immunocytochemical analysis of Ep-CAM antigen expression in effusions and washes. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(4): 34-41, https://doi.org/10.17691/stm2018.10.4.04
English
Biochip-SER Test System for Fluorescent Immunocytochemical Analysis of Ep-CAM Antigen Expression in Effusions and Washes
S.V. Zinoviev, Science Department Specialist1; Director2; I.G. Terentiev, MD, DSc, Head of Oncology Department1;
O.V. Utkin, Head of the Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology3; Technical Director2; E.Yu. Furminskaya, Researcher, Laboratory of Clinical Cytology4;
Для контактов: Савостикова Марина Владимировна, e-mail: savostikovamv@yandex.ru //////////////////////^^^^
34 СТМ J 2018 J том 10 J №4 С.В. Зиновьев, И.Г. Терентьев, О.В. Уткин, Е.Ю. Фурминская, Е.С. Федосеева, М.В. Савостикова
E.S. Fedoseeva, Junior Researcher, Laboratory of Clinical Cytology4; M.V. Savostikova, MD, PhD, Head of the Laboratory of Clinical Cytology4
1Privolzhsky Research Medical University, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russia; 2SPE Biochip, 7 Nobelya St., room 14, Moscow, Territory of the Innovation Center "Skolkovo", 143026, Russia; 3Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod, Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Rospotrebnadzor), 71 Malaya Yamskaya St., Nizhny Novgorod, 603950, Russian Federation;
4N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of Russian Academy of Medical Science, 24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia
The aim of the study was to evaluate the Biochip-SER test system for its ability to measure the expression of Ep-CAM antigen by fluorescent immunocytochemistry.
Materials and Methods. We conducted 64 cytological, 64 standard immunocytochemical (SICC) and 64 fluorescent immunocytochemical (FICC) tests using the Biochip-SER test system and samples from 59 patients (45 effusions and 19 peritoneal washings). The study was performed in 4 stages: cytological examination, SICC, FICC using the Biochip-SER system, and control cytological study by the Biochip-SER system. The SICC was performed using the monoclonal antibody (MAB) to the epithelial antigen Ep-CAM; FICC was performed using the MAB to the epithelial antigen Ep-CAM conjugated to the Alexa Flour 488 fluorochrome.
Results. FICC test performed using the Biochip-SER test system, showed 100% diagnostic sensitivity and 89% specificity.
Conclusion. FICC test carried out with MAB to the Ep-CAM antigen conjugated with Alexa Flour 488 using the Biochip-SER system is a reliable method for diagnosing tumors by testing effusion fluids, which allows us to recommend this system for practical use in specialized institutions and primary points of care.
Key words: metastatic effusion; Biochip-SER test system; immunocytochemical study; fluorescent immunocytochemical study; Ep-CAM antigen; Ber-EP4; Alexa Flour 488.
Введение
Обнаружение раковых клеток в экссудатах на ранних этапах метастазирования опухоли является очень важной задачей, поскольку установление факта диссеминации опухолевого процесса до проявления клинических признаков заболевания позволяет выбрать оптимальную тактику лечения. Как известно, серозные полости покрыты слоем эпителиальных клеток мезенхимального происхождения (мезотели-ем). При различных патологических процессах (нео-плазии, инфекционных и системных заболеваниях) мезотелий становится полиморфным и даже атипичным, что связано с его реактивной пролиферацией [1]. Вариабельность морфологии клеток реактивного мезотелия вызывает значительные затруднения при дифференциальной диагностике со злокачественной мезотелиомой и метастазами карцином, что требует привлечения дополнительных аналитических методов.
У здорового человека в плевральной полости содержится около 10 мл, в перикардиальной — приблизительно 1-2 мл и в брюшной — до 50 мл серозной жидкости [2]. Считается, что объем, превышающий указанное количество жидкости в полостях, свидетельствует о наличии патологического процесса и является достаточным основанием для диагностической пункции.
Злокачественные заболевания довольно часто сопровождаются выпотом в плевральную и брюшную полости. У мужчин по частоте обнаружения опухолевых клеток в экссудатах первое место занимает рак легкого (49%), затем лейкозы и злокачественные лим-
фомы (21%), карциномы органов пищеварения (7%) и мочеполовой системы (6%). У женщин плевральные и перитонеальные экссудаты встречаются в 2 раза чаще, особенно при прогрессировании рака молочной железы (37-50%) и яичников (20%), реже — при злокачественных лимфомах (8%) и карциномах органов пищеварения (4%) [3].
Цитологическое исследование — единственный метод диагностики злокачественной природы экссудата, однако достоверность его вариабельна и составляет от 60 до 96% [2, 4, 5].
При оценке морфологии серозных выпотов наличие в препаратах полиморфных клеток с выраженной ати-пией ядер и клеточных скоплений в виде характерных структур (ацинарных, микрососочковых, шаровидных и т.д.) позволяет установить диагноз злокачественной опухоли без затруднений. Однако разнообразный клеточный состав экссудата — наличие клеток проли-ферирующего мезотелия, лимфоидных и гистиоцитар-но-макрофагальных элементов, лейкоцитов, а также опухолевых клеток, морфологически сходных с клетками мезотелия, — может являться причиной неуверенных заключений о характере выпота.
Затруднения в дифференциальной диагностике реактивно измененного мезотелия, мезотелиомы и метастатического рака в большинстве случаев можно преодолеть, используя дополнительные методы: им-муноцитохимическое исследование, цитогенетический метод, проточную цитофлюориметрию, электронную микроскопию и др. [6-8].
При проведении иммуноцитохимии для разрешения спорных диагностических ситуаций чаще всего
используются моноклональные антитела (МКАТ) к поверхностному эпителиальному антигену Ер-САМ (клон Ber-EP4). Ep-CAM — трансмембранный белок, состоящий из двух молекул гликопротеинов с молекулярной массой 34 и 39 кДа, локализуется на мембране и в цитоплазме нормальных эпителиальных клеток, клеток карциноидов и карцином различного генеза [9, 10]. Ep-CAM не экспрессируется в большинстве неэпителиальных опухолей, на мезотелиальных клетках, гепатоцитах и лимфоцитах. В сочетании с другими маркерами Ep-CAM может использоваться для подтверждения эпителиального происхождения опухоли в дифференциальной диагностике между аденокарци-номой (АК) и мезотелиомой [11, 12].
Данные зарубежных коллег показывают высокую чувствительность, специфичность и положительную предсказательную ценность иммуноцитохимических исследований с использованием МКАТ к Ep-CAM в выявлении АК — 80, 94 [13] и 96% соответственно [14].
По данным отечественной литературы, применение Ep-CAM при исследовании материала выпотных жидкостей позволяет повысить чувствительность и специфичность цитологической диагностики АК до 96 и 99% соответственно [15].
Отмечены хорошие результаты использования Ep-CAM при дифференциальной диагностике АК и мезотелиомы: позитивная реакция отмечается в 100% аденогенных карцином легкого, в 100% плоскоклеточных раков, в 93% нелегочных карцином, в 67% уроте-лиальных карцином и в 84% АК без первично выявленного очага, метастазировавших в плевру. В то же время в клетках мезотелиомы Ep-CAM экспрессируется в 18-26% наблюдений [16, 17]. При этом следует отметить, что в мезотелиомах экспрессия Ep-CAM наблюдается фокусно, в части опухолевых клеток.
Одним из вариантов иммуноцитохимических исследований является флюоресцентная иммуноцитохимия (ФИЦХ), которая позволяет проводить интраопераци-онные исследования экссудатов, поскольку не требует больших временных затрат и обладает доказанной эффективностью. Так, в работе японских коллег [18] были сопоставлены результаты разных вариантов иммуноцитохимических исследований: стандартной (СИЦХ), стандартной и срочной интраоперационной ФИЦХ с использованием жидкостных технологий — на 64 образцах (35 смывов с органов брюшной полости и 29 асцитических выпотов), полученных от пациентов с различной неопухолевой патологией и злокачественными процессами. При СИЦХ и ФИЦХ из использован-
НПП «БИОЧИП»
г. Н. Новгород
Рис. 1. Внешний вид тест-системы «Биочип-SER»
ных в работе маркеров (Ber-EP4, CEA, EMA и MOC-31) клоны Ber-EP4 и MOC-31 показали наибольшую значимость в оценке характера выпота, поскольку демонстрировали выраженную экспрессию в клетках АК и полное ее отсутствие в клетках реактивного мезотелия: в 92% случаев АК (12 из 13) клетки были Ber-EP4/ MOC-31-позитивны.
По нашим собственным данным, применение СИЦХ и ФИЦХ с Ep-CAM (Ber-EP4) повышает чувствительность и специфичность цитологического метода при исследовании выпотов и смывов до 100% [5].
С учетом высокой чувствительности и специфичности МКАТ к Ep-CAM (клон Ber-Ep4) этот маркер был выбран для идентификации клеток АК при СИЦХ и ФИЦХ.
С целью усовершенствования цитологического и иммуноцитохимических методов была разработана тест-система «Биочип-SER». Эта система является высокотехнологичным изделием медицинского назначения для проведения ФИЦХ [19]. Она состоит из двух основных частей: рабочей и функциональной (рис. 1). Рабочая часть представляет собой прозрачную подложку из стекла размерами 25,4*76,2 мм, толщиной 1 мм. Подложка с положительно заряженным покрытием разделена на 15 равных ячеек посредством решетки из пластика. В каждой ячейке содержится МКАТ к Ep-CAM (клон Ber-EP4), конъюгированному с флюорохромом Alexa Flour 488, который возбуждается светом с длиной волны 468-509 нм и излучает свет с длиной волны 504-541 нм. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавлен реагент PBS (фосфатный буфер) в количестве 0,1 мкл, сверху на рабочую поверхность нанесена гидрофобная пленка, препятствующая их высыханию. В зависимости от плотности клеток опухоли в материале исследователь имеет возможность индивидуально подходить к выбору необходимого количества ячеек для изучения одного образца. При обнаружении единичных клеток опухоли или немногочисленных их скоплений могут быть задействованы все 15 ячеек биочипа.
Часть тест-системы не имеет специфического покрытия и предназначена для маркировки изделия (QR-код) и фиксации в руках исследователя.
Цель исследования — оценить возможности тест-системы «Биочип-SER» для анализа экспрессии антигена Ep-CAM методом флюоресцентной иммуноцито-химии.
Материалы и методы
Проведено 64 цитологических, 64 СИЦХ- и 64 ФИЦХ-исследования на тест-системе «Биочип-SER» 59 пациентам с опухолевой и неопухолевой патологией. В исследование включены 8 мужчин (возраст 33-67 лет) и 51 женщина (возраст 29-88 лет). Работа выполнена в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) и одобрена Этическим комитетом Национального медицинского исследовательского
///////////////ш^^
36 СТМ j 2018 j том 10 j №4 С.В. Зиновьев, И.Г. Терентьев, О.В. Уткин, Е.Ю. Фурминская, Е.С. Федосеева, М.В. Савостикова
центра онкологии им. Н.Н. Блохина. От каждого пациента получено информированное согласие. Изучены клеточные осадки 45 выпотов (26 асцитов, 17 плевритов, 2 перикардиальных выпота) и 19 смывов с органов брюшной полости. У двух пациенток дважды проводился забор материала, у троих были исследованы
плевральный и перитонеальный выпоты (табл. 1). Из 59 больных 57 человек (96,6%) имели онкологический анамнез (серозный папиллярный рак яичников, пограничная опухоль яичника, АК эндометрия, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак желудка, АК легкого, мезотелиома, мелкоклеточный рак легкого), у 2
Таблица 1
Клинико-морфологическая характеристика исследованного материала
В Материал — № Пол bозраст, количество лет образцов Первичное цитологическое заключение Итоговое заключение (после СИЦХ) Клинический диагноз
1-21 Ж 29-88 Смывы — 6 Аденокарцинома Аденокарцинома Рак яичников
Плевриты — 4
Асциты — 12
22 Ж 47 Асцит Карциносаркома яичников
23 Ж 55 Смыв Рак шейки матки
2426 Ж 57-69 Плеврит — 1 Рак тела матки
Смывы — 2
2729 Ж-2, М-1 33-59 Плеврит Рак молочной/ грудной железы
30 Ж 59 Асцит Первично-множественное злокачественное новообразование
31 Ж 44 Плеврит, асцит
32 Ж 62 Асцит
33 Ж 50 Асцит Рак кишки
3439 М-4, Ж-2 35-70 Смыв — 1 Рак желудка
Асциты — 4
Перикардит — 1
40 М 57 Плеврит Аденокарцинома легкого
41 М 52 Перикардит
42 Ж 64 Плеврит, асцит
43 Ж 88 Плеврит
44 Ж 49 Плеврит Реактивный мезотелий Рак молочной железы
45 М 54 Плеврит Мелкоклеточный рак легкого Мелкоклеточный рак легкого Мелкоклеточный рак легкого
46 Ж 29 Смыв Подозрение на аденокарциному Аденокарцинома Рак яичников
47 Ж 34 Смыв
48 Ж 53 Плеврит
49 Ж 70 Смыв Реактивный мезотелий Рак тела матки
50 Ж 50 Смыв Реактивный мезотелий Реактивный мезотелий Эндометриоз
51 Ж 58 Асцит, плеврит Эхинококкоз
52 Ж 50 Смыв Рак молочной железы
53 Ж 75 Смыв Рак тела матки
54 Ж 65 Смыв
55 Ж 55 Асцит Мезотелиома Мезотелиома Мезотелиома
56 Ж 87 Асциты — 2 Подозрение на мезотелиому
57 Ж 71 Плеврит Метастазы по плевре без выявленного первичного очага
58 Ж 55 Смыв Подозрение на пограничную опухоль яичников Подозрение на пограничную опухоль яичников Пограничная опухоль яичников
59 Ж 41 Смыв
оригинальные исследования
пациентов (3,4%) опухолевой патологии не выявлено (1 наблюдение — эхинококкоз печени и 1 — эндоме-триоз маточной трубы). Среди пациентов с опухолевой патологией у 7 (12,3%) были диагностированы первично-множественные злокачественные новообразования. Только у 42 из 59 пациентов гистологически было верифицировано наличие/отсутствие распространения опухолевого процесса по брюшине/плевре, у двух пациенток с неопухолевой патологией (эндоме-триоз, эхинококкоз) диагнозы также подтвердились.
Хотя наибольшей чувствительностью Ep-CAM обладает именно в отношении клеток АК, интерес для исследования представляла также экспрессия антигена в клетках опухолей другого генеза и клетках реактивного мезотелия.
В нашей работе весь исследованный материал был оценен как информативный, поскольку для проведения СИЦХ и ФИЦХ отбирался осадок с высокой кле-точностью.
Работу проводили в четыре этапа: 1-й этап — цитологическое исследование; 2-й этап — СИЦХ; 3-й этап — ФИЦХ на тест-системе «Биочип-SER»; 4-й этап — контрольное цитологическое исследование на системе «Биочип-SER».
Для цитологического, СИЦХ- и ФИЦХ-исследо-ваний использовали концентрированную клеточную взвесь, полученную путем центрифугирования осадка отстоявшейся биологической жидкости. Осадок помещали в центрифужные пробирки объемом 10 мл и центрифугировали в режиме 2000 об./мин в течение 10 мин на центрифуге ОПН-3М (ELMI Ltd., Латвия). Надосадочную жидкость сливали, оставляя до 1 мл клеточной взвеси. Содержимое пробирки ресуспензировали или встряхивали на вортексе для получения однородной клеточной взвеси, которую затем распределяли (в объеме 50-80 мкл в зависимости от клеточной плотности) по кюветам ци-тоцентрифуги Cytospin-3 (Thermo Scientific Shandon, Великобритания) и центрифугировали в режиме 1500 об./мин в течение 10 мин.
Готовили серию монослойных препаратов: для цитологического исследования 2 мазка окрашивали по методу Романовского в модификации Лейшмана, на двух проводили СИЦХ-исследование с МКАТ к эпителиальному антигену Ep-CAM, клон Ber-EP4 (Dako, США). Наличие мембранного окрашивания клеток опухоли свидетельствовало о положительной экспрессии Ep-CAM.
В нескольких случаях (n=9) для подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики были также проведены СИЦХ-исследования с МКАТ к антигену WT-1, клон 6F-H2, титр 0,7:100 (Cell Marque Corp., США); калретинину, клон Calret, титр 1:100 (Dako, США); мезотелину, клон NCL-L-MESO, титр 1:40 (Novocastra Laboratories, Великобритания); ме-зотелиальному антигену HBME-1, клон HBME-1, титр 1:40 (Cell Marque Corp., США); десмину, клон D33, титр 1:100 (Cell Marque Corp., США); TTF-1, клон G7G3/1,
титр 0,7:100 (Cell Marque Corp., CLA); CK7, клон OV-TL 12/30, титр 0,7:100 (Cell Marque Corp., CLA); си-наптофизину, клон MRQ-40, титр 0,7:100 (Cell Marque Corp., CLA); Epithelial-Related Antigen, клон MOC-31, титр 1:60 (Dako, CLA). Все ^ЦХ были проведены на иммуногистостейнере BenchMark ULTRA (Ventana, CLA).
Для выполнения ФИЦХ на изделии «Биочип-SER» в оставшуюся клеточную взвесь добавляли 10% раствор реополиглюкина (в соотношении 1:9) с целью уменьшения фонового окрашивания и нивелирования эффекта автофлюоресценции, повторно центрифугировали в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли до остаточного объема 0,6-0,8 мл. 1<леточную взвесь после снятия защитной пленки на биочипе распределяли в объеме 30 мкл в каждую ячейку. При внесении исследуемого материала в ячейки происходит прямая иммуноцитохимическая реакция «антиген-антитело», определяемая с помощью эффекта флюоресценции. Для более равномерного распределения материала и ускорения реакции «антиген-антитело» содержимое ячеек тщательно перемешивали, биочип инкубировали в течение 30 мин в гибридайзере (возможно применение термостата либо термошейкера). Затем оценивали полученные реакции с помощью флюоресцентного микроскопа Axio Imager Z2 (Carl Zeiss, Германия), используя фильтры FITC, DAPI.
Aнализ экспрессии антигена Ep-CAM проводили в каждой из ячеек тест-системы по следующим параметрам:
наличие либо отсутствие специфического мембранного свечения в клетках опухолей;
количество прореагировавших клеток;
интенсивность флюоресценции.
Впоследствии (4-й этап) биочип окрашивали традиционным способом (по Лейшману) и проводили контрольное цитологическое исследование. Во всех цитологических препаратах оценивали разнообразие клеточного состава, плотность клеток опухоли в материале, сохранность характерных морфологических признаков опухоли и ее архитектоники. Mикроскопию выполняли на световом микроскопе Eclipse Ci (Nikon, Япония) при увеличении 100, 200, 400 и 1000.
Результаты и обсуждение
Результаты цитологического исследования (1-й этап). Все полученные заключения были распределены на три группы.
1. Уверенное заключение о наличии клеток опухоли (n=51). Mатериал отличался высокой клеточностью. В соответствии с нозологией отмечались характерные морфологические особенности опухолевых клеток и их скоплений.
2. Подозрение на наличие клеток опухоли (n=7). Причинами неуверенных цитологических заключений служили следующие факты:
//////////////////////^^^^
38 СТМ J 2018 J том 10 J №4 С.В. Зиновьев, И.Г. Терентьев, О.В. Уткин, Е.Ю. Фурминская, Е.С. Федосеева, М.В. Савостикова
наличие единичных клеток, морфологически сходных с опухолевыми (n=2);
«пестрый» клеточный состав с наличием выраженной лимфоцитарно-гистиоцитарной реакции (n=2);
клетки реактивно пролиферирующего мезотелия, подозрительные на мезотелиому (n=2), либо скопления опухолевых клеток, которые трудно дифференцировать между АК и мезотелиомой (n=1).
3. Уверенное заключение об отсутствии клеток опухоли (n=6).
Во всех наблюдениях данной группы цитограммы были представлены бесструктурными скоплениями и пластами клеток мезотелия.
Результаты СИЦХ-исследования (2-й этап).
Применение СИЦХ позволило подтвердить цитологический диагноз в 56 наблюдениях, уточнить в 6 и избежать гипердиагностики — в двух случаях (см. табл. 1).
Для оценки чувствительности и специфичности цитологического метода в выявлении АК из 64 наблюдений соответственно исключили те случаи, где были уверенно или предположительно диагностированы мезотелиома (n=4), опухоли с пограничной степенью злокачественности (n=2) и мелкоклеточный рак (n=1). Проведение СИЦХ-исследования с МКАТ к Ep-CAM (n=57) позволило подтвердить цитологическое заключение «аденокарцинома» в 46 случаях, а также перевести в категорию уверенных заключений 2 наблюдения с подозрением на АК (табл. 2).
Поскольку ложноотрицательных цитологических заключений отмечено не было, чувствительность цитологической диагностики составила 100%. Группу ложноположительных цитологических заключений в итоге составили 2 наблюдения с подозрением на АК, не подтвердившуюся при СИЦХ, а также один случай с уверенным заключением о метастазе аденогенного рака. Таким образом, специфичность цитологического метода составила всего 67%. Однако стоит отметить, что данные показатели можно рассматривать лишь в качестве условного ориентира ввиду малой выборки пациентов.
При пограничной опухоли яичников (n=2) положительная экспрессия Ep-CAM отмечена в обоих случаях. Во всех наблюдениях с утвердительным и предположительными заключениями о мезотелиоме (n=4), а также при диссеминации мелкоклеточного рака легкого по плевре реакция с Ep-CAM была отрицательной. Диагноз эпителиоидно-клеточной мезо-телиомы был подтвержден СИЦХ-реакциями с позитивной экспрессией калретинина, мезотелина, WT-1, HBME и негативной экспрессией МОС-31, десмина. Мелкоклеточный рак при СИЦХ характеризовался позитивной экспрессией TTF-1 и синаптофизина (ранее гистогенез опухоли был подтвержден иммуногистохи-мически).
Результаты ФИЦХ-исследования на тест-системе «Биочип-SER» (3-й этап). ФИЦХ, проведенная на системе «Биочип-SER», также показала 100% диагностическую чувствительность: во всех случаях АК,
Таблица 2
Экспрессия Ep-CAM при стандартном иммуноцитохимическом исследовании
Первичное Экспрессия Количество
цитологическое заключение Ep-CAM наблюдений
Аденокарцинома (n=47) — 1
+ 46
Подозрение на аденокарциному (n=4) — 2
+ 2
Реактивные клетки мезотелия (n=6) — 6
+ 0
подтвержденных СИЦХ, выявлена положительная экспрессия антигена Ep-CAM, конъюгированного с Alexa Flour 488. Специфичность теста составила 89%, лишь в одном наблюдении результаты СИЦХ и ФИЦХ не совпали (положительная реакция была отмечена только на биочипе), причем в дальнейшем гистологически была подтверждена диссеминация опухолевого процесса, что говорит об истинности результата ФИЦХ.
Необходимо отметить ряд нюансов, с которыми сталкивается исследователь при работе с тест-системой «Биочип-SER». Так, под воздействием лучевого или химиотерапевтического лечения в клетках опухоли проявляются признаки дистрофии и дегенерации, в связи с чем мембранная экспрессия Ep-CAM может наблюдаться в виде флюоресцентного свечения разной интенсивности (от слабой до умеренной), иногда прерывистого. Эта особенность может затруднять обнаружение опухолевых клеток.
Результаты контрольного цитологического исследования на тест-системе «Биочип-SER». Отмечалась сохранность характерных морфологических признаков клеток опухоли и архитектоники скоплений. Распределение клеточных элементов в ячейках оказалось не совсем равномерным — наибольшее количество материала скапливалось в углах ячеек. Это хорошо иллюстрируют приведенные примеры результатов исследований (рис. 2, 3).
Таким образом, проведенное исследование показывает высокую сопоставимость результатов ФИЦХ-и СИЦХ-исследований экспрессии Ep-CAM. При этом использование тест-системы «Биочип-SER» дает ФИЦХ-исследованию дополнительные преимущества:
а) экономия времени — исследование занимает около 60 мин с учетом пробоподготовки против 180 мин при СИЦХ;
б) возможность выполнения контрольного исследования: после ФИЦХ препарат окрашивается традиционным способом;
в) используемые флюорохромы имеют длительный срок флюоресценции;
г) низкая себестоимость, экономия реагентов и расходных материалов;
д) не требуется применения системы визуализации и канцерогенного хромогена — диаминобензидина;
б щ • .. aw. до*
□
Рис. 2. Больная И., 50 лет, клинический диагноз: «рак желудка, асцит»:
а — цитологическое исследование: метастаз перстне-видноклеточного рака, х200; б — СИЦХ: положительная экспрессия Ер-САМ, х200; в — ФИЦХ на тест-системе «Биочип-SER»: положительная экспрессия Ер-САМ, х200; г — контрольное цитологическое исследование на биочипе: метастаз перстневидноклеточного рака, х200
Рис. 3. Больная К., 59 лет, клинический диагноз: «рак яичников, асцит»:
а — цитологическое исследование: метастаз серозной папиллярной цистаденокарциномы яичника, х200; б — СИЦХ: положительная экспрессия Ер-САМ, х200; в — ФИЦХ на тест-системе «Биочип-SER»: положительная экспрессия Ер-САМ, х200; г — контрольное цитологическое исследование: метастаз серозной папиллярной цистаденокарциномы яичника, х200
е) использование телемедицины — возможность проведения в условиях поликлиники преаналитическо-го этапа обученным средним медицинским персоналом с дальнейшей передачей данных сканированных изображений в специализированный референсный центр.
Заключение
Рациональное использование современных дополнительных методов исследования позволяет расширить возможности и повысить качество дифференциальной диагностики метастатических аде-нокарцином, мезотелиом и реактивно измененного мезотелия в выпотах и смывах с серозных полостей, что снижает частоту гипо- и гипердиагностики опухолевого процесса.
Предлагаемая тест-система «Биочип-SER» с МКАТ к Ep-CAM, конъюгированному с Alexa Fluor 488, обладает рядом преимуществ в сравнении с принятым в мировой практике вариантом ФИЦХ-исследования, который является современным надежным методом диагностики опухолевого процесса в выпотных жидкостях. Это позволяет рекомендовать «Биочип-SER» для широкого применения как в специализированных учреждениях, так и на этапе первичного звена.
Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке ООО НПП «Биочип».
Конфликт интересов. ООО НПП «Биочип» не влияло на ход исследования и его результаты.
Литература/References
1. Семенов Д.А., Целуйко С.С. Гистофизиология плевральной полости и плеврального выпота. Дальневосточный медицинский журнал 2012; 2: 140-144. Semenov D.A., Tseluyko S.S. Histophysiology of the pleural cavity and pleural effusion. Dal'nevostochnyy meditsinskiy zhurnal 2012; 2: 140-144.
2. Долгов В.В., Шабалова И.П., Миронова И.И., Джангирова Т.В., Коротаев А.Л. Выпотные жидкости. Лабораторное исследование. М: Триада; 2006. Dolgov V.V., Shabalova I.P., Mironova I.I., Djangirova T.V., Korotaev A.L. Vypotnye zhidkosti. Laboratornoe issledovanie [Serous effusions. Laboratory diagnostics]. Moscow: Triada; 2006.
3. Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорная В.А., Крячок И.А. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. Киев: Морион; 2003. Gluzman D.F., Sklyarenko L.M., Nadgornaya V.A., Kryachok I.A. Diagnosticheskaya immunotsitokhimiya opukholey [Diagnostic immunocytochemistry of tumors]. Kiev: Morion; 2003.
4. Shidham V.B., Atkinson B.F. Cytopathologic diagnosis of serous fluids. Elsevier Saunders; 2007.
5. Савостикова М.В., Фурминская Е.Ю., Федосеева Е.С., Кудайбергенова А.Г. Флуоресцентное иммуно-цитохимическое исследование выпотов и смывов с серозных полостей при интраоперационной диагностике. Клиническая лабораторная диагностика 2017; 62(12): 742745. Savostikova M.V., Furminskaya E.Yu., Fedoseeva E.S., Kudaibergenova A.G. The fluorescent immune cytochemical analysis of exudations and washouts from serous cavities under intra-operational cytological diagnostic. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika 2017; 62(12): 742-745.
6. Лазарев А.Ф., Григорук О.Г., Базулина Л.М., Му-залевский П.Н., Кравцов В.Ю. Мезотелиома плевры:
////////////////////м^
40 СТМ J 2018 J том 10 J №4 С.В. Зиновьев, И.Г. Терентьев, О.В. Уткин, Е.Ю. Фурминская, Е.С. Федосеева, М.В. Савостикова
этиология, заболеваемость, диагностика, лечение, выживаемость. Российский онкологический журнал 2013; 5: 15-20. Lazarev A.F., Grigoruk O.G., Bazulina L.M., Muzalevskiy P.N., Kravtsov V.Yu. Pleural mesothelioma: etiology, incidence, diagnosis, treatment and survival. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal 2013; 5: 15-20.
7. Davidson B. Malignant nonhematological effusion characterization by flow cytometry. Acta Cytol 2016; 60(4): 365-371, https://doi.org/10.1159/000447687.
8. Болгова Л.С., Мариненко С.В. Современные возможности дифференциальной цитологической диагностики пролиферирующего мезотелия, мезотелиомы и метастазов рака (обзор литературы и результаты собственных исследований). Клиническая онкология 2015; 4(20). Bolgova L.S., Marinenko S.V. Modern possibilities of differential cytological diagnostics of proliferating mesothelium, mesothelioma and cancer metastases (literature review and results of own research). Klinicheskaya onkologiya 2015; 4(20).
9. Gabris S., Kern L. Two color immunostaining of pleural effusions with Ber-EP4 and CK5/6. Cytopathology 2004; 15(Suppl 2): 14.
10. Comin C.E., Saieva C., Messerini L. H-caldesmon, calretinin, estrogen receptor, and Ber-EP4: a useful combination of immunohistochemical markers for differentiating epithelioid peritoneal mesothelioma from serous papillary carcinoma of the ovary. Am J Surg Pathol 2007; 31(8): 1139-1148, https://doi.org/10.1097/pas.0b013e318033e7a8.
11. Schnell U., Cirulli V., Giepmans B.N. EpCAM: structure and function in health and disease. Biochim Biophys Acta 2013; 1828(8): 1989-2001, https://doi.org/10.1016/j. bbamem.2013.04.018.
12. Latza U., Niedobitek G., Schwarting R., Nekarda H., Stein H. Ber-EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelial. J Clin Pathol 1990; 43(3): 213-219, https://doi.org/10.1136/jcp.43 3.213.
13. Wang B., Li D., Ou X., Yi Q., Feng Y. Diagnostic
accuracy of Ber-EP4 for metastatic adenocarcinoma in serous effusions: a meta-analysis. PLoS One 2014; 9(9): e107741, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107741.
14. Maguire B., Whitaker D., Carrello S., Spagnolo D. Monoclonal antibody Ber-EP4: its use in the differential diagnosis of malignant mesothelioma and carcinoma in cell blocks of malignant effusions and FNA specimens. Diagn Cytopathol 1994; 10(2): 130-134, https://doi.org/10.1002/ dc.2840100207.
15. Волченко Н.Н., Борисова О.В. Роль эпителиального антигена Ber-EP4 в исследовании экссудата из серозных полостей. Российский онкологический журнал 2012; 2: 1822. Volchenko N.N., Borisova O.V. Role of epithelial antigen Ber-EP4 in the study of exudates from serous sacs. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal 2012; 2: 18-22.
16. Ordonez N.G. Value of the Ber-EP4 antibody in differentiating epithelial pleural mesothelioma from adenocarcinoma: the M.D. Anderson experience and a critical review of the literature. Am J Clin Pathol 1998; 109(1): 85-89, https://doi.org/10.1093/ajcp/109.1.85.
17. Ordonez N.G. The Immunohistochemical diagnosis of mesothelioma. Am J Surg Pathol 2003; 27(8): 1031-1051, https://doi.org/10.1097/00000478-200308000-00001.
18. Morimoto A., Ito A., Hashimoto K., Nakano A., Nagasaka T., Yokoi T. New diagnostic technique for rapid fluorescence immunocytochemical staining of adenocarcinoma and mesothelial cells using liquid-based cytology. Acta Cytol 2014; 58(5): 461-468, https://doi.org/10.1159/000367706.
19. Зиновьев С.В., Рачков В.В., Уткин О.В., Савости-кова М.В., Фурминская Е.Ю. Биочип для мультиплексного анализа и способ исследования клеток при диагностике онкологических заболеваний. Патент WO 2017/204674 A1. 2017. Zinoviev S.V., Rachkov V.V., Utkin O.V., Savostikova M.V., Furminskaya E.Yu. A biochip for multiplex analysis and a method of studying cells in the diagnosis of oncological diseases. Patent WO 2017/204674 A1. 2017.
