CC BY
8xalqaro ilmiy-amaliy anjumani
2022 yil 30 noyabr | scientists.uz
METILOTROFIK ACHITQISI PICHIA PASTORISNI FERMENTYORDA KO'PAYTIRISH SHAROITLARINI O'RGANISH Ashirov O.N.
Sadullayev T.X.
Yarilkaganova A.M.
Azimova Sh.S.
O'zR FA O'simlik moddalari kimyosi instituti Toshkent kimyo-texnologiya instituti https://doi.org/10.5281/zenodo.7369134
Annotatsiya. Pichia pastoris metilatrofik achitqisini fermentyorda ko'paytirish sharoitlari aniqlandi. Bunda uch bosqichli fermentatsiya strategiyasidan foydalanildi.
Kalit so'zlar: Pichia pastoris, fermentyor, glitserinli ozuqa muhit, metanolli ozuqa muhit, rekombinan oqsil.
ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ РАЗМНОЖЕНИЯ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS В ФЕРМЕНТЕРЕ
Аннотация. Определены условия размножения метилатрофных дрожжей Pichia pastoris в ферментере. Использовали трехэтапную стратегию ферментации.
Ключевые слова: Pichia pastoris, ферментер, глицериновая питательная среда, метанольная питательная среда, рекомбинантный белок.
INVESTIGATION OF THE CONDITIONS OF REPRODUCTION OF METHYLOTROPHIC YEAST PICHIA PASTORIS IN A FERMENTER
Abstract. The conditions for reproduction of methylatrophic yeast Pichia pastoris in the fermenter were investigated. A three-stage fermentation strategy was used.
Keywords: Pichia pastoris, fermenter, glycerin nutrient medium, methanol nutrient medium, recombinant protein.
Kirish. Komagataella phaffii - farmatsevtika sanoati uchun antitana fragmentlarini ekspressiyalash kabi heterologik oqsillarni ishlab chiqarish uchun eng ko'p ishlatiladigan achitqi turi hisoblanadi. Hujayra tizimlaridan biri sifatida Saccharomyces cerevisiae ga nisbatan bir qancha afzalliklarga ega, jumladan haroratga moslashuvchanlik, yuqori zichlikda o'sishi va yuqori darajada nazorat qilinuvchi promotorlar yoki uning methanol tasirida induksiyalanuvchi metanol oksidaza promotoridan yuqori darajada begona oqsillarni ekspressiyalash kabilarni keltirish mumkin [1-4]. K. phaffii avvalgi Pichia pastoris nomi bilan ma'lum edi, ammo P. pastoris 2009-yilda, aslida ikkita alohida turga mansub geterogen shtammlar uchun ishlatilishi aniqlangandan so'ng bunday nomlash to'xtatildi va ular K. phaffii va K. pastoris kabi nomlarga o'zgartirildi [5]. Rekombinant oqsillarning ekspressiyasi produtsent mikroorganizmlarning hujayra mexanizmlari bilan chambarchas bog'liq. Oxirgi 20 yil ichida E. coli ko'pchilik geterologik oqsillarni ishlab chiqarish uchun tanlangan «fabrika» vazifasini o'tayotgan edi. Biroq, E. coli ichki organellalarga ega bo'lmagan prokaryot bo'lib, posttranslyatsion modefikatsiya mavjud emas. Shu sababli, tadqiqotchilar eukariot organizm hisoblanuvchi Pichia pastoris ekspressiya tizimiga o'tdilar [6].
Material va metodlar.
Suyuq ozuqa muhitlar. Minimal glitserinli ozuqa muhiti MGY ( 1.34% YNB, 4 x 10-5 % biotin, 1% glitserol) yoki buferlangan minimal glitserinli ozuqa muhiti BMGY (100 mM kaliy
xalqaro ilmiy-amaliy anjumani
2022 yil 30 noyabr | scientists.uz
fosfat, pH 6.0 1.34% YNB, 4 x 10-5 % biotin, 1% glitserol). Orbital silkitgich inkubator (ES-20 Orbital Shaker-Incubator, Biosan, Latviya). Fermentor 30 L, Shanghai, China.
BSM tarkibi (Basal Salt Medium)
Tarkib Miqdor (g/l)
CaSO4 0,93
MgSO4-7H2O 14,9
K2SO4 36,4
KOH 4,13
Gletserin 50
H3PO4 kons. 44,76 (26.5 mh)
PTM1 (Pichia trace metals) tarkibi
Tarkib Miqdor (g/l)
CuSO4-5H2O 6,0
NaI 0,08
MnSO4H2O 3,0
Na2MoO4-2H2O 0,20
H3BO3 0,02
CoCl2 6H2O 0,50
ZnCl2 20,0
FeSO4 7H2O 65,0
H2SO4 9,19 (5,0 mh)
Biotin 0,2
Olingan natijalar va ularning muhokamasi.
Fermentatsiya jarayonining birinchi bosqichi.
Mazkur olib borilgan ilmiy tadqiqotdan maqsad metilatrofik achitqi Pichiq pastoris hujayrasini fermentyorda ko'paytirish sharoitlarini o'rganishdan iborat. Avvalo hujayralar shaker inkubtorda bir kecha davomida ularning optik zichliklari (OD600) 2-6 bo'lguncha, 30 °C da o'stiriladi va fermentyorga solinib fermentatsiya jarayoni boshlanadi. Bu jarayon asosan 3 bosqichni o'z ichiga oladi.
Birinchi faza - bu biomassani oshirish uchun glitserinli ozuqa muhit. Yuqori darajadagi hujayraga toksikligi tufayli maksimal 4% boshlang'ich glitserin kontsentratsiyasi tavsiya etiladi. Dastlabki muhitning hajmi mos ravishda umumiy reaktor hajmining 65-75% yoki 45-60% ni tashkil qilib induksiya faza uchun taxminan 72 soat vaqt sarflanadi. DO (eruvchan kislarot) va aylanish tezligi mutanosibligida fermentorning "cascade" funksiyasi orqali nazorat qilinishi mumkin. Hujayralarning yaxshi o'sishi uchun fermentyorga 25 % ammiyak eritmasidan solib pH 4-6 oralig'ida ushlab turildi. Harorat 30 °C ga sozlandi. Fermentatsiya jarayoni uchun BSM tuzli ozuqa muhiti ishlatildi.
Shu bilan bir qatorda, biz o'z tadqiqotimizda umumiy gaz oqimi uchun bitta massa oqimini boshqarish moslamasi bilan odatdagi kislorod qo'shimchali gazni aralashtirish strategiyasidan foydalandik, kaskad boshqaruvida DO maksimal yoki minimal aylanish tezlikda
xalqaro ilmiy-amaliy anjumani
2022 yil 30 noyabr | scientists.uz
30% o'rtasida ushlandi. Mazkur boqish fazasining oxiriga borib glitserol to'liq o'zlashtiriladi natijada DO keskin ravishda ko'tarildi. Birinchi fazaning oxirida nam xujayralar massasi 120 g/l ni tashkil qildi.
Fermentatsiya jarayonining ikkinchi bosqichi.
Bu bosqichda fermentyorga 5-6 soat davomida oldindan sterilizatsiya qilib qo'yilgan takibida 12 ml PTMi/l saqlovchi 50% glitserin olinib ozuqa muhitning har bir litr hajmiga nisbatan 18.15 ml miqdorda solib turiladi. DO va kislorod oqimi tezligi II fazada to'g'ri muvozanatlanganligi juda muhim bo'lganligi sababli DO kaskad nazorati faqat I bosqich oxirida yoki kislorod oqimi tezligi pasaygan bo'lsa DO tezligidan keyin yoki yo'q bo'lganda o'zgarishi kerak. Gazning umumiy oqimi 1-1.25 vvmda ushlangani maqsadga muvofiq. Aylanish tezligi odatda maksimal holatda belgilanib taxminan 80 dan 100% gacha oraliqda ushlanadi.
DO hech qachon 20% dan pastga tushishiga yo'l qo'yilmasligi kerak, shuning uchun tegishli signal nazorat qilish moslamasida dasturlashtirilishi kerak. Yoki glitserinni ko'payishini cheklash uchun ozuqa nasoslarini o'chirib qo'yish va DO ning 10% ga ko'tarilishini ta'minlash mumkin. Agar DO spike uchun kechikish vaqti qisqa bo'lsa, odatda bir daqiqadan kam bo'lsa, glitserin cheklangan deb taxmin qilinadi. DO 10% ga ko'tarilgach, glitserin taminotiga javob beruvchi nasosni yana yoqish mumkin. Agar DO glitserin uchun kaskad nazorati mavjud bo'lmasa, odatda 15 ml/soat/l muhit hajmida glitserinni qo'shib turish mumkin. Agar glitserin belgilangan tezlikda qo'shilsa, kisloroddan foydalanish tezligi ham belgilanadi, bu GFRC orqali yoki yuqorida aytib o'tilganidek kislorod qo'shishni va aylanish tezligini nazorat qilish orqali nazorat kaskadidan foydalanish mumkin. II bosqich oxirida, ko'paytirilgan nam hujayralarning miqdori 200 g/l. ga yetdi. Fermentyorning umumiy ko'rinishi 1-rasmda keltirilgan.
xalqaro ilmiy-amaliy anjumani
2022 yil 30 noyabr | scientists.uz
1-rasm. Fermentyorning umumiy ko'rinishi Fermentatsiya jarayonining uchinchi bosqichi.
III faza - har bir ekspression fenotipiga ko'ra farq qiluvchi metanol bilan to'yintirish yoki induksiya fazasi. Barcha holatlarda, muhitga methanol berishni boshlanishidan oldin glitserinning tugaganiga iqror bo'lish kerak. Bunga glitserin nasosini va DO kaskad boshqaruvini o'chirish orqali erishish mumkin, bunda DO ning 30% dan 100% gacha ko'tarilishi orqali nazorat qilinadi (DO spike). Yana e'tibor qaratish kerak bo'lgan holat shuki, Mut+ shtammlarda DO ni yana stabil 30% ga qaytarish uchun 1 dan 3 soatgacha vaqt ketishi mumkin. Agar DO kaskadi faol bo'lib qolsa, aralashma tarkibidagi kislorod miqdori vaqt o'tishi bilan kamayadi. Induktsiya davrida metanol to'planmasligini ta'minlash uchun, agar kerak bo'lsa, tez-tez DO spiklari qo'l bilan nazorat qilib turish mumkin.
III fazada havo yoki kislorod gazini GFRC yoki kislorod qo'shib aralashtirish bilan ishlatiladigan DO kaskadini boshqarish strategiyalari hali ham ishlatilishi mumkin, ammo havo va kislorod gazining oqimi va aralashmaning nisbati bo'yicha belgilangan nuqtalarni saqlab turish muhimdir. Kaskadni substratga (metanolga) dasturlash ham mumkin. E'tiborli tamoni, fermentordagi metanol darajasi juda muhim va ehtiyotkorlik bilan nazorat qilinishi kerak.
PTM1 tuzli eritmasidan 12 ml olinib 1 litr 99% li toza metanolga solinadi va o'sib turgan hujayra kulturasining 1 l ga nisbatan har soatda 1 ml dan (lml/soat/l) ikki soat davomida solib borildi. Shundan so'ng esa, metanol berib boshlangan vaxtdan boshlab 72 soat davomida yuqoridagi metanolli eritmadan 1 % miqdorda metanol solib turildi. Induksiyon fazasining oxirida, nam hujayralarning hajmi 320 g/l ni tashkil qiladi. Xulosa.
Metilatrofik Pichapastoris achitqi turi dastlab glitserinli ozuqa muhitida hujayralarning o'ptik zichligi 2-6 bo'lguncha o'stirildi. Shundan so'ng o'sgan kultura fermentyorga olinib 3 ta fazaga bo'linib ostirildi. Birinchi fazada 4 % glitserin solinib nam xujayralar massasi 120 g/l ga erishildi. Ikkinchi fazada muhitga 4-5 soat davomida 50% glitserin solinib hujayralarning yuqori biomassaga ega bo'lishi taminlandi va ko'paytirilgan nam hujayralarning miqdori 200 g/l. ga yetdi. Uchinchi fazada ozuqa muhitga dastlab hujayralar metanolga o'rganishi uchun 0.1% miqdorda, keyinchlik esa, umumiy 72 soat davomida 1 % metanol solinib umumiy nam hujayralarning hajmi 320 g/l ni tashkil qiladi.
REFERENCES
1. М.А. Эльдаров, Н.В. Дрожжи как фабрика для получения лекарств. Равин Центр «Биоинженерия» РАН1.
2. Ahmad M, Hirz M, Pichler H, Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98:5301-5317. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5.
3. Kurtzman CP. Biotechnological strains of Komagataella (Pichia) pastoris are Komagataella phaffii as determined from multigene sequence analysis. J Ind Microbiol Biotechnol. 2009;36:1435-1438. doi: 10.1007/s10295-009-0638-4. Love KR, Shah KA, Whittaker CA, Wu J, Bartlett MC, Ma D, Leeson RL, Priest M, Borowsky J, Young SK, Love JC. Comparative genomics and transcriptomics of Pichia pastoris. BMC Genomics. 2016;17:550. doi: 10.1186/s12864-016-2876-y.
xalqaro ilmiy-amaliy anjumani
2022 yil 30 noyabr | scientists.uz
4. Shen XX, Opulente DA, Kominek J, Zhou X, Steenwyk JL, Buh KV, Haase MAB, Wisecaver JH, Wang M, Doering DT, et al. Tempo and mode of genome evolution in the budding yeast subphylum. Cell. 2018;175(1533-1545):e1520.
5. Hamilton S.R., Gerngross T.U. Glycosylation engineering in yeast: the advent of fully humanized yeast. // Curr. Opin. Biotechnol, 2007. - V. 18. - P. 387-392. https://doi.org/10.10167j.copbio.2007.09.001.
