CC BY
4xalqaro ilmiy-amaliy anjumani
2022 yil 30 noyabr | scientists.uz
METILATROFIK ACHITQINI METANOLLI OZUQA MUHITIDA KO'PAYTIRISH
Zokirov Bekzod Ulashevich
Toshkent kimyo-texnologiya instituti Shahrisabz filiali kafedra mudiri Sobirjonova Gulmira Sobirjon qizi
Toshkent kimyo-texnologiya instituti Shahrisabz filiali kafedra asissenti Ulashev Dustmurod Sayitmurodovich
Toshkent kimyo-texnologiya instituti Shahrisabz filiali kafedra asissenti Ashirov Oybek Norboy o'g'li
Toshkent kimyo-texnologiya instituti Shahrisabz filiali dotsenti https://doi. org/10.5281/zenodo.7357784 Annotatsiya. Hozirgi kunda rekombinant oqsillarni sintez qilishda eng ko'p ishlatilayotgan tizimlardan biri bu metilatrofik Pichia pastoris achitqi ekspressiya tizimidir. Mazkur achitqi turi metanolni uglerod manbai va oqsil ekspressiyasida inisiator vazifasini bajaruvchi noyob tizim hisoblanadi. Bizning tadqiqotda rekombinant oqsil ekspressiyasi uchun ishlatiladigan metanolning optimal miqdorini o'rganish maqsad qilingan. Buning uchun ozuqa muhit tarkibiga 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5 % miqdorda methanol solindi va achitqining o'sish darajalari o'rganildi. Natija shuni ko'rsatdiki, ozuqa muhitga 1.5% methanol solinganda engyuqori o'sish darajasini namayon qildi.
Kalit so'zlar: Metilatrofik Pichia pastosis achitqisi, ekspressiya, MD, BMG, BMM ozuqa muhitlari, MOX, AOX.
РАЗМНОЖЕНИЕ МЕТИЛАТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ В МЕТАНОЛОВОЙ
ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ Аннотация. Одной из наиболее широко используемых систем для синтеза рекомбинантных белков является система экспрессии метилатрофных дрожжей Pichia pastoris. Этот вид дрожжей представляет собой уникальную систему, использующую метанол в качестве источника углерода и инициатора экспрессии белка. Наше исследование направлено на изучение оптимального количества метанола, используемого для экспрессии рекомбинантного белка. Для этого в питательную среду добавляли 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 2,0, 2,5% метанола и изучали уровень роста дрожжей. Результат показал, что наибольшая скорость роста наблюдалась при добавлении в среду 1,5% метанола.
Ключевые слова: Метилатрофные дрожжи Pichia pastosis, экспрессия, питательные среды MD, BMG, BMM, МОХ, АОХ.
REPRODUCTION OF METHYLATROPHIC YEASTS IN METHANOL
NUTRIENT MEDIUM Abstract. One of the most widely used systems for the synthesis of recombinant proteins is the expression system of the methylatrophic yeast Pichia pastoris. This yeast species is a unique system using methanol as a carbon source and protein expression initiator. Our study is aimed at studying the optimal amount of methanol used for the expression of the recombinant protein. To do this, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5% methanol was added to the nutrient medium and the level of yeast growth was studied. The result showed that the highest growth rate was observed when 1.5% methanol was added to the medium.
Keywords: Methylatrophic yeast Pichia pastosis, expression, nutrient media MD, BMG, BMM, MOX, AOX.
xalqaro ilmiy-amaliy anjumani
2022 yil 30 noyabr | scientists.uz
Metilotrofik achitqilar dastlab 1960-yillarning oxiri va 1970-yillarning boshlarida ajratib olingan [1]. Bu achitqilar uglerod va energiyaning yagona manbai sifatida metanoldan samarali foydalanish xususiyatiga ega. Metanni utelizatsiya qilishi metanol yoki alkagol oksidaza (MOX yoki AOX) fermentlarining mustahkam ekspressiyalanishi bilan bog'liq. Mazkur fermentlarning sinteziga javob beradigan genlarni (MOX yoki AOX) boshqaruvchi promotorlar tomonidan mahalliy va heterologik oqsillar yuqori darajada ekspressiyalanib kelinmoqda. [2,3] Sintezlangan geterologik oqsillar peroksisomalarda to'planadi va yuqori darajada ekspressiyalanganda peroksisomalar hujayra hajmining 80% ni egallab, hujayraning noyob xususiyatini namoyon qiladi. Pichia pastoris metilotrofik achitqi xisoblanib rekombinant oqsillar ishlab chiqararishda keng qo'llanilayotgan ekspressiya tizimlaridan biri xisoblanadi [4]
Material va metodlar. Pichia pastoris achitqisi (invitrogen), shaker inkubator, metanol, BMG ozuqa muhiti (100 mM kaliy fosfat pH 6.0, 1% glitserin, 1X YNB),Yeast Nitrogen Base (YNB), BMM ozuqa muhiti (100 mM kaliy fosfat pH 6.0, metanol, 1X YNB), MD agar qattiq ozuqa muhitib(1% glyukoza, 1X YNB, 1.5% agar agar), fotokolorimetr KOK-2.
Olingan natijalar va ularning muhokamasi. Mazkur olib borilgan tadqiqot ishidan maqsad Pichia pastoris metilatrofik achitqisining metanolda optimal ko'payish sharoitlarini aniqlashdan iborat. Buning uchun MD agar ozuqa muhitida o'sib turgan Pichia pastoris achitqi koloniyasidan olib 30 ml BMG ozuqa muhitli kolbaga ekdik. Kolbani shaker inkubatorga 30 °C li haroratga qo'ydik. Bunda kolbaning aylanib turishini ta'minlash maqsadida uskunani 140 ay/min ga sozladik (1-rasm).
1-rasm. Pichia pastoris hujayralarining shaker inkubatorda o'sishi.
Hujayralar ularning optik zichligi (OD600) 2-6 bo'lgunga qadar o'stirildi (15-20 soat) va ularning optik zichliklarini fotokolorimetrda o'lchandi. Shundan so'ng kolbalar olinib undagi o'sgan hujayralar probirkalarga ko'chirildi va 4500 ay/min da sentrifuga qilindi. Cho'kma metanollin BMM ozuqa muhitida eritilib toza steril kolbalarga solindi va shaker inkubatorga joylanib yuqorida keltirilgan sharoitlarga sozlandi. Bunda ozuqa muhitdagi metanolning miqdolari turlicha (0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5) qilib belgilandi (1-jadval).
xalqaro ilmiy-amaliy anjumani
2022 yil 30 noyabr | scientists.uz
1-jadval
Turli konsentratsiyali metanolda Pichiapastoris hujaralarining o'sish darajalari
Methanol miqdorlari % da O'sgan hujayralarning optik zichliklari (OD600) O'stirish davomiyligi (metanolli muhitda)
0.5 68 72 soat
0.75 70 72 soat
1.0 75 72 soat
1.25 78 72 soat
1.5 80 72 soat
2.0 77 72 soat
2.5 73 72 soat
Xulosa. Jadvaldan ko'rinib turibdiki hujayralar 1.5% metanolda yaxshi o'sish sur'atini namayon qilgan. Metanolning miqdori tushishi yoki ko'tarilishi bilan achitqi hujayralarining o'sish darajalari kamayib borgan. Demak Pichia pastoris achitqisi 1.5% metanolda optimal o'sish darajasini namoyon qular ekan.
REFERENCES
1. Do, H. D., Vandermies, M., Fickers, P., & Theron, C. W. (2019). Non-Conventional Yeast Species for Recombinant Protein and Metabolite Production. Reference Module in Life Sciences. doi:10.1016/B978-0-12-809633-8.20885-6 (https://doi.org/10.1016/B978-0-12-809633-8.20885-6)
2. Giuliana Mastropietro, Rochelle Aw, Karen M, Polizzi. Chapter Three - Expression of proteins in Pichia pastoris. Methods in Enzymology Volume 660, 2021, Pages 53-80.
3. Cregg, J. M. (2007). Introduction. Pichia Protocols, 1-10. doi:10.1007/978-1-59745-456-8_1 (https://doi.org/10.1007/978-1-59745-456-8 1)
4. Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophicyeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev 2000; 24:45-66.
