CC BY
3МЕТАНОТРОФ БАКТЕРИЯЛАРНИ ИЗЛАШ, АЖРАТИБ ОЛИШ ВА УСТИРИШ ШАРОИТЛАРИНИ ОПТИМАЛЛАШТИРИШ
1 2 3
Саъдуллаев Ш.Т., Пулатова О.М., Махсумханов А.А.
, , Узбекистон Республикаси Фанлар академияси Микробиология институти, Тошкент ш., Узбекистон, e-mail: [email protected] https://doi.org/10.5281/zenodo.8372658
Аннотация. Ушбу мацолада турли хил табиий манбалардан метанотроф бактерияларга хос булган 20 дан ортиц изолятлари ажратиб олинганлиги ва уларнинг баъзи бир морфо-културал хусусиятлари тадциц цилинганлиги ёритилган. Ажратиб олинган 4 та изолятларнинг усиб ривожланишига метан, метанол ва щр хил минерал азот манбаларининг таъсири урганилган.
Калит сузлар: Метанотроф, метан гази, метанол, изолят, биореактор, грам-манфий.
Аннотация. В данной статье представлены данные по выделению более 20 изолятов метанотрофных бактерий из разных природных источников и исследованию их некоторые морфо-культуральные свойства. Были исследованы влияния метана, метанола и минеральных источников азота на рост и развитие 4-х выделенных изолятов.
Ключевые слова: Метанотроф, газ метан, метанол, изолят, биореактор, грамотрицательный.
Abstract. This paper presents data on the isolation of more than 20 isolates of methanotrophic bacteria from various natural sources and the study of their some morphological and cultural properties. The effects of methane, methanol and mineral nitrogen sources on the growth and development of 4 isolated isolates have been investigated.
Keywords: Methanotroph, methane gas, methanol, isolate, bioreactor, gram-negative.
Бугунги кунда кишлок хужалигининг чорвачилик, паррандачилик, баликчилик, куёнчилик ва бошка сохаларида энг мухим муаммолардан бири - кишлок хужалиги хайвонларини озиклантириш учун зарур булган озукавий оксилнинг етишмаслигидир. Маълумки, озукавий оксилнинг аксарият кисми мамлакатимизга чет эллардан импорт килиш эвазига олиб келинади ва бу озука-емларнинг таннархини ошишига хамда хужаликларнинг рентабеллигини пасайишига олиб келмокда. Мукобил озукавий оксил манбаси сифатида метанотроф бактерияларнинг биомассаси хизмат килиши мумкин ва бу куп адабиёт манбаларида келтирилган [1, 2]. Сунги 20 йил ичида метанотрофлар кимёвий моддаларни ва хужайра оксилини ишлаб чикариши хамда биотрансформация жараёнларида иштирок этиш имкониятлари туфайли катта кизикиш уйготмокда [3].
Метанотроф бактериялар - шарсимон (кокк), таёкчасимон, овалсимон, вибрионлар, айримлари капсула хосил килади, айримлари капсула хосил килмайди, метанотроф бактериялар, ер юзининг турли хил экологик тизимларида, жумладан, табиатда метан гази чикувчи кудуклар атрофида ёки боткокликларда куп таркалган булади [2]. Бу гурухга мансуб бактериялар аксарияти грам-манфий булиб, уларда метан газини оксидловчи метан-монооксигеназа ферменти фаоллиги юкори булади. Метанотрофлар факат метанда усиши билан ажралиб туради, аммо баъзилари метонолда хам усиши мумкин [4]. Метанотроф бактериялар метанни биофилтрлаш ва оксидлаш учун биокаталитик потенциалга эга булган микроорганизмлардир [5]. Аэроб метанотрофлар метандан ягона
углерод ва энергия манбаи сифатида фойдаланади [6]. Метанотроф бактериялар метанни фаол узлаштириб, оксил ва витаминлар хамда бошка биологик фаол бирикмаларга бой биомасса хосил килади [7]. Метанотроф бактериялар асосида олинган оксил концентратлари кишлок хужалигининг асосан чорвачилик, паррандачилик ва баликчилик сохалари учун оксилга бой озука хисобланади [8]. Метанотроф бактериялардан олинадиган оксил аминокислоталари таркиби буйича балик уни аминокислоталарига якин булиб, айникса баликларда хазм булиш даражаси юкоридир [9].
Тадкикотнинг максади илк бора Узбекистон худудининг хар хил табиий метан хосил буладиган манбаларидан метанотроф бактерия штаммларини ажратиб олиш, скрининг килиш ва устириш шароитларини оптималлаштиришдан иборатдир.
Тадкикот материаллари ва усуллари
Мазкур тадкикот ишида, метанотроф бактерия штамларини ажратиб олиш учун тадкикот обьекти сифатида Республикамизнинг турли худудларидан жами 78 та хар хил тупрок, сув, иссик булок суви, балчик, нефт колдиклари, нефт кони атрофидаги балчик, дарё балчиклари, эски балик кули хавзалари, шоли далалари тупрокларидан олинган намуналар табиий манба сифатида фойдаланилди.
Дастлаб метанотроф бактерияларни йигма култураларни устириш учун LF [2] NaNO3 - 2.0 г/л; MgSO4 x7H2O - 0,2 г/л; Na2HPO4xH2O - 0,2 г/л; NaH2PO4 - 90 мг/л; KCl - 40 мг/л; CaCl2 - 15 мг/л; FeSO4x7H2O - 1 мг/л; CuSO4x5H2O - 5 мкг/л; H3BO3 - 10 мкг/л; MnSO4x5H2O - 10 мкг/л; ZnSO4x7H2O - 70 мкг/л; MoO3 - 10 мкг/л, pH = 6,8-7,0 минерал озука мухитидан, кейинчалик метанотроф бактерияларни ажратиш учун куйидаги таркибга эга NMS нитрат минерал озука мухити дан фойдаланилди [3]: (NH4)2SO4 - 1,0 г/л; MgSO4x7H2O - 0,5 г/л; Na2HPO4x 12H2O - 0,05 г/л; KH2PO4 - 0,05 г/л; CaCh - 0,2 г/л, Трилон Б (Na2-EDTA) - 0,005 г/л, FeSO4x7H2O - 0,002 г/л, ZnSO4x7H2O- 0,1 мг/л, C0CI2 -0,2 мг/л, MnCl2x4H2O - 0,03 мг/л, CuCh - 0,01 мг/л, NiCl2x6H2O - 0,02 мг/л, Na2MoO4 - 0,03 мг/л.
Бунда колбаларда тайёрланган 90 мл LF ва NMS суюк озука мухитига олиб келинган намуналардан 10 мл ёки 10 г дан экилиб анаэростатга жойлаштирилди хамда табиий метан гази босими остида 40 °С да устирилди. Анаэростатга хар куни 1 марта метан гази юбориб турилди. Бир хафтадан сунг LF ва NMS суюк озука мухитига экилган намуналарда узгариш кузатилди, яъни колбалардаги озука мухити хиралашгани ва газ хосил булганлиги кузатилди. Колбаларда усган култураларни физиологик эритмада 5 марта суюлтирилиб Петри чашкасига тайёрланган LF ва NMS каттик озука мухитига экилди, алохида ажралиб усиб чиккан колониялардан бактериологик халка ёрдамида олиб 1 марта физиологик эритмада суюлтирилиб янги чашкаларга экилди [10]. Ажратиб олинган изолятлар микроскопда ва грам усулида буяш йули билан тадкик килинди.
Натижалар ва уларнинг мух,окамаси
Олиб борилган тадкикотларда 78 та намунадан суюлтириб экиш натижасида 54 та бактерия изолятлари агарли NMS минерал озука мухитида метан гази босими остида инкубация килиб ажратиб олинди. Ажратиб олинган бактериялардан 20 дан ортик изолятлари грам-манфий таёкчалар ва метанотрофларга хос морфологик хусусиятларга эга кокклар эканлиги аникланди. Бу метанотрофларга хос белгилардан бири хисобланади [11] (1 ва 2 расм).
Расм 1. Нефт 2/3 изолятининг Петри чашкасида усиши ва Грам усулида буялган хужайралари.
с-
С
Расм 2. М/Ш изолятининг Петри чашкасида усиши ва Грам усулида буялган хужайралари.
Метанотроф бактерия изолятларини суюк озука мухитида устириш учун мини-биореактор курилмаси ясалди, термостат ичида 42 оС хароратда магнитли аралаштиргич ёрдамида ва барботаж килиб метан ва хаво (1:1 нисбатда) аралашмаси юборилиб турилди хамда уларнинг усиши ва биомасса туплаши урганилди (Расм 3). Лекин, таъкидлаш жоизки, идеал метан-хаво аралашмаси билан туйинган суюк озука мухити шароитини яратиш бирмунча кийин булган мухандислик ечимларни талаб килиши адабиётларда келтирилган [12]. Олиб борилган изланишлар шуни курсатдики, метан газининг суюк озука мухитида аралашиши ва эриши жуда пассив булиб, хаво ва суюк фазаларга ажралиб колиш холатлари кузатилди.
Метанотроф бактерияларни бирламчи ажратиб олиш ва уларни усиш тезлигини аниклаш учун оксидланган метан гази, яъни метанолдан фойдаланиш купгина муаллифлар томонидан кайд этилган [13, 14]. Шунинг учун бизнинг тадкикотларимизда хам метанолнинг хар хил микдорлари суюк озука мухитига 0.01% дан 4% гача булган концентрацияларда булиб-булиб кушиб урганилди. Натижада, Нефт 2/3 изоляти учун 2% ли метанолни суюк озука мухитига кушиб устириш оптимал эканлиги аникланди. М/Ш изоляти эса 1% метанолда яхши усганлиги кузатилди.
Кейинги тадкикотларда Нефт-2/3, Нефт-4/3, М/Ш ва Нефт-5/1 изолятларини NMS озука мухитига хар хил азот манбалари (NaNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4, NaNO3 + пептон) кушиб, шейкер инкубаторда 150-170 айл./дак. тезликда, 35-37 оС хароратда, 1% метанол
билан устириш натижасида (NH4)2SO4 -1г/л; хамда NaNO3 -2 г/л; + пептон 0,1 г/л; озука мухитида изолятлар яхши усганлиги кузатилди (Расм 4).
о «
S
Расм 3. Метанотроф бактерияларни устириш учун мини-биореактор курилмаси. 0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Нефт Нефт М/Ш Нефт 2/3 4/3 5/1
Na NO3
Нефт М/Ш Нефт Нефт 2/3 4/4 5/1
NH4CL
Нефт Нефт М/Ш Нефт 2/3 4/3 5/1
(NH4)2SO4
Нефт Нефт М/Ш Нефт 2/3 4/3 5/1
Na NO3+ П
1-кун и2-кун и3-кун и4-кун и5-кун "б-кун >7-кун "В-кун
Расм 4. Метанотроф изолятларининг 1%-ли метанол ва хар хил азот манбалари тутувчи NMS минерал озука мухитида усиши.
Тадкикот натижалари шуни курсатдики, ажратиб олинган 20 дан ортик изолятлар грам-манфий булиб, метанотрофларга хос морфологик хусусиятларга эга кокклар эканлиги аникланди. Ажратиб олинган баъзи изолятлар суюк озука мухитида метан гази билан устирилганда усиши пассив булганлиги аникланди. Метанотроф бактерияларни бирламчи ажратиб олиш ва уларни усиш тезлигини аниклаш учун оксидланган метан гази, яъни метанолдан фойдаланилди. Нефт-2/3 изоляти учун 2% ли метанолни суюк озука мухитига кушиб, М/Ш изоляти учун эса 1% метанол кушиб устириш оптимал эканлиги кузатилди. Нефт-2/3, Нефт-4/3, М/Ш ва Нефт-5/1 изолятлари NMS минерал озука мухитига (NH4)2SO4, -1г/л; хамда NaNO3 - 2 г/л;+ пептон - 0,1 г/л; кушилганда яхши усганлиги кайд этилди.
88882222
REFERENCES
1. Haritha Meruvua, Hui Wub, Ziyue Jiaoa, Liyan Wangc, Qiang Fei. From nature to nurture: Essence and methods to isolate robust methanotrophic bacteria. Synthetic and Systems Biotechnology 5 (2020) 173-178.
2. В.Ф. Гальченко. Метанотрофные бактери. Москва: изд. ГЕОС. 2001. С. 500.
3. Rahalkar MC, Khatri K, Pandit P, Bahulikar RA and Mohite JA (2021) Cultivation of Important Methanotrophs from Indian Rice Fields. Front. Microbiol. 12:669244. doi: 10.3389/fmicb.2021.669244
4. Igor Y. Oshkin, a Ruslan Z. Suleimanov, a Valentina N. Khmelenina, b Andrey V. Mardanov, c Nikolai V. Pimenov, a Svetlana N. Dedysha. Complete Genome Sequence of Methylococcus capsulatus MIR, a Methanotroph Capable of Growth on Methanol. September 2022 Volume 11 Issue
5. М.С. Бакунина, А.Л. Пономарева, С.С. Дубовчук, А.И. Еськова, Р.Б. Шакиров, А.И. Обжиров. Вестник ДВО РАН. 2020. № 5
6. О.В. Прокудина, Г.В. Песцов, А.В. Третьякова. Выделение метанотрофных бактерий из природных биоценозов и подбор питательных сред, оптимальных для культивирования в лабораторных условиях. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, Том 14, №6, 2022
7. May L. K. Khider, Trygve Brautaset, Marta Irla. Methane monooxygenases: central enzymes in methanotrophy with promising biotechnological applications. World Journal of Microbiology and Biotechnology (2021) 37:72 https://doi .org/10.1007/s11274-021-03038-x
8. RICHARD S. HANSON1 * AND THOMAS E. HANSON2. Methanotrophic Bacteria. MICROBIOLOGICAL REVIEWS, June 1996, p. 439-471 Vol. 2 0146-0749/96/$04.0010 Copyright q 1996, American Society for Microbiology
9. Ankit Gupta, Ahmad Ahmad, Dipesh Chothwe, Midhun K. Madhu, Shireesh Srivastava and Vineet K. Sharma. Genome-scale metabolic reconstruction and metabolic versatility of an obligate methanotroph Methylococcus capsulatus str. Bat. DOI 10.7717/peerj.6685
10. Yinghao Yua, Juliana A. Ramsaya, Bruce A. Ramsaya,b,* Production of soluble methane monooxygenase during growth of Methylosinus trichosporium on methanol. Journal of Biotechnology 139 (2009) 78-83
11. Tatyana S. Tikhomirova, Sergey Y. But. Laboratory scale bioreactor designs in the processes of methane bioconversion: Mini-review. Biotechnology Advances 47 (2021) 107709
12. Jisun Kim, DaeHyun D. Kim & Sukhwan Yoon. Rapid isolation of fast-growing methanotrophs from environmental samples using continuous cultivation with gradually increased dilution rates. Applied Microbiology and Biotechnology (2018) 102:5707-5715 https://doi .org/10.1007/s00253-018-8978-5
13. Miye Kwon, Adrian Ho, Sukhwan Yoon. Novel approaches and reasons to isolate methanotrophic bacteria with biotechnological potentials: recent achievements and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology (2019) 103:1-8 https://doi.org/10.1007/s00253-018-9435-1
14. Kumal Khatri, Jyoti Mohite, Pranitha Pandit, Rahul A. Bahulikar and Monali C. Rahalkar. Isolation, Description and Genome Analysis of a Putative Novel Methylobacter Species
('Ca. Methylobacter coli') Isolated from the Faeces of a Blackbuck (Indian Antelope). Microbiol. Res. 2021, 12, 513-523. https://doi .org/10.3390/microbiolres12020035
1513
