6https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-04-11
Механизм регенерации тканей грудной конечности на примере иглистого тритона
А.А. Ганцгорн, аспирант, ORCID 0000-0001-9329-6004, Н.В. Донкова, доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный университет» Минсельхоза России, 660049, Россия, Красноярск, пр. Мира, д. 90 Е-mail: alena.rubay@mail.ru
Резюме. В статье приведены результаты микроструктурного исследования регенерирующих тканей грудной конечности иглистого тритона после тотальной резекции с учетом гистологических и гистохимических особенностей, а также рассмотрены сроки и механизм формирования различных тканевых структур - хрящевого матрикса, мышечной ткани и кожи. Исследования проводили в гистологической лаборатории кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета в 2021 г. Изготовленные на микротоме срезы окрашивали гематоксилином и эозином методом Ван Гизона, Маллори и альциановым синим по Шиффу. Срезы просматривали под бинокулярным микроскопом Микомед-5 и проводили микрофотосъемку фотокамерой Canon PC 1201. Установлено, что на 62-е сутки после ампутации грудной конечности тритона завершается формирование основных анатомических структур регенерирующей конечности - плечевой кости, костей предплечья, запястья, пясти и пальцев. Регенерация конечности обусловлена рядом закономерностей - делением клеток фибробластического ряда, ориентированных по направлению роста регенерата, формированием вокруг них матрицы светооптически плотной ткани и образованием зоны хрящевой ткани в области суставных поверхностей. Особенностью посттравматического гистогенеза хрящевой кости у тритонов после тотальной ампутации грудной конечности является последовательное формирование структур хрящевой кости с последующим морфофункциональным созреванием хондроцитов и матрикса. Одновременно происходит развитие поперечнополосатых мышц, покрытых тонкой кожей, с 3-6 слоями многослойного неороговевающего эпителия и функционально активными железами, что определяет дефинитивное развитие конечности тритона. На 62-е сутки регенерации в проксимальных отделах пястных костей в хондромукоиде определяются кислые мукополисахариды, выявляемые методом Шиффа с альциановым синим. Такая морфологическая и гистохимическая дифференцировка свидетельствует о том, что сначала образуется морфологический (структурный) матрикс хрящевой кости, а позднее идет насыщение аморфного вещества кислыми мукополисахаридами, определяющими морфофункциональную зрелость хондроцитов и хондромукоида в регенерирующих костях конечности тритона.
Ключевые слова: регенерация, тритон, грудная конечность, гистология,гистохимия
Для цитирования: Ганцгорн А.А., Донкова Н.В. Механизм регенерации тканей грудной конечности на примере иглистого тритона. Лабораторные животные для научных исследований. 2021; 4:98-103. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-04-11
The mechanism of regeneration of the tissue of the chest on the example
of needle ether
A.A. Ganzgorn, postgraduate student, ORCHID 0000-0001-9329-6004, N.V. Donkova, Doctor of Veterinary Sciences, Professor Krasnoyarsk State Agrarian University, Krasnoyarsk Russia, Krasnoyarsk, Mira prospect., 90 Е-mail: alena.rubay@mail.ru
Abstract. The article presents the results of a microstructural study of the regenerating tissues of the thoracic limb of the needle-shaped newt after total resection, taking into account the histological and histochemical features, and also considers the timing and mechanism of the formation of various tissue structures: cartilage matrix, muscle tissue and skin. The studies were carried out in the histological laboratory of the Department of Anatomy, Pathological Anatomy and Surgery
2021 LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE №4
of the Institute of Applied Biotechnology and Veterinary Medicine of the Krasnoyarsk State Agrarian University in 2021. The sections prepared on a microtome were stained with hematoxylin and eosin, using the Van Gieson method, Mallory and Schiff's alcian blue. The sections were examined under a Mikomed-5 binocular microscope and microphotography was performed with a Canon PC 1201 camera. It was found that on the 62nd day after amputation of the triton's thoracic limb, the formation of the main anatomical structures of the regenerating limb is completed: the humerus, the bones of the forearm, wrist, metacarpus and fingers. Regeneration of the limb is due to a number of regularities: the division of cells of the fibroblastic row, oriented in the direction of growth of the regenerate, then the formation of a matrix of light-optically dense tissue around them and the formation of a zone of cartilaginous tissue in the area of articular surfaces. A feature of posttraumatic histogenesis of cartilaginous bone in newts after total amputation of the thoracic limb is the sequential formation of cartilaginous bone structures followed by morphofunctional maturation of chondrocytes and matrix.At the same time, the development of striated muscles, covered with thin skin with 3-6 layers of multilayer non-keratinizing epithelium and with functionally active glands and functionally active glands, occurs, which determines the definitive development of the newt limb. On the 62nd day of regeneration in the proximal parts of the metacarpal bones in the chondromucoid, acidic mucopolysaccharides detected by the Schiff method with alcian blue are determined. Such morphological and histochemical differentiation indicates that first the morphological (structural) matrix of the cartilaginous bone is formed, and later the amorphous substance is saturated with acidic mucopolysaccharides, which determine the morphofunctional maturity of chondrocytes and chondromucoid in the regenerating bones of the newt limb.
Key words: regeneration, newt, thoracic limb, histology, histochemistry.
For citation: Gantsgorn A.A., Donkova N.V. The mechanism of regeneration of the tissue of the chest on the example of needle ether. Laboratory Animals for Science. 2021; 4: 98-103. https://doi.org/10.29296/2618723X-2021-04-11
Введение
Травмы и переломы конечностей встречаются довольно часто как у человека, так и у животных, при этом процесс пострепаративной регенерации тканей зависит от многих факторов в том числе от видовых и от индивидуальных особенностей организма. В частности, у крупных животных, таких как лошади или коровы, этот процесс протекает тяжелее, а исход болезни часто неблагоприятный. Так, при переломе костей конечностей эти животные, как правило, подлежат убою вследствие неэффективности проводимого лечения. В случае полной утраты конечности восстановление становится невозможным из-за недостаточной регенераторной лабильности костно-мышечного аппарата. Однако в животном мире имеются исключения, например, у иглистых тритонов после полной утраты грудных или тазовых конечностей наблюдается их полная морфологическая регенерация с восстановлением функциональной активности [1]. Механизм этого процесса полностью не изучен.
Известно, что в организме постоянно идут два противоположных процесса - физиологическая регенерация и резорбция, при этом в губчатом веществе костной ткани эти процессы более интенсивны, чем в компактном. Костная ткань чутко улавливает малейшие изменения физической нагрузки, в ответ на которые возникает перестройка (ремодуляция), это придает костной ткани большую износоустойчивость [2].
Регенерация костной ткани может осуществляться путем прямого и непрямого гистогенеза костной ткани. Прямой остеогистогенез осуществляется непосредственной трансформацией мезенхимы, при этом образуется грубоволокнистая костная ткань, которая впоследствии замещается пластинчатой костной тканью. В прямом остеогисто-генезе различают 4 стадии: обособление остеоген-ного островка, остеоидная стадия, минерализация межклеточного вещества, перестройка и рост кости. Непрямой остеогистогенез происходит на месте хряща, при этом сразу образуется пластинчатая костная ткань. В этом случае также можно выделить 4 этапа: образование хрящевой модели будущей кости, в области диафиза возникает перихон-дральное окостенение, эндохондральное окостенение, перестройка и рост кости [2].
Поскольку полное восстановление конечности после ее удаления описано только у тритонов [1], представляется актуальным изучение механизма регенерации удаленной конечности на основе микроструктурного анализа тканей регенерата.
Цель работы - изучить возможность использования иглистого тритона для проведения доклинических исследований по изучению регенерации тканей на примере резекции грудной конечности.
Материал и методы
Исследования проводили на базе гистологической лаборатории кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины
Красноярского государственного аграрного университета в 2021 г.
Объектом исследования служили самки иглистого тритона, приобретенные в зоомагазине (Красноярск, Россия). Для проведения исследования взяты 9 особей в возрасте 11 мес. Средняя масса самки тритона составляла 5,49±0,18 г. Тритоны содержались в трех оборудованных аквариумах объемом 15 л, группами по 3 особи в каждой. На дно аквариума помещались камни, которые были необходимы как вспомогательные средства в период линьки, высаживались живые растения Криптокорина ундулата (Сгур!осогупе ип^Ыа), или волнистая. Воду непрерывно фильтровали, поддерживая температуру 20-25°С. Уровень воды составлял 20-25 см, так как тритоны дышат кислородом, им необходимо периодически всплывать на поверхность. Кормление тритонов проводили 1 раз в 3 дня сырой куриной печенью. Содержание и кормление осуществляли в соответствии с рекомендациями [3].
Исследования проведены в соответствии сДирективой 2010/63/Еи Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях и с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986).
Материалом для исследования послужила регенерирующая культя грудной конечности на 62-е сутки после тотальной ампутации. Ампутацию производили после введения животного в состояние анабиоза путем постепенной гипотермии, которую осуществляли, понижая температуру с 23 до 0°С, используя кусочки льда. Далее животных выводили из состояния анабиоза путем повышения температуры воды с 0°С до комнатной температуры и возвращали обратно в аквариум для наблюдения (оценка процесса регенерации).
Культю погружали в 9% раствор забуференного нейтрального формалина (ХимТТ Екатеринбург, Россия) на 3 сут. Затем переносили в 5% водный раствор азотной кислоты (ПК Химпром, Россия) на 5 сут с ежедневной сменой раствора. Далее следовала промывка в проточной воде, проводка через батарею изопропиловых спиртов возрастающей концентрации, погружение в вазелиновое масло, пропитывание в 4 порциях парафина и заливка в блоки [4]. Изготовленные на микротоме срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Ван Гизона [5]. Для гистохимических исследований препараты окрашивали по методу Маллори и аль-циановым синим по Шиффу. Срезы просматривали под бинокулярными микроскопом Микомед-5
(ЛОМО, Россия) и проводили микрофотосъемку фотокамерой Canon PC 1201 (Canon, Китай).
Результаты и обсуждение
После ампутации грудной конечности тритона к 62-м суткам образовалась регенераторная культя, которая включала морфологически сформированный костно-мышечный аппарат, состоящий из плечевой кости, локтевого сустава, костей предплечья, запястья, пясти и пальцев. Различные способы окраски позволили установить степень диф-ференцировки тканевых структур и функциональную активность регенерирующей конечности.
На продольных срезах формирующейся культи хорошо просматривались тканевые структуры, отражающие степень регенерации в направлении от проксимальных к дистальным участкам отрастающей конечности. К 62-м суткам вся исследуемая конечность покрывалась тонким слоем кожи, состоящим из 3-6-слойного эпителия, лежащего на базальной мембране. При окраске гистологических срезов по методу Маллори хорошо видно, что основа кожи представлена взаимно переплетающимися волокнами соединительной ткани, преимущественно коллагеновыми, окрашенными в синий цвет; встречались немногочисленные эластические волокна (окрашены в желтый цвет) (см. рисунок, а). Развитие волокнистой основы дермы обеспечивало достаточную функциональную лабильность кожи на данном этапе регенерации. В подкожной клетчатке, представленной рыхлой волокнистой неоформленной соединительной тканью (см. рисунок, б), хорошо просматривались округлой формы железы, заполненные ШИК-позитивным (красный цвет) веществом (см. рисунок, в, г). В проксимальной части культи клетки и тканевые структуры наиболее развиты и имеют близкий к дефинитивным вид. В дистальном участке наблюдались малодифференцированные клетки, клетки в начальных стадиях развития.
Под кожей определялись пучки продольно ориентированных скелетных мышечных волокон. На срезах, окрашенных реактивом Маллори, видны переплетения мышечных (красных) и эластических (розовых) волокон. Между пучками мышц хорошо развит эндомизий. По ходу мышечного волокна просматривались участки, окрашенные в голубой и красно-рыжий цвет, что свидетельствовало о становлении процесса синтеза миоглобина. Мышечные волокна располагались рыхло, переплетались между собой, напоминая сеть. По ходу волокна видны узлы сокращения, при этом уровень формирования поперечнополосатой исчерченности мышечного волокна в проксимальных и дистальных отделах регенерирующей конечности не одинаков. В проксимальном от-
Регенерирующая конечность тритона. Окраска по: I - Маллори, II - Ван Гизону, III, IV -альциановым синим по Шиффу; а - кожа; б - подкожная клетчатка; в - железы; г - мышцы; д - надхрящница; е - хон-дробласты; ж - хондроциты; з - хондромукоид; и - бластемные клетки. Ув. х10, х40, х400
деле регенерирующей конечности поперечнополосатая исчерченность мышечного волокна была сформирована. В дистальном отделе в мышцах миофи-бриллы немногочисленны и располагались хаотично. В области локтевого сустава к этому периоду регенерации мышечная ткань пока не имела характерной поперечнополосатой исчерченности и не заполнена миоглобином. В формирующейся мышечной ткани встречается много пигментных включений в виде черных гранул. Межмышечные соединительнотканные прослойки представлены коллагеновыми волокнами, отчетливо выявляемыми на срезах, окрашенных по Маллори (см. рисунок, а).
В центре регенерирующей грудной конечности к 62-м суткам регенерации сформирована хрящевая основа плечевой кости, локтевого сустава, костей предплечья, пясти и пальцев. Хрящевая кость снаружи покрыта надхрящницей, в составе которой обнаруживались преимущественно колла-геновые волокна и хондробласты уплощенной формы. Коллагеновые волокна, окрашенные в красный цвет по методу Ван Гизона, имели извилистую структуру с нечеткими границами и располагались в зоне надхрящницы и гиподермы (см. рисунок, б). В проксимальных участках хрящевых костей просматривались более молодые клетки
в зоне роста хряща - хондробласты, которые занимали область суставной поверхности эпифизов. Встречались митотически делящиеся клетки, что свидетельствует об интенсивном остеогенезе. Хондромукоид, заполняющий пространство между хондроцитами и хондробластами, имеет гомогенную оксифильную структуру (см. рисунок, б). При окраске альциановым синим в хондромукоиде обнаруживались кислые мукополисахориды, окрашенные в синий цвет (см. рисунок, в, г).
В зоне незрелой хрящевой ткани выявляется базофильно окрашенный участок, четко ограниченный от окружающих тканей. Хондробласты располагаются тяжами в поперечном направлении, в каждом тяже насчитывается от 13 до 15 хондроб-ластов. Их ядра имеют округлую форму располагаются либо в центре, либо смещены к периферии клетки. Цитоплазма в большей части не окрашена, но вокруг ядра сохранены участки оксифильной протоплазмы (см. рисунок, а).
В сформировавшихся хрящевых костях кисти, а именно - в проксимальных отделах пястных костей, хондромукоид содержит кислые мукополиса-хариды, тогда как в дистальных отделах пястных костей и пальцах на 62-е сутки регенерации муко-полисахариды еще не выявлялись. На рисунке (в, г) отчетливо видна граница между морфофункцио-нально зрелой и незрелой хрящевой тканью. Такая морфологическая и гистохимическая дифференци-ровка свидетельствовала о том, что сначала формируется морфологический (структурный) матрикс хрящевой кости, а позднее идет насыщение аморфного вещества кислыми мукополисахаридами, определяющими морфофункциональную зрелость хондроцитов и хондромукоида в регенерирующих хрящевых костях грудной конечности тритона.
Заключение
После тотальной ампутации грудной конечности у тритона к 62-м суткам завершается формирование основных анатомических структур регенерирующей конечности: плечевой кости, костей предплечья, запястья, пясти и пальцев. Регенерация конечности обусловлена рядом закономерностей: происходит делением клеток фибробластического ряда, ориентированных по направлению роста регенерата, формированием вокруг них матрицы све-тооптически плотной ткани и образованием зоны хрящевой ткани в области суставных поверхностей. Особенностью посттравматического гистогенеза хрящевой кости у тритонов после тотальной ампутации грудной конечности является последовательное становление структур хрящевой кости с дальнейшим морфофункциональным созреванием хондроцитов и матрикса, а также развитием
поперечнополосатых мышц, покрытых тонкой кожей с 3-6 слоями эпителия и функционально активными железами, что определяет дефинитивное развитие конечности тритона.
Таким образом, иглистого тритона можно рассматривать в качестве перспективной тест-системы для проведения доклинических исследований по изучению регенерации тканей на примере резекции грудной конечности.
Благодарности
Работа выполнена без спонсорской поддержки.
Вклад авторов
А.А. Ганцгорн - разработка концепции исследования, проведение экспериментов, анализ результатов, написание рукописи.
Н.В. Донкова - научное консультирование, утверждение окончательного варианта статьи для публикации.
Сведения о конфликте интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgements
The study was performed without external funding
Author's Contribution
Gantsgorn A.A. - development of a research concept, conducting experiments, analyzing the results, writing a manuscript.
Donkova N.V. - scientific consulting, approval of the final version of the article for publication.
Conflict of interest
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература
1. Рубай, А.А., Донкова, Н.В. Микроструктура ре-генирирующих тканей грудной конечности тритона // ВестникКрасГАУ. - 2014 - №8 - С. 92-96 [Rubai, A.A., Donkova, N.V. Mikrostruktura regeniriruyushchikh tkanei grudnoi konechnosti tritona // VestniKKraSGAU. - 2014 -№8 - S. 92-96 (In Russ)].
2. Хруствлева, И.В. Анатомия домашних животных /И. В. Хрусталева, Н. В. Михайлов, Я. И. Шнейберг и др.
- Изд-во М.: «Колос». 2000. - 704 с. [Khrustvleva, I.V. Anatomiya domashnikh zhivotnykh /I. V. Khrustaleva, N. V. Mikhailov, YA. I. Shneiberg i dr. - Izd-vo M.: «KoloS». 2000.
- 704 s. (In Russ)].
3. Шмиц Джеймс Ваш террариум. Содержание черепах, ящериц, тритонов, насекомых в до-
машних условиях / Пер. с нем. Е. Мухиной. - Изд-во М.: Аквариум. 2003. - 160 с. [Shmits Dzheims Vash terrarium. Soderzhanie cherepakh, yashcherits, tritonov, nasekomykh v domashnikh usloviyakh / Per. s nem. E. Mukhinoi. - Izd-vo M.: Akvarium. 2003. - 160 s. (In Russ)].
4. Меркулов, Г.А. Курс патологогистологических техник/ Г.А. Меркулов. - Л.: МЕДГИ3, 1961. - 343 с.
[Merkulov, G.A. Kurs patologogistologicheskikh tekhnik/
G.A. Merkulov. - L.: «MEDGI3», 1961. - 343 s. (In Russ)]. 5. Ролдугина, Н.П., Никитченко, В.Е., Яглов, В.В.
Практикум по цитологии, гистологии и эмбриологии /
H.П. Ролдугина, В.Е. Никитченко, В.В Яглов. - М.:Колос, 2001.- 263с. [Roldugina, N.P., Nikitchenko, V.E., Yaglov, V.V. Praktikum po tsitologii, gistologii i ehmbriologii / N.P. Roldugina, V.E. Nikitchenko, V.V Yaglov. - M.:Kolos, 2001.-263s. (In Russ)]._
2021 LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE №4
@
