CC BY
30
DOI: 10.23868/202107005
ИНДУКЦИЯ ХОНДРОГЕНЕЗА IN VIVO ПОД ВЛИЯНИЕМ ГИДРОГЕЛЕВОГО ГЕН-АКТИВИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПЛАЗМИДНОЙ ДНК С ГЕНОМ VEGF
Е.В. Пресняков1, Е.С. Рочев2, В.В. Церцеил1, М.П. Никитина3, По^утт:03.03.2021
Е.О. Кананыхина3, М.О. Мавликеев1, Т.С. Чаузова4, А.П. Петрикина4, _ Принята к печати: 10052021
Опубликована on-line: 02.09.2021
И.И. Еремин4' 5, А.А. Пулин4' 6, А.А. Исаев7, В.С. Комлев8, Т.Х. Фатхутдинов3, Р.В. Деев1 7 9, И.Я. Бозо4 9 10
1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
2 Первый Санкт-Петербургский медицинский университет им. И.П. Павлова. Санкт-Петербург, Россия
3 Научно-исследовательский институт морфологии человека им. А.П. Авцына, Москва, Россия
4 Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия
5 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия
6 Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
7 ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва, Россия
8 Институт металлургии и материаловедения РАН им. А.А. Байкова, Москва, Россия
9 ООО «Гистографт», Москва, Россия
10 Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва, Россия
CHONDROGENESIS INDUCED IN VIVO BY GENE-ACTIVATED HYDROGEL BASED ON HYALURONIC ACID AND PLASMID DNA ENCODING VEGF
E.V. Presnyakov1, E.S. Rochev2, V.V. Tserceil1, M.P. Nikitina3, E.Yu. Kananykhina3, M.O. Mavlikeev1, T.S. Chauzova4, A.P. Petrikina4, I.I. Eremin4, 5, A.A. Pulin5, 6, A.A. Isaev7, V.S. Komlev8, T.Kh. Fatkhutdinov3, R.V. Deev179, I.Y. Bozo4, 9, 10
11.I. Mechnikov North-Western State Medical University, Saint-Petersburg, Russia
2 First I.P. Pavlov Saint Petersburg Medical University, Saint-Petersburg, Russia
3 A.P. Avtsyn Research Institute of Human Morphology, Moscow, Russia
4 Research Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow, Russia
5 National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia
6 N.I. Pirogov National Medical and Surgical Center, Moscow, Russia
7 Institute of Human Stem Cells, PJSC, Moscow, Russia
8 AA. Baikov Institute of Metallurgy and Materials Science, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
9 Histograft, LLC, Moscow, Russia
10 A.I. Burnazyana Federal Medical Biophysical Center, FMBA of Russia, Moscow, Russia
e-mail: bozo.ilYa@gmail.com
Разработка эффективных способов восстановления целостности хрящевой ткани высоко актуальна для хирургической практики. Одним из перспективных направлений в данной области является использование ген-активированных материалов, позволяющих в течение определенного времени изменить продукцию отдельных факторов, вовлеченных в регуляцию репара-тивного хондрогенеза, в зоне повреждения.
В исследовании были разработаны ген-активированные гидрогели на основе гиалуроновой кислоты, содержащие плазмидную ДНК с геном сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF-A). Один из вариантов материала содержал также микрогранулы окта-кальциевого фосфата. Изделия были имплантированы кроликам в дефекты костей черепа, суставного хряща и хряща ушной раковины. Контрольные группы составляли материалы без плазмидной ДНК. Было выяснено, что ген-активированные материалы обеспечивали формирование большего объема хрящевого регенерата с полным восстановлением целостности ушной раковины к 90 сут. Заживление суставного хряща и субхондральной кости происходило также более эффективно на сроках наблюдения 30 и 60 сут., однако к 90 сут. во всех группах наблюдалось ремоделирование вновь образованного хрящевого регенерата в фиброэластическую и волокнистую соединительные ткани. Дефекты крыши черепа замещались костным регенератом на всем протяжении в тестовой группе к 90 сут., тогда как в контроле сохранялся остаточный дефект, выполненный волокнистой соединительной тканью.
Таким образом, разработанные варианты ген-активированных гидрогелей являются перспективными кандидатами в качестве медицинских изделий для лечения пациентов с повреждениями костей и хрящей.
Ключевые слова: хрящевая ткань, ген-активированный гидрогель, гиалуроновая кислота, VEGF, хондрогенез, регенерация.
Development of effective methods for cartilage tissue repair is highly relevant for surgical practice. One of the promising approaches in this area is the use of gene-activated materials that capable to change the production of certain factors involved in reparative chondrogenesis regulation in the damaged area within a certain time.
In this study, we developed two gene-activated hydrogels based on hyaluronic acid delivering plasmid DNA encoding vascular endothelial growth factor (VEGF-A) gene. One of the hydrogels also contained octacalcium phosphate microgranules. The materials were implanted into the defects of cranial bones, articular and auricle cartilages in rabbits. Control groups consisted of the same materials without plasmid DNA. We found that gene-activated materials formed a larger volume of cartilaginous tissue with complete restoration of the auricle by 90 days. Healing of the articular cartilage and subchondral bone was also more efficient at the 30 and 60 days follow-up, but by 90 days, remodeling of the newly formed cartilage into fibroelastic and fibrous connective tissues was observed in all groups. Cranial bone defects were filled with newly formed bone tissue in the test group by day 90, while in the control a residual defect filled by fibrous connective tissue was retained.
Thus, developed variants of the gene-activated hydrogels are promising candidates to be medical devices for treatment of patients with bone and cartilage pathology.
Keywords: cartilage tissue, gene-activated hydrogel, hyaluronic acid, VEGF, chondrogenesis, regeneration.
Введение
Хрящевая ткань характеризуется низким потенциалом к репаративной регенерации [1]. По этой причине гистотипическое восстановление целостности гиалиновой хрящевой ткани сутавного хряща, перегородки носа, трахеи, а также эластической хрящевой ткани ушных раковин в большинстве случаев не происходит — дефекты этих структур заполняются фиброзной хрящевой и волокнистой соединительной тканями, которые не обладают необходимыми биомеханическими свойствами [2, 3]. Наиболее часто повреждение суставных хрящей формируется при дегенеративно-дистрофических заболеваниях суставов и травмах. В ходе воздействия этиологических факторов нарушается структурно-функциональная целостность суставного хряща, субхондральной кости и других элементов аппарата сустава, что предопределяет развитие болевого синдрома, существенное ухудшение качества жизни пациентов, снижение трудоспособности. Так как распространенность патологических состояний и заболеваний, вовлекающих хрящевые структуры, велика, исследования, направленные на разработку новых средств и методов восстановления целостности хрящей многочисленны [4-7].
Адекватное лечение пациентов с дефектами суставных, носовых и ушных хрящей, трахеи является актуальным вопросом арторологии, оториноларингологии, пластической и торакальной хирургии и базируется на фундаментальных данных нормальной и патологической анатомии, гистологии, клеточной и молекулярной биологии. Значительное внимание уделяется разработке и использованию различных методов неохондрогенеза, способных восполнить недостаточность регенеративных потенций, активировать нативный камбиальный резерв, оптимизировать неохондрогенез [7, 8]. В связи с этим, активно проводятся исследования, развивающие представления о процессах репаративной регенерации хрящевой ткани и способах влияния на неё, одними из которых являются методы генной терапии [9-11].
Несмотря на то, что уровень сосудистого эндоте-лиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF) в синовиальной жидкости и количество рецепторов к нему у синовиоцитов коррелирует с выраженностью проявлений остеоартрита [12], гистотипическая регенерация хрящевой ткани требует проникновения в зону повреждения камбиальных клеток, миграция которых осуществляется как параваскулярно, так и с кровотоком [13]. Основываясь на этом, мы предположили, что временная генная индукция экспрессии VEGF-A в зоне восстановления хрящевой ткани после механического повреждения будет стимулировать репа-ративный хондрогенез. Кроме того, ранее мы выявили, что ген-активированный гидрогель на основе гиалуроно-вой кислоты и плазмидной ДНК с геном VEGF не только стимулирует регенерацию поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани, но и в ряде случаев приводит к формированию в зоне заживления дефектов скелетной мышцы у крыс очагов хондрогенеза [14].
В связи с вышеизложенным, целью исследования стала оценка влияния разработанных ген-активированных гидрогелей на основе гиалуроновой кислоты в оптимизации репаративной регенерации эластической и гиалиновой хрящевых тканей.
Материал и методы
Изготовление ген-активированных материалов
Для изготовления ген-активированного материала использовали 1% гиалуронат натрия в виде
медицинского изделия «Ostenil» 20 мг/2 мл (TRB Chemedica AG, Германия) и сверхскрученную голую плазмидную ДНК с геном VEGF (pDNA-VEGFj, являющуюся действующим веществом лекарственного препарата «Неоваскулген» [15], в концентрации 400 мкг на 1 мл гидрогеля.
Для эксперимента по восстановлению целостности суставного хряща в состав гидрогеля непосредственно перед имплантацией in vivo вносили микрогранулы ОКФ в объемном соотношении 1:2. В тестовых группах использовали ген-активированные микрогранулы ОКФ, несущие ту же фармацевтически активную молекулу pDNA-VEGF, — остеопластический материал «Гистографт» (Гистографт, Россия). В контрольной группе применяли микрогранулы ОКФ без плазмидной ДНК, синтезированные согласно ранее опубликованной методике [16].
Для исследования по заживлению дефекта ушной раковины использовали гидрогелевые материалы без микрогранул ОКФ.
Имплантация материалов in vivo
Дизайн эксперимента. Исследование выполнено на кроликах породы Шиншилла (n=24), массой 2,53,0 кг, с соблюдением международных правил гуманного обращения с лабораторными животными.
Каждому животному формировали полнослойные дефекты нагружаемых суставных поверхностей медиальных мыщелков бедренных костей (диаметр 3 мм, глубина 4 мм, до субхондральной кости). Дополнительно, наносили дефекты ушной раковины вблизи основания (в зоне наибольшей толщины хряща ушной раковины) диаметром 1 0 мм с использованием трепана (для предварительной разметки). Дефекты правой стороны заполняли ген-активированными гидрогелями (тестовая сторона), а дефекты левой — соответствующими гидро-гелевыми матриксами без терапевтической плазмидной ДНК (контрольная сторона). Животные были разделены на 3 основные группы в соответствии с вариантом использованного гидрогеля: на основе альгината натрия, гиалуроновой кислоты и коллагена. Животных выводили из эксперимента на сроках 30, 60 и 90 сут., результаты оценивали с использованием гистологических методов.
Протокол операции на коленном суставе. После премедикации (Sol. Atropini Sulfatis — 0,04 мг/кг, Sol. Cephazolini — 25 мг/кг внутримышечно) и седации (Sol. Zoletili 100 — 30 мг/кг внутримышечно), подготовки и асептической обработки операционного поля под инфильтрационным обезболиванием (Sol. Lidocaini 1% — 5 мл) производили линейный вертикальный разрез кожи длиной 30 мм медиально от коленного сустава и на уровне надколенника. Тупым путем рассекали мышцы и фасции с обнажением капсулы сустава. Связку надколенника отводили латерально. Вскрывали капсулу сустава, производили сгибание в суставе и тракцию дистальной части бедренной кости кпереди с обнажением нагружаемых поверхностей мыщелков. С помощью алмазной шаровидной фрезы диаметром 3 мм и ограничителем глубины формировали дефект суставного хряща медиального мыщелка бедренной кости диаметром 3 мм, глубиной 4 мм. Сверление отверстий в кости выполняли при стандартизированных параметрах: 800 об./мин., торк 20 Н/см, постоянная ирригация для предотвращения перегрева хрящевой и костной тканей. Костные дефекты заполняли исследуемыми материалами следующим образом: нижние 2/3 дефекта заполнялись гидрогелевыми материалами
с микрогранулами ОКФ (зона локализации субхондраль-ной кости и нижний отдел суставного хряща), а верхняя треть — аналогичными гидрогелями без микрогранул ОКФ (верхний отдел хряща). В случае материалов на основе альгината натрия, их поверхность после вынесения в дефект смачивалась хлоридом кальция для полимеризации. Операционную рану ушивали послойно узловыми швами Vicryl 5/0 (капсула сустава, мышцы), Surgipro 5/0 (кожа). В дальнейшем животные находились на ежедневном динамическом наблюдении.
Протокол операции на ушной раковине. После подготовки и асептической обработки операционного поля под инфильтрационным обезболиванием (Sol. Lidocaini 1 % — 3 мл) производили линейный вертикальный разрез кожи длиной 8 мм в области основания ушной раковины. Производили экономную отслойку вышележащих мягких тканей без формирования широкого кармана с обнажением поверхности хряща, покрытого надхрящницей. Трепаном с внешним диаметром 1 0 мм осуществляли разметку дефекта, скальпелем и ножницами иссекали фрагмент хряща с надхрящницей диаметром 10 мм на всю толщину ушной раковины. В дефект вносили исследуемый гидрогелевый материал, заполняющий зону дефекта хряща и подкожный карман над ним. Послеоперационную рану ушивали послойной герметично узловыми швами Vicryl 5/0, непрерывным обвивным швом Surgipro 5/0.
Гистологическое исследование
Животных выводили из эксперимента передозировкой препарата «Золетил 100». Отделяли дистальный эпифиз бедренной кости и основания ушных раковин, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, костные фрагменты затем декальцинировали в растворе «Софтидек» (Биовитрум, Россия) при соотношении объема объекта и объема декальцинирующей жидкости 1:50. Смену раствора производили каждые 24 ч., одновременно проверяя степень декальцинации при помощи иглы. После завершения декальцинации образцы промывали водопроводной водой в течение 30 мин. Гистологическая проводка, заливка, и микро-томия при толщине срезов 5 мкм осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали обзорными красителями (гематоксилином и эозином) и по Маллори. В ходе гистоморфометрического анализа определяли долю костного регенерата, вновь образованной хрящевой ткани и нерезорбированных фрагментов имплантированных изделий в общей площади дефектов, а также подсчитывали количество сосудов в 10 произвольных полях зрения на уровне субхондральной кости при стандартном увеличении х400.
Статистический анализ
В ходе статистического анализа определяли среднее значение, медиану, стандартное отклонение, верхний и нижний квартили количественных показателей (доли вновь образованной хрящевой ткани, фрагментов имплантированных материалов, количество сосудов). Затем оценивали соответствие распределения количественных признаков закону нормального распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения групп использовали непараметрические методы (U-критерий Манна-Уитни для межгрупповых сравнений, критерий Вилкоксона — для внутригруппо-вых). Уровень статистической значимости различий (p) был принят за 0,05.
Результаты и обсуждение
Восстановление целостности суставного
хряща и субхондральной кости
Через 30 сут. после имплантации гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты без плазмидной ДНК (контроль) зона дефекта была заполнена преимущественно хрящевым регенератом, построенным из волокнистого хряща, представленным слоями мелких клеток, лежащих в индивидуальных лакунах, и расположенных параллельно поверхности, в то время, как функциональном гиалиновом суставном хряще хондроциты ориентированы перпендикулярно поверхности, а волокна матрикса формируют арочные амортизирующие структуры. В ряде случаев микрогранулы ОКФ непосредственно находились на поверхности регенерата, фактически контактируя с синовиальной жидкостью, вероятно, сместившись к зоне суставного хряща после имплантации. Ткань, которая при этом их окружала, характеризовалась смешанным строением. Без упорядоченности в составе регенерата обнаруживались участки, занятые волокнистым и гиалиновым хрящом, плотной волокнистой соединительной тканью и ретикулофиброзной костной тканью. Наибольший объем принадлежал волокнистой хрящевой ткани. Остатки гидрогеля визуализировались как тонкие оксифильные прослойки между поверхностью некоторых микрогранул ОКФ и вновь образованной костью. В глубине мыщелка именно остеогенез являлся преимущественным процессом (рис. 1).
В случае ген-активированного гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты верхняя зона дефекта была заполнена хрящевым регенератом, имеющим промежуточное строение: он включал участки как явно фиброзного строения, так и гиалиноподобного. Важно отметить, что хондроциты выстраивались в колонки, перпендикулярные вектору механической нагрузки, что соответствует нативной гистоархитектуре гиалинового хряща и не наблюдалось на данном сроке в контрольной группе. Сохранившиеся микрогранулы ОКФ были инкрустированы во вновь образованный хрящ. На границе с подлежащей костью отмечены обширные поля волокнистой соединительной ткани различной степени «зрелости». Ход раневого канала определялся по границе «вновь образованные хрящ -кость», где костная ткань была расположена на периферии, а ее трабекулы росли центростремительно, последовательно занимая место вновь образованного хряща. На этой границе определялись развитые кровеносные сосуды, расположенные в окружении реактивно измененной соединительной ткани межбалочных пространств. Количество сосудов было статистически значимо большим, чем в контроле (р=0,027). Вновь образованная субхондральная кость перестраивалась вокруг сосудов, формируя структуры из концентрически расположенных костных пластинок существенно более высокоминерализованных, чем рядом лежащие участки — формировались первичные остеоны регенерата. Фуксинофильные остатки гидрогеля выявлялись вокруг небольшого числа микрогранул ОКФ. Воспалительная и гигантоклеточная реакции не выявлены (рис. 1).
Через 60 сут. в контрольной группе поврежденная поверхность была покрыта вновь образованной хрящевой тканью, имеющей смешанное строение. Субхондральная кость была восстановлена; были выявлены процессы ремо-делирования образованных костно-хрящевых элементов регенерата с формированием пластинчатой костной ткани. В глубоких зонах выявлялись микрогранулы ОКФ, подвергшиеся частичной биорезорбции, в значительной
30 су 1. 60 сут. 90 су I
Рис. 1. Регенерат в зоне дефекта суставного хряща: ГК — контрольная группа, ГК-р1МЕ6Г — группа с имплантацией ген-активированного гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты и плазмидной ДНК с геном VЕGF:: 1 — микрогранулы ОКФ, 2 — остатки гидрогелевых компонентов исследуемых материалов, 3 — вновь образованная костная ткань, 4 — вновь образованная хрящевая ткань гиалиноподобного и смешанного строения, 5 — плотная волокнистая соединительная ткань. Окраска: ГК 30 сут., ГК-р!МЕОР 30 и 60 сут. — по Маллори; ГК 60 и 90 сут., ГК-р!МЕОР 90 сут. — гематоксилин и эозин. Ув. х100
степени окруженные соединительнотканным рубцом, базофильные вкрапления остатков гидрогеля носили единичный характер. В случае ген-активированного гидрогеля зона бывшего дефекта была заполнена мультитканевым регенератом, имеющим костно-хрящевое строение и содержащая разноразмерные микрогранулы ОКФ (в минимальном количестве на сроке 90 сут.). Структура хряща имела гиалиноподобное строение, однако граница с неповрежденных хрящом все еще четко определялась. В некоторых участках поверхности имелись обширные поля продолжающей рост хрящевой ткани. Она характеризовалась большим объемом матрикса, преимущественно одиночными хондроцитами, в краевых зонах поврежденного хряща имелись хондроцитарные пролифераты, сформированные внутри расширенных хондроцитарных лакун, что характеризует пролиферативную активность поврежденного хряща.
Через 90 сут. в обеих группах целостность суб-хондральной кости была полностью восстановлена, а поверхностно расположенный хрящевой регенерат приобретал фиброзное строение, что, вероятно, связано с несоответствием биомеханических свойств вновь образованных тканей гиалиновой хрящевой ткани, так как остатки гранул ОКФ все еще сохранялись и нередко располагались поверхностно.
Заживление дефекта ушной раковины
Через 30 сут. после операции в контрольной группе края поврежденного хряща характеризовались наличием умеренной зоны некроза; выявлялись единичные хондроцитарные лакуны, содержащие митотически активные клетки. Остатки гидрогеля с примесью эритроцитов находились в полостях, как прилежащих к хрящу, так и находящихся от него на некотором расстоянии.
Выраженного воспалительного процесса не наблюдалось, однако количество богато васкуляризированной грануляционной ткани было существенным. К 60 сут. края дефекта практически не содержали некротизиро-ванных (бесклеточных) участков хрящевой ткани, со всех сторон были окружены плотной волокнистой соединительной тканью, признаки хондрогенеза как на удалении, так и в центральных частях дефекта не определялись. Через 90 сут. центральная зона дефекта так же, как и на предыдущих сроках, была заполнена плотной волокнистой соединительной тканью. В областях краев предсуществовавшего хряща сформировался хрящевой регенерат, занимающий не более 10-15% площади дефекта. Остатки гидрогеля, признаки воспалительной и гигантоклеточной реакций не выявлены (рис. 2).
В экспериментальной группе, через 30 сут. после операции края дефекта хряща характеризовались наличием выраженной зоны хондрогенеза. Вновь образованная хрящевая ткань отличалась базофильным матриксом, отсутствием структурированной надхрящницы и нечеткими границами, мелкими неупорядоченно расположенными хондроцитами, была окружена «хондрогенным» регенератом с оксифильным межклеточным веществом, состоящим из неупорядоченных клеток небольшого размера с овальными ядрами. Ближе к хрящу они приобретали вытянутую форму, базофилию, нередко обособлялись в собственные хон-дроцитарные лакуны. Кровеносные сосуды практически отсутствовали. В некоторых полях зрения общий объем регенерата был разделен мощными пучками коллаге-новых волокон. Участки вновь образованной хрящевой ткани формировались центростремительно, занимая 10-15% от диастаза. В окружающих тканях признаков воспаления не наблюдалось, оставшаяся зона дефекта была заполнена волокнистой соединительной тканью
30 сут. 60 сут. 90 сут.
Рис. 2. Регенерат в зоне дефекта хряща ушной раковины: ГК — контрольная группа, ГК-р1МЕБГ — группа с имплантацией ген-активированного гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты и плазмидной ДНК с геном УЕБР: 1 — предсуществовавший хрящ ушной раковины, 2 — вновь образованная хрящевая ткань. Окр.: гематоксилин и эозин. Ув.: ГК 30 и 60 сут., ГК-р1МЕБГ 90 сут х200; ГК 90 сут., ГК-р!МЕБР 30 сут. х100; ГК-р1МЕБГ 60 сут. х400.
различных степеней плотности и оформленности. В ряде случаев облаковидные зоны хондрогенеза обнаруживались и в центральной части дефекта, т. е. без связи с поврежденным эластическим хрящом. Особый интерес представляют характеристики новообразованной хрящевой ткани, в частности, особенности синтезированного хондробластами и хондроцитами матрикса. Установлено, что регенерат 30-суточного развития представлен в большей степени тканью фиброхряще-вого строения, образованной одиночными клетками, имеющими на светооптическом уровне строение переходное от фибробластов-фиброцитов к хондробластам (рис. 3). Ее матрикс не содержит эластических волокон и, вероятно, состоит преимущественно из коллагенов. При окрашивании орсеином, структура межклеточного вещества регенерата отчетливо контрастирует с краем предсущесовавшего хряща ушной раковины, имеющего типичный эластический каркас. Интересно, что краевые зоны этих участков содержат увеличенные лакуны с гиперплазированными хондробластами — хрящевые пролифераты.
К 60 сут. процесс репаративного хондрогенеза продолжался: общая протяженность краевых регенератов
достигала 20-25% от диаметра дефекта. Структурно сформированные в ходе регенерации зоны хрящевой ткани отличались от предсуществовавшего хряща мелкими одиночными хондроцитами, меньшим удельным объемом матрикса по отношению к совокупному объему хондроцитарных лакун. в области восстанавливающегося хряща в матриксе обнаружено большое число переплетающихся тонких армирющих хондроцитарные лакуны эластических волокон (рис. 4). Волокна упакованы менее плотно чем в дефинитивной эластической хрящевой ткани. Волокна периферических зон выстроены параллельно поверхности хряща. Через 120 суток плотность расположения волокон увеличена, а процесс восстановления целостности хряща ушной раковины под действием ген-активированного материала завершался практически полностью: область дефекта была заполнена тонким слоем вновь образованной хрящевой ткани, отличающейся от предсуществовавшего хряща менее интенсивным окрашиванием и большим количеством межклеточного вещества. Признаков воспаления, гигантоклеточной реакции, а также остаточных количеств геля не было выявлено, как и на предыдущих сроках наблюдения (рис. 2).
Б
*»
»
_..
*
•и;
4
% . ^ * Ъ «Ч л
В
кУН
мК*
: /'х »V
1
ЯЦМЙГ -
-
* « '
: ~ < у-ч \
А,
&
К'
у*. 'е'/;
2 *
41
// -
'/Г
Иг
,/У &
«5
Рис. 3. Край хрящевого регенерата, экспериментальная группа, 30 сут.: 1 — край эластического хряща ушной раковины; 2 — визуализированные эластические волокна; 3 — хрящевой регенерат; 4 — фиброзно-хрящевой регенерат. Окраска: орсеин. Ув.: А, Б х200, В х400
Рис. 4. Край хрящевого регенерата, экспериментальная группа, 60 сут.: 1 — край эластического хряща ушной раковины; 2 — визуализированные эластические волокна новообразованного хряща; 3 — хрящевой регенерат. Окраска: орсеин. Ув.: х200
Заключение
Таким образом, ген-активированный гидрогель на основе гиалуроновой кислоты оказался наиболее эффективным в восстановлении целостности хряща ушной раковины, обеспечивая полное заживление дефекта к сроку 90 сут. В случае замещения повреждения суставного хряща, на сроках 30 и 60 сут. ген-активированный гидрогель также показал стимулирующий эффект, обеспечивая формирование наибольших по площади участков гиалиновой и гиалиноподобной хрящевой тканей. Однако к крайнему сроку наблюдения (90 сут.) в обеих группах наблюдалась отрицательная динамика в отношении строения регенерата, что, наиболее вероятно, обусловлено сохранением в его составе микрогранул ОКФ.
Результаты исследования формируют необходимые основы для дальнейшей разработки
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Armiento A.R., Stoddart M.J., Alini M. et al. Biomaterials for articular cartilage tissue engineering: Learning from biology. Acta Biomater. 2018; 65:1-20.
2. Varela-Eirin M., Loureiro J., Fonseca E. et al. Cartilage regeneration and ageing: Targeting cellular plasticity in osteoarthritis. Ageing Res Rev. 2018; 42:56-71.
3. Van Bellinghen X., Idoux-Gillet Y., Pugliano M. et al. Temporomandibular Joint Regenerative Medicine. Int J Mol Sci. 2018;19(2): 446.
4. Xuan H., Hu H., Geng C. et al. Biofunctionalized chondrogenic shape-memory ternary scaffolds for efficient cell-free cartilage regeneration. Acta Biomater. 2020; 105:97-110.
5. Xu X., Liang Y., Li X. et al. Exosome-mediated delivery of kartogenin for chondrogenesis of synovial fluid-derived mesenchymal stem cells and cartilage regeneration. Biomaterials 2021; 269:120539.
6. Helgeland E., Shanbhag S., Pedersen T.O. et al. Scaffold-based temporomandibular joint tissue regeneration in experimental animal models: a systematic review. Tissue Eng Part B Rev. 2018; 24(4): 300-316.
7. Johnstone B., Stoddart M.J., Im G.I. Multi-Disciplinary Approaches for Cell-Based Cartilage Regeneration. J Orthop Res. 2020; 38(3): 463-472.
8. Li T., Chen S., Pei M. Contribution of neural crest-derived stem cells and nasal chondrocytes to articular cartilage regeneration. Cell Mol Life Sci. 2020; 77(23): 4847-4859.
9. Grol M.W., Lee B.H. Gene therapy for repair and regeneration of bone and cartilage. Curr Opin Pharmacol. 2018; 40:59-66.
ген-активированного гидрогеля на основе гиалуроно-вой кислоты с плазмидной ДНК, несущей VEGF, в качестве медицинского изделия для хондропластики. Для показаний, связанных с травмами суставного хряща, требуется оптимизация состава изделия в отношении количества и диаметра микрогранул ОКФ. При других патогенетических механизмах повреждения хрящевой ткани эффективность разработанного изделия требует дополнительного изучения.
Благодарности
Исследование выполнено за счет средств граната Российского научного фонда по контракту № 18-7510085 от 08.08.2018 года. Авторы выражают благодарность А.М. Емелину за участие в исследовании.
10. Li K.C., Hu Y.C. Cartilage tissue engineering: recent advances and perspectives from gene regulation/therapy. Adv Healthc Mater. 2015; 4(7): 948-68.
11. Bougioukli S., Evans C.H., Alluri R.K. et al. Gene therapy to enhance bone and cartilage repair in orthopaedic surgery. Curr Gene Ther. 2018; 18(3): 154-170.
12. Hamilton J.L., Nagao M., Levine B.R. et al. Targeting VEGF and its receptors for the treatment of osteoarthritis and associated pain. J Bone Miner Res. 2016; 31(5): 911-924.
13. Li Shan E. Fong, Casey K. Chan, Stuart B. Goodman. Stem Cells homing in musculoskeletal injury. Biomaterials 2011; 32(2): 395-409.
14. Деев Р.В., Бозо И.Я., Мавликеев М.О. и др. Регенерационный гистогенез в области дефекта скелетной мышцы при местном введении ген-активированного гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты в эксперименте. Гены и Клетки 2020; XV(2): 66-72. [Deev R.V., Bozo I.Y., Mavlikeev V.O. et al. Regenerative histogenesis in a skeletal muscle defect with local implantation of gene-activated hydrogel based on hyaluronic acid in the experiment. Genes & Cells 2020; 15(2): 66-72
15. Deev R., Bozo I., Isaev A. et al. Results of 5-year follow-up study in patients with peripheral artery disease treated with PL-VEGF165 for intermittent claudication. Ther Adv Cardiovasc Dis. 2018;12(9): 237-246.
16. Komlev V.S., Barinov S.M., Bozo I.I. et al. Bioceramics composed of octacalcium phosphate demonstrate enhanced biological behavior. ACS Appl Mater Interfaces. 2014; 6(19): 16610-20.
