CC BY
25
УДК: 616.71-018.3-003.93-089.843-092.4
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА РЕГЕНЕРАЦИИ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОФИБРОБЛАСТОВ
А.Б. ТИЛЯКОВ, Б.А. МАГРУПОВ, М.Д. УРАЗМЕТОВА, Б.Р. КАРИМОВ, Б.С. УБАЙДУЛЛАЕВ
EXPERIMENTAL STUDY OF CARTILAGINOUS TISSUE REGENERATION PROCESS AFTER ALLOFIBROBLASTS TRANSPLANTING
A.B. TILLYAKOV, B.A. MAGRUPOV, M.D. URAZMETOVA, B.R. KARIMOV, B.S. UBAYDULLAYEV
Республиканский научный центр экстренной медицинской помощи
Работа основана на изучении результатов стимуляции процесса регенерации хрящевой ткани в условиях применения эмбриональных аллофибробластов у 26 половозрелых кроликов, у которых был смоделирован разрыв лонного сочленения с последующим его восстановлением. Результаты изучались на основании микроскопии гистологических срезов лонного сочленения, окрашенных гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону. Изучение процесса формирования новой хрящевой ткани в зоне разрыва лонного сочленения в эксперименте под влиянием аллофибробластов подтвердило стимулирующее влияние аллогенных фибробластов на течение процесса регенерации хрящевой ткани в эксперименте, что создает предпосылки для применения данного метода в клинической практике.
Ключевые слова: эмбриональные аллофибробласты, репаративныйхондрогенез, лонное сочленение.
Study of embryonalallofibroblasts impact on cartilaginous tissue regeneration process in experiment has been carried out. Research is based on the results of cartilaginous tissue regeneration processstimulation in the conditions of applying embryonalallofibroblasts in 26 experimental sexually mature rabbits in which rupture of pubic joint with its further recovery has been modeled. Results have been studied on the base of histologicalslices of pubic joint microscopy colored by hematoxylin-eosin and Van-Gizon at 1, 2, 3 and 4 weeks of experiment. Research of new cartilaginous tissue forming process in the zone of pubic joint rupture under the impact of allofibroblastsproved stimulating effect of allogenic fibroblast on cartilaginous tissue process course in experiment and it creates background for applying this method in clinical practice. Keywords: embryonalallofibroblasts, reparativechondrogenesis, pubic joint.
В последние годы в качестве возможного способа стимуляции процесса репарации предлагаются регенеративные методики с использованием культивированных аллофибробластов [1-3,5,7,10]. Некоторые авторы сообщают об обнадеживающих ранних клинических результатах их применения [2,3,5,6,8,10,15]. Одним из возможных направлений их применения может служить стимуляция репаративного остео- и хондрогенеза [4,7,8,10,15]. Однако необходим серьезный анализ с учетом множества проблем, которые могут возникнуть при имплантации полученной культуры клеток.
Фибробласты - основные клетки соединительной ткани, которые имеют мезенхимальное происхождение и морфологически характеризуются как клетки круглой или удлиненной, веретенообразной плоской формы с отростками и плоским овальным ядром. Фибробласты синтезируют тропоколлаген, предшественник коллагена, межклеточный матрикс и основное вещество соединительной ткани, аморфное желеподобное вещество, заполняющее пространство между клетками и волокнами соединительной ткани, участвуют в заживлении ран. В результате дифференцировки фибробласты превращаются в менее активные зрелые клетки - фиброциты [2,6,8,9].
Количество предложенных методов свидетельствует о необходимости продолжения поиска более совершенных, доступных, экономически менее затратных способов стимуляции репаративного остеогенеза, которые позволили бы сохранить достоинства традиционных методов и максимально сократить их недостатки [9,12-14].
Цель. Изучение влияния эмбриональных аллофибробластов на процессы регенерации хрящевой ткани в эксперименте.
Методика моделирования разрыва лонного сочленения. Работа основана на изучении результатов стимуляции процесса регенерации хрящевой ткани сочленений костей таза в условиях применения эмбриональных аллофибробластов (АФ) у 26 половозрелых самцов кроликов породы шиншилла массой 2,33,5 кг.
С целью приближения эксперимента к тем патологическим состояниям, которые наблюдаются при травмах таза у человека, у всех животных создавали экспериментальную модель разрыва лонного сочленения костей таза. Уход и содержание экспериментальных животных были стандартными и соответствовали требованиям и принципам Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996). Кролики для выполнения эксперимента были закуплены с виварии Ташкентской медицинской академии и содержались в условиях вивария экспериментального отдела РНЦЭМП при 12-часовом периоде освещения, комнатной температуре 20±2°С, влажности 50-70%. Кормление животных осуществлялось согласно установленному рациону с применением комбикорма для лабораторных животных. Животные были разделены на три группы.
Строго в стерильных условиях экспериментальное
животное фиксировали спиной к столу с разведенными конечностями. После внутримышечного введения тиопентала натрия 60 мг/кг, дроперидола 2 мг/кг + фентанила 0,04 мг/кг проводится продольный разрез по проекции лонного сочленения. После рассечения кожи, подкожной клетчатки в ране обнажался симфиз (необходимо отметить, что высота симфиза у кроликов достигает 2,5-3,0 см, а ширина составляет 0,4-0,5 см). С помощью острого прямого распатора производили разрушение лонного сочленения, с помощью прямых хирургических ножниц и зажима Микулича половины таза разводили в стороны, чем достигалась нестабильность переднего полукольца таза. После обработки раны раствором бетадина ее ушивали послойно (рис. 1).
В 1-й контрольной группе (8 животных) после разрушения лонного сочленения таза реконструктивно-вос-становительные операции не выполнялись. Во 2-й группе (8 животных) после разрушения лонного сочленения таза выполняли восстановление симфиза при помощи серкляжа из танталовой проволоки, диаметром 1,2 мм. В 3-й группе (8 животных) также после разрушения лонного сочленения таза выполнялось восстановление симфиза с помощью серкляжа из танталовой проволоки диаметром 1,2 мм, далее в зону повреждения симфиза 5 мл шприцем без иглы вводили раствор с выращенными эмбриональными аллофибробластами в количестве 3,0 мл (рис. 3, 4).
Рис. 1. Этапы операции на кролике.
Рис. 2. Забор эмбрионов для приготовления культуры клеток.
Животных забивали декапитацией на 7-е, 1-е, 2-е и 30-е сутки по 2 особи на каждый забой. До забоя проводили рентгенологическое исследование. После де-капитации экспериментальных животных производили забор исследуемой части таза. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина (рН 7,2-7,4).
В нашем эксперименте было три группы животных. В каждой по 8 кроликов и 2 беременные крольчихи, у которых на 3-й неделе беременности забирали эмбрионы для приготовления аллофибробластов. Эмбриональные аллофибробласты готовили по методу проф. М.Д. Уразметовой [11]. Забой животных производили путем введения тиопентала натрия (90 мг/кг) с последующим обескровливанием путем декапитации (рис. 2).
Далее для забора материала проводили разрез по послеоперационному рубцу в области симфиза, широко обнажая в обе стороны лонные и седалищные кости. При помощи хирургических ножниц осуществляли иссечение и забор костно-хрящевого блока.
Методы морфологического исследования. Гистологические срезы, полученные на санном микротоме после депарафинизации, окрашивали гематоксилином и эозином, коллагеновые волокна выявляли окраской пикрофуксином по Ван-Гизону (морфологические исследования выполнены на кафедре патологии).
Микроскопические изменения репаративной регенерации при разрыве хряща сочленений костей таза. Нами проанализированы результаты сравнительного
Рис. 3, 4. Восстановление лонного сочленения серкляжем с последующим введением культуры аллофибробластов.
морфологического исследования процесса регенерации хрящевой ткани, сочленений костей таза кроликов традиционным способом и с применением эмбриональных аллофибробластов.
В 1-й серии экспериментов создана экспериментальная модель разрыва лонного сочленения костей таза в качестве контроля и был изучен процесс регенерации хрящевой ткани в динамике в течение четырех недель.
Результаты морфологического исследования в динамике после создания разрыва хрящевой части лонного сочленения костей таза показали, что через 1 неделю в
Рис. 5. Первая неделя эксперимента. Отек и разрыхление хрящевой ткани в зоне разрыва. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 20.
Рис. 7. Вторая неделя. Некроз и некробиоз хрящевой ткани на границе разрыва. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 20.
зоне (рис. 5, 6) определялись остатки кровяного сгустка, а в окружающей хрящевой ткани - дезорганизация, дистрофические и деструктивные изменения с воспалительной реакцией. Начиная со второй недели отмечается репаративно-регенеративный процесс с последующей перестройкой как самой хрящевой, так и окружающих мягкотканных структур, который сопровождается появлением пролиферативного инфильтрата в интерстиции и вокруг сосудов с образованием разновеликих дольчатых хондроматозных узелков и фиброматоза окружающих мышечной, соединительной и костной тканей (рис. 7-13).
Рис. 6. Коллагеновые волокна в хряще и вакуолизация хондро-цитов. Тот же срез, окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок. 10, об. 20.
Рис. 8. Тот же срез. Плохое выявление волокнистых структур в составе хрящевой ткани. Окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок. 10, об. 20.
Рис. 9. Третья неделя. Развитие дезорганизационных и регенераторных изменений в составе хрящевой ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 20.
Рис. 11. Тот же срез. Хаотичное расположение волокнистых структур в составе хряща и плотные прослойки в составе фи-броматозной ткани. Окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок.10, об. 40.
Рис. 13. Четвертая неделя. Увеличение количества коллаге-новых структур в составе фиброматоза. Окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок. 10, об. 40.
Морфологическая характеристика процесса регенерации хрящевой ткани после восстановления симфиза серкляжной проволокой. Во 2-й серии экспериментов после разрушения лонного сочленения таза выполняли восстановление симфиза с помощью серкляжа из танталовой проволоки диаметром 1,2 мм. Результаты морфологического исследования показали, что в 1-ю и 2-ю неделю эксперимента (рис. 14-16) в зоне разрыва формировались соединительнотканные и сосудистые элементы с последующим образованием хрящевой ткани. Развитие как в хрящевой ткани, так и в окружающей соединительной ткани активных регенераторных процес-
Рис. 10. Четвертая неделя. Репаративная регенерация, фи-броматоз и ангиоматоз хрящевой ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 20.
Рис. 12. Четвертая неделя. Пролиферативное воспаление и фиброматоз окружающих мягкотканных структур. Окраска: гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 20.
Рис. 14. Первая неделя. Локальный интрацеллюлярный отек хрящевой ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
сов в виде пролиферации юных клеточных элементов фиброцитарного и хондроцитарного происхождения, а также утолщения межклеточного основного вещества свидетельствует о формировании смешанной первичной мозоли, состоящей из соединительнотканных и хрящевых тканевых элементов (рис. 17-20).
Морфологическая характеристика процесса регенерации хрящевой ткани после подсадки аллофибробластов. В 3-й серии экспериментов в дефект разрыва хрящевой части лонного сочленения костей таза наложена масса стволовых фибробластов, и изучен процесс регенерации хрящевой ткани. Результаты морфологического
Рис. 15. Первая неделя. Гиперемия сосудов в окружающей соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 17. Третья неделя. Сращение дефекта между культями хрящевой ткани с формированием в нем сосудов и соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 19. Четвертая неделя. В зоне разрыва формирование сосудов и соединительной ткани. Окраска по Ван-Гизону. Ув: ок. 10, об. 20.
исследования в течение четырех недель показали, что через неделю после операции выявлялась рыхлая соединительная ткань (рис. 21).
Со второй недели опыта отмечается трансформация аллофибробластов в фибробласты и хондробласты с формированием новообразованных тяжей фибро- и хондроматозной ткани. В последующем отмечается формирование дольчатых структур из новообразованной хондроматозной ткани и к четвертой недели образовываются два слоя хрящевой ткани (рис. 24-26). Причем в зоне дефекта определяется образование новой хондроматозной ткани, более интенсивно окрашенной гематоксилином в базофильный цвет и в окружности сливающейся со старой хрящевой тканью, которая также несколько активизирована в виде гипертрофии и
Рис. 16. Вторая неделя. Сужение дефекта между культями хрящевой ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
• • ' Л' , ^
Зйи
Z - . - vît'
> .. t • .
Рис. 18. Тот же срез. Уменьшение волокнистых структур в хрящевой ткани. Окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 20. Четвертая неделя. Регенераторная активность в окружности хрящевой ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок.10, об. 40.
Рис. 21. Подсадка аллофибробластов, первая неделя эксперимента. Гипертрофия и гиперхромазия фибробластов и остеобластов эндооста. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
гиперплазии клеток. Необходимо отметить тот факт, что в динамике эксперимента со стороны эндооста окружающей костной ткани отмечается пролиферация, гипертрофия и гиперхромазия фибробластов и остеобластов
Рис. 22. Подсадка аллофибробластов, вторая неделя эксперимента. Формирование первичной грануляционно-тканной мозоли из аллофибробластов и местных тканевых элементов. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 24. Та же неделя. Выявление волокнистых структур в составе первичной грануляционно-тканной мозоли. Окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 26. Третья неделя опыта. Обзорный вид образования островков фибро- и хондроматоза. Окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок. 10, об. 20.
с утолщением костных балок. Со стороны окружающих мягкотканных структур также отмечалась регенерация фиброматозной ткани с последующей трансформацией в хрящевую ткань (рис. 27-33).
Рис. 23. Та же неделя. Формирование очагов хондробластиче-ских островков. Окраска гематоксилином и эозином. Ув: ок. 10, об.40..
Рис. 25. Третья неделя эксперимента. Увеличение количества волокнистых структур в составе первичной соединительнотканной мозоли. Окраска по Ван-Гизону.Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 27. Тот же срез. Новообразованная хрящевая ткань с большим количеством волокнистых структур. Окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок. 10, об. 40.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, изучение процесса формирования хрящевой ткани в зоне разрыва лонного сочленения в эксперименте под влиянием аллофибробластов показало, что по сравнению с изменениями, имевшими место в контрольных группах, образование хрящевой ткани происходит раньше с активным участием пересажен-
ных фибробластов, о чем свидетельствует образование хрящевой и частично костной ткани на 21-30-й день эксперимента. Следовательно, аллогенные фибробласты оказывают стимулирующее действие на течение регенерации хрящевой ткани в эксперименте, что создает предпосылки для применения данного метода в клинической практике.
Рис. 28. Та же неделя. Пролиферация фибробластов со стороны окружающих мягкотканных структур. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 30. Четвертая неделя эксперимента. Новообразованная хрящевая. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 32. Новообразованная хрящевая ткань, окруженная соединительнотканными прослойками. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 40.
ВЫВОДЫ
1. Заживление хрящевого дефекта в условиях стимуляции с подсадкой аллогенных фибробластов хрящевой ткани образуется в той же последовательности, что и в контроле.
2. Под влиянием аллофибробластов процесс регенерации начинается раньше и проекает более активно, завершаясь к 21-28-му дню формированием хрящевой ткани.
3. Аллогенные фибробласты могут использоваться в качестве стимуляторов хондрогенеза.
Рис. 29. Пролиферация фибробластов и увеличение волокнистых структур в составе фиброматозной и хондроматоз-ной ткани на третьей неделе эксперимента. Окраска по Ван-Гизону. Ув.: ок. 10, об. 40.
Рис. 31. Четвертая неделя эксперимента. Утолщение хрящевой ткани со стороны окружающей фиброматозной ткани за
счет хондроматозной трансформации местной фиброзной
ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.: ок. 10, об. 20.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арсеньев И.Г., Берченко, Д.С., Уразгильдеев Г.Н. Ак-
туальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. СПб 2007; 379-381.
2. Бобров Л.И. Фибробласты и их значение в тканевых реакциях. Арх пат 1990; 12: 65-68.
3. Гололобов В.Г. Регенерация костной ткани при заживлении огнестрельных переломов. СПб Петербург XXI век 1997; 160.
4. Грачев И.Р. Комплексная оптимизация остеорепа-рации при лечении переломов длинных костей конечностей. Автореф. дис.... канд. мед. наук. СПб 1992; 16.
5. Еремеев А.В., Светлаков А.В., Большаков ИЛ. и др. Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген-хитозановой матрице. Клеточная трансплантол и тканевая инженерия 2009; 4: 55-62.
6. Кассин В.Ю., Абоянц Р.К., Миронова Л.Л. и др. Экспериментальное изучение реакции соединительной ткани на имплантацию гидрогелей с инкорпорированными фибробластами. Биотехнология 2004; 6: 71-75.
7. Озерская О.С., Щеголев В.В. Экспериментальные подходы к обоснованию применения клеточных композиций на основе фибробластов в дермато-косметологии. Клеточная трансплантол и тканевая инженерия 2008; 2: 66-67.
8. Расулов М.Ф. Использование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и эмбриональных фибробластов в лечении ожоговых ран. Тихоокеанский мед журн 2004; 1: 7-9.
9. Федоров B.H.. Влияние антиоксидантов на репа-ративную регенерацию костной ткани (экспериментальное исследование). Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М 1991; 18.
10. Швед Ю.Л., Кухарева Л.В., Зорин И.М. и др. Разработка полимерной подложки для культивирования фибробластов кожи человека. Цитология 2006; 48: 161-168.
11. Уразметова М.Д. Способ лечения ожогов и ран. № патента 4995. Эмбриональные фибробласты человека, полученные по методике проф. М.Д. Уразметовой (1997).
12. Lin C, Sun J.S., Hou S.M. External fixation with or without supplementary intramedullary Kirschner wires in the treatment of distal radial fractures. Canad J Surg 2004; 47 (6): 431-317.
13. Mangano C., Bartolucci E.G., Mazzocco C. A new porous hydroxyapatite for promotion of bone regeneration in maxillary sinus augmentation: clinical and histologic study in humans. Int J Oral Maxillofac Implants 2003; 18: 23-30.
14. Qu S.X., Guo X., Weng J. et al. Evaluation of the expression of collagen type I in porous calcium phosphate ceramics implanted in an extra-osseous site. Biomaterials 2004; 25: 659-667.
15. Sonobe M., Hattori K., Tomita N. et al. Stimulatory effects of statins on bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Study of a new therapeutic agent for fracture. Biomed Mater Engl 2005; 15 (4): 261-181.
АЛЛОФИБРОБЛАСТЛАР ТРАНСПЛАНТАЦИЯСИДАН КЕЙИН ТС^АЙ ТУКИМАСИНИНГ РЕГЕНЕРАЦИЯСИ КЕЧИШИНИ ТАЖРИБАДА УРГАНИШ А.Б. Тиляков, Б.А. Магрупов, М.Д. Уразметова, Б.Р. Каримов, Б.С. Убайдуллаев Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази
Аллофибробластлар трансплантациясидан кейин тогай тукимасининг регенерацияси кечишини тажриба-да урганиш. Олиб борилган иш тогай тукимасининг регенерацияси кечишини эмбрионал аллофибробластлар кулланилган шароитда жадаллашуви натижаларини тажрибада урганишга асосланган. Тажриба учун 26 та жин-сий етилган куён олинди, ков синдезмози ажралиши шакллантирилди ва кейинчалик тажрибада тикланди.
Натижалар тажрибанинг 1,2,3, ва 4 х,афтасида ков синдезмози гематоксилин-эозин ва Ван-Гизон буйича буялган гистологик кесимлари микроскопда куришга асосланган. Аллофибробластларнинг ков синдезмози-нинг ажралиши жойида тогай тукимасининг шаклланишига таъсири буйича тажриба аллоген фибробластлар-нинг тогай тукимасининг регенерацияси кечишини жадаллаштириши тасдиклади. Бу тажрибада урганилган усулни клиника амалиётида кулланиши мумкинлигини курсатади.
Контакт: Тиляков Акбар Буриевич, ученый секретарь РНЦЭМП. 100115, Ташкент, ул. Кичик халка йули, 2. Тел.: +998-90-167-92-94. E-mail: uzmedicine@mail.ru
