CC BY
13
УДК 619:616.93:579.673.21:636
Ткаченко О.А., професор, д. вет. н., © Бшан М.В., старший викладач, к. вет. н., Ковальова Л.О., лжар ветеринарно! медицини, здобувач, Зажарський В.В., доцент, к. вет. н.
Днтропетровський державный аграрный утверситет
Л1П1ДНИЙ СКЛАД M. BOVIS ТРИВАЛОПАСАЖОВАНОГО ШВИДКОРОСЛОГО ШТАМУ
Наведено дат результат1в вивчення лШдного складу M. bovis швидкорослого штаму тсля багаторазового пасажування через яечне живильне середовище з рН 6,5. Встановлено, що змти р1вня вмкту лтдгв обумовлен тривалктю пасажування i призвели до суттевого зниження в1рулентност1 мтобактерш.
Ключовi слова: мтобактерИ, пасажування, лтдний склад.
Фенотиповi змши мжобактерш, зумовлеш адаптивними процесами фiзiологiчних властивостей, визначаються хiмiчною будовою, зокрема лшщами. Кшьюсний та якiсний склад останшх пiд впливом рiзних чинниюв, за повiдомленнями ряду дослiдникiв [1-9], суттево змiнюeться, визначаючи ступiнь адаптаци до виживання в навколишньому середовищ^ а звiдси й антигеннi, сенсибiлiзуючi та вiрулентнi властивостi, тобто бюлопчну активнiсть мiкобактерiй того чи шшого штаму.
Метою роботи було вивчення лшщного складу штаму M. bovis, пасажованого 130 та 150 разiв через штучне живильне середовище з рН 6,5.
Матерiал та методи. Роботу виконували в навчально-дослiднiй лабораторп кафедри ешзоотологи та iнфекцiйних хвороб Дшпропетровського державного аграрного унiверситету та в НД1 бюлогп Днiпропетровського нащонального унiверситету.
Дослiджували бiомасу M. bovis тсля багаторазового пасажування через яечне живильне середовище. Для цього використовували культуру, яку пасажували два, 130 та 150 разiв i накопичували на яечному живильному середовищi для культивування мiкобактерiй з рН 6,5. Культивування проводили протягом 30 дшв за 37°С. За станом посiвiв спостерiгали щоденно, вiдмiчаючи початок росту, його штенсившсть, культуральнi ознаки.
Видшення загальних лiпiдiв проводили за методикою Фолча в модифжаци Блайя-Дайера, а !х фракцiйний склад вивчали методом тонкошарово! хроматографа на силiкагелевих пластинах Silufol (Чехiя), з послiдуючим кшькюним денситометруванням [10].
Визначення компонентного складу фракцш вiльних жирних кислот проводили методом газорщинно! хроматографа на газовому хроматографi Chrom-5 (Чехiя), пiсля попереднього метилювання [10]. Якiсний аналiз
© Ткаченко О. А., Бшан М.В., Ковальова Л.О., Зажарський В.В., 2008
364
метилових ефiрiв жирних кислот проводили шляхом nopiBMHra з часом утримання стандарт, а кшькюний - розрахуванням площi шюв та визначенням !х вiдсотка вiд загально! площi niKiB, яку приймали за 100 %. Обчислення та статистичну обробку результатiв дослiджень здiйснювали за допомогою персонального комп'ютера в електронних таблицях Excel програмного пакету Office XP Professional.
Вiрулентнi властивостi у вихщного та пасажованих мiкобактерiй дослщжували на морських свинках за традицшною у ветеринарнiй медицинi методикою [11].
Результати дослщжень. Результати дослiджень загальних лiпiдiв мiкобактерiй засвiдчили !х тенденцш до зниження в динамiцi пасажiв. Як видно з таблицi 1, у мшобактерш другого пасажу вмют загальних лiпiдiв виявився вiрогiдно вищим, нiж у таких, пасажованих 130 та 150 разiв, що в 2,0 та 2,2 раза вщповщно нижче вихщного рiвня.
1. Вмкт загальних лiпiдiв у M. bovis, (% на наважку)
Показник Пасаж
2-й 130-й 150-й
Вм1ст загальних лшщв 8,05±0,20 3,90±0,55** 3,66±0,42***
** Р<0,01; *** Р<0,001.
Розподiл загальних лшвдв на фракци у M. bovis пасажованих 130 та 150 разiв виявив динамiчнi змiни (табл. 2), при чому це стосуеться уах дослiджениx шести фракцiй. Динамiка зрушень виявилася неоднозначною: вмiст одних фракцш пiдвищувався, iншиx - знижувався. Так, рiвень фосфолiпiдiв, триацилглiцеролiв, ефiрiв стеришв вiрогiдно знизився, у порiвняннi з вихщними даними, у 1,2 раза, а вшьних жирних кислот, дiацилглiцеролiв, стеринiв вiрогiдно пiдвищився, у 1,1-1,3 раза.
Фракцш загальних лшщв Пасаж
2-й 130-й 150-й
Фосфолшвди 27,97±0,26 20,72±0,85** 23,41±0,45***
Ддацилглщероли 12,54±0,27 20,36±0,86*** 16,71±0,43**
Стерини 12,23±0,20 18,93±0,74*** 16,00±0,70**
Вшьш жирш кислоти 14,47±0,23 16,07±0,36* 16,00±0,14**
Триацилглщероли 18,32±0,16 12,50±0,49*** 15,61±0,32**
Еф1ри стеришв 14,47±0,24 11,42±0,80* 12,27±0,50*
X лшщв 100 100 100
Р<0,05; ** Р<0,01;
Р<0,001.
н=
В цiлому, фракцiя вшьних жирних кислот в динамщ пасажiв M. bovis мала тенденцiю до вiрогiдного пiдвищення !х рiвня, також суттево змшився ii якiсний та кшькюний склад (табл. 3). Так, якщо у M. bovis вихщного варiанту видiляли 19 вiльниx жирних кислот, то на 130-му пасажi !х кiлькiсть зменшилася практично до 14, а на 150-му - до десяти.
365
3. Вмкт вшьних жирних кислот у М. Ъоу18, % вщ суми
Вшьна жирна кислота Код Пасаж
2-й 130-й 150-й
Лауринова С12:0 0,04±0,02 0,10±0,06 слiди
Тридеканова С13:0 0,10±0,02 0,15±0,08 -
Миристинова С14:0 0,27±0,04 0,51±0,30 слiди
Пентадеканова С 15:0 0,22±0,02 0,33±0,23 слщи
Пальм^олешова С16:1 0,55±0,07 1,63±0,21* 0,08±0,05**
Пальмiтинова С16:0 19,62±0,53 26,43±1,01** 28,97±0,91***
Маргаринова С17:0 0,81±0,07 3,05±0,4** 0,91±0,07
Оле!нова С18:1 23,87±0,60 44,72±1,55*** 27,16±0,55*
Стеаринова С18:0 7,42±0,11 10,57±0,64** 13,58±0,52***
Лшолева + лiноленова С18:+ С18:3 2,97±0,16 3,86±0,02** 8,96±0,57*
Нонадеканова С19:0 3,34±0,06 1,22±0,07*** 1,13±0,36**
Арахiнова С20:0 5,23±0,14 слiди слiди
Генейкозанова С21:0 6,74±0,23 2,14±0,03*** 3,39±0,38**
Бегенова С22:0 5,78±0,18 3,17±0,01*** 10,17±0,54**
Трикозанова С23:0 5,89±0,35 - слiди
Тетракозанова С24:0 5,57±0,19 - слiди
Пентакозанова С25:0 7,43±0,26 2,12±0,02*** 5,65±0,65
Гексакозанова С26:0 2,53±0,30 - -
Гептакозанова С27:0 1,62±0,19 - -
X ненасичених 27,39±0,44 50,21±1,80*** 36,20±0,70***
X насичених 72,61±0,50 49,79±1,70*** 63,80±0,75***
X коротколанцюгових 64,44±0,61 92,57±0,53 80,79±0,50
X довголанцюгових 35,56±0,47 7,43±0,40 19,21±0,32
* Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001. Примаки:
1. СА:0 - насичена жирна кислота (А - кшькють атомiв вуглецю);
2. СА:Н - ненасичена жирна кислота (Н - кшькють подвшних зв'язкiв);
3. Слiди - наявшсть кислоти менше 0,01 %.
Слщ вiдзначити, що на 150-му пасажi повнiстю зникли зi складу кл^инно! оболонки такi кислоти як тридиканова, гексакозанова та гептокозанова. Останш двi кислоти не виявлялися вже на 130-му пасаж1 Проте кшькюний склад окремих вiльних жирних кислот мав тенденцш до пiдвищення або зниження. При цьому, динамiка останшх суттево переважала. На загальному фош зниження кiлькiсть кислот таких як пальм^инова, оле!нова та стеаринова суттево тдвищилися на 130-му та 150-му пасажах в порiвняннi з вихщним (другим), у 1,4 - 1,6 раза.
366
Одеpжaнi даш свщчать, що пaсaжi M. bovis чеpез яечне живильне сеpедовище з pH б,5 суттево впливають на ïx кiлькiсний та якiсний склад, що може ^изводити до змiни бюлопчнох' aктивностi мiкpооpгaнiзмa.
Адaптивнi фiзiологiчнi ^оцеси мiкpобноï клiтини зумовлюють змiни стввщношення суми нaсичениx та ненaсичениx жиpниx кислот (табл. 3). Бaгaточисельнi пaсaжi суттево вплинули на збiльшення вмюту ненaсичениx кислот та зменшення - насиченж. Якщо пеpшиx на початку дослщжень виявлено 27,39 %, то на 130-150-му пaсaжax - 43,2 %, що в 1,б pasa бшьше, нiж у мiкобaктеpiй виxiдного вapiaнтy.
Пiдвищення вмiстy ненaсичениx жиpниx кислот може свiдчити пpо посилення aдaптивниx фiзiологiчниx пpоцесiв мiкpобноï кл^ини в неспpиятливиx yмовax, зокpемa - постiйниx тpивaлиx пеpесiвiв. Хоча, слщ вiдмiтити, це досить умовне заключення, оскiльки вивчення xapaктеpy та стpокiв фоpмyвaння колонiй на сеpедовищax з piзним значенням pH свiдчить ^о досить оптимaльнi умови сеpедовищa з pH б,5 для pозмноження мiкобaктеpiй. Це, напевно, обмежено певною потенцшною здaтнiстю, бо зi 120-го пеpесiвy мiкобaктеpiï втpaтили виxiднy властивють - швидкiсть pозмноження.
3i збшьшенням кiлькостi пеpесiвiв мiкобaктеpiй суттево знижуеться вмiст довголaнцюговиx (С21:0+ С27:0) i тдвищуеться вмiст коpотколaнцюговиx (С12:0+ С20:0) жиpниx кислот. Так, якщо спiввiдношення циx кислот у виxiдномy штаму мiкобaктеpiй становило 1:1,8, то у пaсaжовaниx 130 та 150 paзiв 1:б,5. Така тенденцiя до збшьшення кiлькостi коpотколaнцюговиx жиpниx кислот вiдмiчaлaсь i на 40-му та 80-му пaсaжax дослiджyвaного швидкоpослого штаму M. bovis [12].
Без сумшву, зниження вмшту довголaнцюговиx жиpниx кислот на фош пiдвищення вмiстy коpотколaнцюговиx не тшьки свiдчить пpо пеpебyдовчi адаптивш фiзiологiчнi пpоцеси в мiкpобнiй кл^иш, але й пpо зниження ступеня вipyлентностi дослiджyвaниx мiкобaктеpiй. Так, ^и зapaженнi моpськиx свинок мiкобaктеpiями виxiдного та пасажованого 150 paзiв пaсaжiв встановлено, що пеpшi загинули ввд генеpaлiзовaноï фоpми тyбеpкyльозy на 35-45 день тсля зapaження, а дpyгi - пpотягом чотиpьоx мiсяцiв залишалися живими.
Отже, в пpоцесi пасажування швидкоpослого штаму M. bovis на яечному живильному сеpедовищi з pH б,5 було виявлено змiни як у загальному, так i у фpaкцiйномy склaдi лiпiдiв та вiльниx жиpниx кислот.
Вiдмiченi та aнaлiзовaнi показники лiпiдного складу в динамщ бaгaточисельниx пеpесiвiв взaемопов'язaнi i с^ямоваш на пpистосyвaння до тиx чи шшж умов, тобто на виживання в бюлопчному свiтi мiкобaктеpiй як виду.
Висновки. 1. Збшьшення кшькост пaсaжiв пpизвело до вipогiдного зниження вмюту зaгaльниx лiпiдiв, фpaкцiй фосфолiпiдiв, тpиaцилглiцеpолiв та ефipiв стеpинiв, але збшьшення кшькост дiaцилглiцеpолiв, стеpинiв та вшьнж жиpниx кислот.
3б7
2. Тенденщя до зниження ненасичених та довголанцюгових жирних кислот на фош збшьшення насичених i коротколанцюгових жирних кислот вказуе напевно на адаптивш фiзiологiчнi процеси мiкобактерiй щодо тривалого пасажування через живильне середовище та втрату вiрулентностi.
Л1тература
1. Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулёза и атипичные микобактерии. - Будапешт: Изд-во АН Венгрии, 1975. - 336 с.
2. Гизатулина Н.М. Липидные и углеводные компоненты микобактерий и методы их определения // Проблемы туберкулёза. - 1996. - № 4. - С. 59-62.
3. Жирнокислотн профш бактерш, патогенних для людини та тварин / З.П. Васюренко, А.Ф. Фролов, В.В. Смирнов, Н.М. Рубан - К.: Наукова думка, 1992. - 264 с.
4. Зависимость роста и окисляющая способность Mycobacterium lacticolum от содержания фосфора в среде / Е.С. Милько, Н.С. Егоров, С.В. Быковская, Т.Г. Корженевская // Микробиология. - 1974. - Т. XLIII. - Вып. 6. - С. 1022-1027.
5. Кислотоустойчивые микроорганизмы - микобактерии, нокардии, родококки: химический состав, биологические свойства, антигенная структура / Р.А. Нуратинов, К.Р. Ургуев, М.О. Баратов, И.В. Эфендиева // Проблемы туберкулёза. - 2001. - № 5. - С. 54-58.
6. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. - М.: Изд-во МГУ, 1984. - 160 с.
7. Петровская В.Г. Проблема вирулентности бактерий (Химические, метаболические, экологические и генетические аспекты). - Л.: Изд-во „Медицина", 1967. - 264 с.
8. Пинчук Л.М., Воронова Е.А. Изучение бактериальных жирных кислот в таксономических целях // Биохимия и биофизика микроорганизмов: Сб. науч. тр. - Горький, 1982. - С. 36-41.
9. Рубан Е.Р. Микробные липиды и липазы. - М.: Наука, 1977. - 218 с.
10. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. - М.: "Мир", 1975. - 322 с.
11. Настанова по дiагностицi туберкульозу / В.М. Манченко, З.Р. Троценко, М.С. Павленко та ш. - Кшв, 1994. - 39 с.
12. Бiохiмiчний склад швидкорослого штаму М. bovis в залежносп вщ тривалост пасажування / Бусол В.О., Зеленська М.В., Ковальова Л.О., Кравцова Л.В., Ткаченко О. А. // Ветеринарна медицина Украши. - 2006. - № 2. - С. 20-22.
Summary
Tkachenko A., Bilan M., Covaleva L., Zazharsky V.
LIPIDS COMPOSITION OF QUICKLY GROWING STRAIN М.
BOVIS AFTER DURATION PASSAGING
This article provides the results of studing the lipids composition of quickly growing strain M. bovis after duration passaging on nutrien medium with pH 6,5. It is established, that change of level content of lipids is caused by duration passaging and has brought about reduction virulence of mycobacteria.
Стаття надшшла до редакцИ 1.04.2008
368
