CC BY
51
В!сник Дшпропетровського унiверситету. Бюлопя, еколопя. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology.
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2016. 24(2), 338-346.
ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online
doi:10.15421/011644
www.ecology.dp.ua
УДК 616.98:579.873.21+614.48
in ### ## T • 1
Ьюлопчн1 властивост1 дисоц1ативних L- та 1нших форм
Mycobacterium bovis
О.А. Ткаченко1, П.О. Давиденко1, В.В. Зажарський1, В.В. Бригадиренко2
Днтропетровсъкий державний аграрно-eKOHOMiHHUü ^верситет, Дшпропетровсък, Украгна 2Днтропетровсъкий нацюналъний ушверситет iMeHi Олеся Гончара, Днтропетровськ, Украта
Селекцшовано расу змшених форм мжобактерш з особливими властивостями, що можуть виявитися перспективными для конструювання протитуберкульозно! вакцини. Встановлено, що персистенцш дослщжуваних мжрооргатзмгв (27-ма субкультура некислотостшких паличок i L-форм) в оргатзт морських свинок тривае дев'ять (пер1од досл1ду) i бшьше мюящв. Проте i3 суспен-зи, приготовлено! i3 макроскопiчно незмшених оргайв дослдних тварин, видшено кислотостiйкi елементарнi тшьця (зерна) та типовi морфологiчнi форми палички, якi на щiльному живильному середовищi утворили на третю добу помаранчеву культуру. Iнокуляцiя видiлених кислотостшких мжобактерш (культура-ревертант) морським свинкам (1 мг/см3) не супроводжувалася розви-тком алергiчного стану (алергiчна реакцiя на ППД-туберкулш (протеш пурифайд дериват - сухий очищений бiлок) для ссавцш та ААМ (алерген з атипових мжобактерш) через 30, 60 i 90 негативна), проте з органв евтатзованих через три мюящ дослiдних тварин видiлено кислотост1йк1 мжобактери, якi на третю добу утворювали культуру помаранчевого кольору. Багаторазовi пасажi через штучне живильне середовище (щшьне), тривале перебування (20 мгсяп1в) за низько! плюсово! температури змшили генетич-ний баланс, що забезпечило виживання бактерш внаслiдок втрати одних (характерних для патогенного мiкроорганiзму) та набуття 1нших (зокрема атипових) властивостей, частково притаманних шшим мжобактер1ям. У той же час персистенщя в органiзмi морських свинок типових морфолопчних кислотостшких форм (палички), як1 реверсували з L-форм, не супроводжуеться розвитком захворювання. Вони зберггають здатнiсть утворювати шгменти та утворюють колони (культура-ревертант) на щшьному живильному середовищi починаючи з першо! генераци (з бюлопчного матерiалу морських свинок) на другу добу культивування. Втрата сенсибшзувально! здатностi у мжобактерш, багаторазово пасажованих i персистуючих в органiзмi морських свинок, може свщчи-ти (звичайно, тшьки певною мiрою) про втрату !муногенно! здатносп, оскiльки вщомо, що розвиток алерпчно! (туберкулшово!) реакци та И штенсивтстъ свiдчать про !мунолопчну перебудову макроорганiзму (розвиток шфекцшного процесу) з набуттям спе-циф!чно! стшкост! Виявлено залишкову вiрулентнiстъ дослщжуваних змшених форм Mycobacterium bovis !з можливим форму-ванням специф!чного протитуберкульозного шуштету без розвитку необидного ргвня, який виявлявся дiагностикумом алерпчно-го стану, та утворення виразки на дшянщ уведення зависi мжобактерш Бактерiоскопiя мазюв-вщбитюв з органiв евтаназованих (через 80 дб) тварин виявила некислотост1йк1 палички, зерна-тшьця. У контрол! маса тша тварин тенденцшно збнишуеться, а бактерюскотчт дослщження (мазки-вщбитки) виявляються негативними. Мжобактери з новими, генетично закршленими властивостями володють здаттстю стимулювати доброяюсний шфекцшний процес без розвитку алерги. Можливо, згасання активно-сп генв, вщповщальних за патогены властивосп, яю визначаються окисно-вщновними процесами (депдрогеназна, каталазна ак-тивтсть тощо) та генами, яю перебували в неактивному стан!, штенсифжують метабол!чн! процеси синтезу шгменту з приггаченням ди факторгв (токсинв) патогенносп. Не встановлено залежноста м!ж швидюстю розмноження (строки утворення колонш) та патогенн!стю, осюльки вихщна материнська культура (третя генерация) дослщжуваних змшених форм M. bovis волод-ла високою в!руленттстю та формувала колони на другу-третю добу, не утворюючи пименту та не володючи вираженою депд-рогеназною та каталазною активтстю. У стат розглянуто штамиM. bovis, вщмшш за бюлопчними властивостями в!д патогенних штам!в.
Ключоа слова: дисоцативт форми Mycobacterium bovis; лЫди; середовище; температура
Днтропетровсъкий державний аграрно-економiчнuй yrniверситет, вул. Ворошилова, 25, Днтропетровськ, 49027, Украта DnipropetrovskState Agrarian-Economic University, Voroshilov Str., 25, Dnipropetrovsk, 49027, Ukraine Tel.: +38-050-58-76-372. E-mail: [email protected]
Днтропетровсъкий нацюналъний )Miверситет мен Олеся Гончара, пр. Гагарина, 72, Днтропетровськ, 49010, Украгна Oles Honchar Dnipropetrovsk National University, Gagarin Ave., 72, Dnipropetrovsk, 49010, Ukraine Tel.: +38-050-93-90-788. E-mail: [email protected]
Biological properties of dissociative L- and other forms of Mycobacterium bovis
A.A. Tkachenko1, P.O. Davydenko1, V.V. Zazharskiy1, V.V. Brygadyrenko2
'Dnipropetrovsk State Agrarian-Economic University, Dnipropetrovsk, Ukraine 2Oles Honchar Dnipropetrovsk National University, Dnipropetrovsk, Ukraine
A race of modified forms of mycobacteria with special properties that can be promising for the construction of TB vaccines was selected It was found that the persistence of the researched microorganisms (27th subculture of acid-fast bacillus and the L-form) persisted for nine months (the period of research) and longer in the bodies of guinea pigs. However, from the suspension prepared from macroscopically unchanged organs of the experimental animals we found acid-proof elementary bodies (grains) and bacilli of typical morphological forms, which formed an orange culture on the nutrient medium on the third day after suspension seeding. The inoculation of guinea pigs with isolated acid-proof mycobacteria (culture-revertant) (1 mg/cm3) was not accompanied by the development of allergic condition (allergic reaction to the tuberculin and AAM was negative at 30, 60 and 90 days); however, acid-proof bacilli, which formed an orange culture, were isolated on the the third day from experimental animals which had been subjected to euthanasia. Multiple passages through the artificial culture medium (dense), prolonged exposure (20 months) at low plus temperature changed the genetic balance, ensuring their survival as a result of the loss of some (specific to the pathogen) and the acquisition of new properties (especially atypical )which are partly inherent in other mycobacteria. At the same time, the persistence in the body of guinea pigs of typical morphological acid-proof forms (bacilli) that reverse from L-forms was not accompanied by the development of the disease. They are chromogenic and retain the ability to form colonies (culture-revertant) on dense nutrient medium from the first generation (from biological material of the guinea pigs) on the second day of cultivation. The loss of sensitization ability of Mycobacterium bovis which were passed many times and persistent in the body of guinea pigs can probably testify to the loss of immunogenic capacity, since the development of allergic (tuberculin) reaction, as well as its intensity, indicates an immunological restructuring of the microorganism (the development of an infection) with the parallel acquisition of the specific resistance. We observed a residual virulence of the researched modified forms of M. bovis with the possible formation of specific antiTB immunity without development of the necessary level, which was the indicator of allergic condition and ulceration of the site where the suspension of mycobacteria was introduced. Microscopy of smears of organs of the euthanized animals (after 80 days) revealled acid-nonproof bacilli, seeding cells. In the control, the weight of the animals tended to increase while the bacterioscopic research (smears) proved negative. Mycobacteria with new, genetically fixed properties have the ability to stimulate benign infectious process, without the development of allergies to the level required for the detection by PPD- for mammals AAM. However, it should be noted that perhaps the extinction of the activity of genes responsible for the pathogenic properties, which are determined by redox processes (dehydrogenase, catalase activity, etc.) and genes which were in a dormant state, activate metabolic processes of pigment synthesis with inhibition of the action of pathogenic factors (toxins). We did not find a relationship between the rate of reproduction (duration of colony formation) and pathogenicity because the original parent culture (third generation) of the investigated modified forms of M. bovis had a high virulence and formed colonies on the second or third day without forming pigment and did not express dehydrogenase and catalase activity. In this article we discuss strains of M. bovis which differ in biological properties from pathogenic strains.
Keywords: dissociative forms of Mycobacterium bovis; lipids; medium; temperature
_ активтстю, здаттстю набувати атипових властивостей.
^ Важливi у цьому напрямi дослдження L- та 1нших форм
Мшобактерп взагал1 й Mycobacterium bovis зокрема
M. bovis дисощант1в 3i втраченою (зниженою або втраче-ною) сенсибшзувальною здаттстю, як1 розмножуються
володгють генетично закладеною здаттстю суттево зм1- ,, ог,
. . J за температури 3 °С у динамщ пасажш через щшьне се-
нюватися як фенотитчно, так i генотипно: втрачаючи
^ ... редовище, оскшьки праць такого спрямування у до-
деяк1 антигени з одночасною появою шших, яю для rn- • „ • • г-р ....
" .„ . . , ступнш нам л1тератур1 не знаидено. Тому мета ще1 статп -
кобактерш взагал1 не нов1 (O Reilly et al., 1995; Glickman , ... . .
, „/I, . , , J. T , зясувати бюлопчт властивосп L- та 1нших форм дисощ-
et al., 2001; Anaelom et al., 2010; Perez-Lago et al., 2014). \ , , .
^ ' ' ' ' b . ' / анпв M. bovis, культивованих за температур 3 1 37 °С.
При цьому зм1ни можуть в1дбуватися за ди фактор1в
довк1лля та незалежно в1д них, що щдгверджуе лаб1ль-
н1сть закладеного в бактер1альнш кл1тин1 геному з «др1- Матерiал i методи дослщжень
маючими» й активними та активувальними генами (rpf)
(Yuan et al., 1996; Voskuil et al., 2003; Tufariello et al., Експерименти виконували в навчально-дослвднш
2004; Downing et al., 2005; Sherman et al., 2005). лаборатори кафедри етзоотологи Дн1пропетровського
Саме вони визначають ту чи 1ншу здатн1сть м1кобак- державного аграрно-економ1чного ун1верситету з вико-
тер1й на певн1й стади розвитку, збер1гаючи високу ймо- ристанням зм1нених форм одного штаму Mycobacterium
в1рн1сть реверсИ у вих1дну чи конверсИ у наступну нову bovis, одержаних у 118-му пасаж1 через середовище Ле-
форму, з ч1тко вираженими пост1йними генетично закр1- венштейна - Йенсена (рН - 7,1-7,2) за температури
пленими або тимчасовими (фенотип1чними) ледь пом1т- культивування 37 °С та витриманих 1з початковим рос-
ними властивостями: змшюеться морфолог1я м1кобакте- том поодиноких колонш (118-та субкультура) за темпе-
р1й, культуральн1, б1ох1м1чн1 та 1нш1 властивост1, ратури 3 °С упродовж 20 м1сяц1в. Досл1джували 1зольо-
лшщний склад (Krauss et al., 2003; Pavlik et al., 2004; ваш колони в динамщ послвдовних 60 перес1в1в. Анал1-
Davies, 2006; De la Rua-Domenech, 2006). Зважаючи на зували швидк1сть росту культури, шгментоутворення за
так1 механ1зми, м1кобактер11 (зокрема M. bovis) залиша- зм1ни рН середовища, морфолог1чн1 ознаки, тинкто-
ють багато нез'ясованих питань, пов'язаних у першу р1альн1 (мазки фарбували за методом Ц1ля - Н1льсена)
чергу з морфолог1ею м1кробно1 кл1тини, 11 б1олог1чною властивост1 зм1нених форм м1кроорган1зм1в, культиво-
ваних за 3 1 37 °С, ргст культури р1зних генерацш мко-бактерш на простих живильних середовищах, на середо-вищ1 з умстом 0,5 { 1,0 мг/см3 салшиловокислого натрш.
Загальновщомими методами дослщжували депдро-геназну та каталазну активност змшених мкобактерш вихщних культур { !х ревертанпв, видлених з орган1в морських свинок, в оргатзм яких шокульовано дослщ-жуван М. Ьоу1з.
Ддя з'ясування кшьюсного та яюсного вмсту вшьних жирних кислот хроматограф1чним методом дослщили мкобактерп вихдних в1рулентних культур (2, 59, 100), культивованих за 37 °С, та дисощативних форм, культи-вованих за 3 { 37 °С (Иааааа е! а1., 2004; ТЪоеп е! а1., 2014). 1з метою встановлення у тривалому дослщ сенсибт-зувально! здатност з використанням симультанно! проби (ППД для ссавцш та ААМ) та шших особливостей мкобактерш, пасажован мшроорганзми, накопичет на щтьному середовищ1 за температури 3 °С, шокулювали (разово в доз1 1 мг/см3) чотирьом морським свинкам, з яких дм евтаназували через три, а шших - через дев'ять мсящв вщ початку досл1ду, з наступним бактерюлопч-ним дослщженням бюлопчного матер1алу вщ них 1 повторною шокулящею видлено! культури (ревертант) досл1дним морським свинкам.
Можливгстъ викликати шфекцшний процес тубер-кульозу дослщжуваними мкобактер1ями вивчали шляхом дворазово! шокуляцл (1 мг/см3 з штервалом через 1,5 мгсяця) свинкам мкобактерш, культивованих за 3 1 37 °С. Реакцто макроорганзму на введен мкобактерп ощнювали кожт 10 д1б. Визначали масу тла, строки формування виразки в дшянщ уведення завиа мкобактерш, розвиток тдвищено! чутливост сповшьненого типу (симультанна проба з ППД для ссавцш кожн 30 д1б) та патолого-анатомчт змши (через три мюящ вщ початку другого уведення завиа мшрооргашзмш). Для контролю в дослщах використовували М. Ьоу1з патогенного материнського штаму.
У дослщженнях застосовували методики, передбаче-н в1дпов1дними положеннями (Haddad е! а1., 2004; ТИоеп е! а1., 2014).
Результати та 1х обговорення
Вивчаючи ргст мкобактерш на щтьному яечному середовищ1 одне! проб1рки за температури 3 °С тсля 118-разового пасажування через середовище з рН 7,17,2 вщмгтили, що за 20-м1сячний термш впливу цього температурного режиму культивування характер куль-тури та кшьюсний склад колонш суттево змшився. До розмщення культури в умовах низько! температури зафксовано п'ять др1бних колонш, тсля - налгт, одна велика шорстка колоня та десять др1бних. Мкроско-тею мазюв, приготовлених з окремих колонш, як сформувалися в умовах культивування 37 та 3 °С, вияв-лено кислотостшю коротш, товст та тоню, прям та вигнут! 1з заокругленими кшцями та вираженою зернис-тютю палички, як розмщувалися скупченнями. Пров1в-ши пост на живильне середовище завиа мкобактерш, приготовлено! з 1зольованих колонш, та культивуючи М. Ьоу1з за температури 3 °С на 12-ту добу, виявили слабкий ргст окремих поодиноких др1бних правильно!
форми гладеньких аро-бших колонш (визначених нами як друга генерация субкультури), як у подальшому фор-мували суцшьний рют по лшл посту (рис. 1).
Рис. 1. Культура М. ЪогЬ друго! генерацй за 3 °С
Рис. 2. Ь-форми М Ъоую друго!' генерацй: бар - 1 мкм
Мжроскошею мазк1в, приготовлених 1з культури, встановлено некислотостшю овали (Ь-форми) з р1зною оптичною щшьтстто поверхн та поодинок кислото-ст1йк1 елементарн1 т1льця (рис. 2). У контрол1 М. ьоу1з 100-! субкультури патогенного штаму за температури 3 °С росту не виявили.
Вис1явши на середовище шести проб1рок завись м1кобактер1й, приготовану з одержано! культури друго! генерацй, й культивуючи !! за температури 3 1 37 °С, первинний рют вологих кремових колон1й виявили на 11- { 25-ту добу спостереження, в1дпов1дно. М1кроско-п1ею мазк1в, виготовлених 1з виявлених колон1и (за 3 1 37 °С), встановлено як некислотост1йк1 овали з р1зною оптичною щшьшстто поверхн1 (Ь-форми), так 1 кислото-ст1йк1 елементарн1 т1льця.
Необхщно зазначити, що, за б1льш1стю лпературних даних, трансформован1 в Ь-форми М. ьоу1з, як 1 1нш1 види м1кобактер1й, не культивуються на щшьних жи-вильних середовищах. Для цього використовуються спец1альн1 нап1вр1дк1 середовища за присутносп осмо-тичних фактор1в. Окрем1 пов1домлення св1дчать (Тка-еИепко е! а1., 2010), що так1 форми збудника розмножу-ються { на щшьних середовищах, утворюючи колон1!, що тдтверджено нашими досл1дженнями.
Вивчення патогенних 1 сенсиб1л1зувальних властиво-стей одержаних культур за температур 3 1 37 °С на морських свинках свщчило, що м1кобактер1! не викли-кають туберкульозних патолого-анатом1чних зм1н, не сенсибшзують орган1зм тварин щодо ППД для ссавц1в.
Пров1вши с1м прямих пасаж1в досл1джуваних м1кроорган1зм1в через щшьне живильне середовище та культивуючи М. ьоу1з за температур 3 1 37 °С, р1ст культури за 3 °С в1дм1тили на п'яту добу, а за 37 °С - на чет-верту добу. За цих умов мкобактерп у першому випадку продукували помаранчевий, у другому - кремовий п1гмент. Мкроскопя мазк1в, приготовлених 1з культур (рис. 3), виявила некислотост1йк1 довг1 та коротш, товст!
та tohki, вигнут1 та прям1, 13 заокругленими к1нцями зернисп палички та кислотосгшш елементарш тшьця та L-форми за 3 °С, L-форми та шш1 утвори - за 37 °С куль-тивування. Стосовно останшх необх1дно зазначити, що в материнсьюй культур! на раншх етапах морфогенезу ниткошд1бт некислотостшк! мшэбактерй звшьняли кислотостшю зерна, з яких утворювались типов! клттини М. bovis, на що ми звернули увагу ще у 2008 рощ (Tka-chenko et al., 2008). 1з часом (через 60-80 пасаж1в) некислотостшк! форми цього самого вар1анта збудника ниткопод!бш мшрооргатзми (рис. 3) звшьняють некислотостшк! структурш елементи - зерна, з яких форму-ються L-форми (на початку видовжеш) !з р1зною оптич-ною щшьшстю поверхш
Рис. 3. L- та iiiiiii форми М. bovis, культивоваш за температури 3 °С (1) i 37 °С (2): бар - 1 мкм
Вивчення патогенних, сенсибшзувальних властиво-стей дослщжуваних субкультур мшобактерш десято! генераци, одержаних за р1зних температур культивуван-ня, свщчило, що морськ свинки залишаються живими, не реагуючи на ППД для ссавц1в упродовж тримюячного дослвду. Здшснивши ще десять пасажш мшобактерш дослщжуваних субкультур через щшьне живильне сере-довище, встановили суттеве пришвидшення формування колонш, пор1вняно з десятою генеращею, тшьки за температури культивування 37 °С (з 4 до 2 даб). Мшроскошя мазкв, приготовлених !з культур, свщчила, що за температури культивування 3 °С генеруються некислотостшю, довп та коротка, тонк1 вигнут1 та прям! !з заокругленими к1нцями зернисп палички, L-форми (овали) та ледь чер-вонувап поодинок! елементарш тшьця, за 37 °С - некислотостшю, переважно коротка, зернисп, вигнуп та прям! палички, L-форми та кислотостшш елементарш тшьця.
Наступш дослщження мшобактерш, пасажованих за р1зних температур (15-! генераци), провели на простих живильних середовищах (МПА та МПБ). У контрол патогенш M. bovis (100-та субкультура дослщжуваного вар1анта), на середовищ! Левенштейна - Йенсена за 37 °С росли на 23-тю добу, а за 3 °С росту культури не виявлено упродовж тримюячного спостереження. На МПА та МПБ мшобактери патогенного штаму не росли, а змшеш мшрооргатзми проявляли рют на тругу-третю добу дослщу. На агар! ввдшчено суцшьний рют по лши поаву свпло-аро! культури, яка мала тенденцш до збшьшення в чаа. У бульйош на початку росту культури ввдшчено свпло-ару нивку на поверхш, слабке помут-ншня з наступним утворенням осаду. Через три тижш, за наявносп пл1вки та помуттння, р1вень осаду збшьшився в 4-6 разш.
Мшроскошею мазк1в, приготовлених !з тижневих культур (3 °С) на МПА, виявлено некислотостшк! коротк та довп, товсп прям та вигнуп !з заокруглени-
ми к1нцями зернисп палички, некислотостшк1 зерна та L-форми, за 37 °С - некислотостшю елементарш тшьця та L-форми. У культур! МПБ за 3 °С - некислотостшю коротю та довп товсп, прям та вигнуп зернисп !з заокругленими к1нцями палички та некислотостшю зерна, за 37 °С - кислото- та некислотостшк! зерна та L-форми.
Через три тижш мжроскотею мазк1в, приготовлених !з плшки та осаду МПБ, виявили у першому випадку (за 3 i 37 °С) практично однаковий, поршняно з тижневою культурою, за морфолопею й тинктор1альними властивостями малюнок. Проте в осад1 (за 3 °С) палички р1зно! форми та довжини виявилися некислотостшкими, у щпвщ кислото-та некислотостшкими, а за 37 °С - тшьки кислото-стшкими. Важлив1 даш одержат за одночасного пасажу L-форм через щшьне середовище Левенштейна - Йенсена за р1зних температур культивування. Вивчаючи пщ ¡мераею мазки, приготовлен !з дещо помаранчевого кольору субкультури першо! генераци, в умовах культивування за температури 3 °С вщтчено (рис. 4) наявтсть L-форм (видовжеш овали, !з деяких виштовхуються зерна) та зернистих паличок (коротка та бшьш довп). В умовах термостата (культивування жовтувато! субкультури, яка легко емульгувалася) зареестровано тшьки L-форми з р1зною оптичною щшьнютю поверхш (практично кругло! форми) та поодинок зернисп палички. У третш генерацй', в умовах холодильника, субкультуру формували L-форми (видовжеш овали), палички й зерна; у четвертш в умовах термостата - L-форми (круга) та поодиною паличкопод1бш утворення.
П'яту субкультуру культивували за 3 °С. Вона харак-теризувалася видовженими L-формами, паличкоподаб-ними та зернистими некислотостшкими елементами. Сьома субкультура (термостат) формувалася практично винятково L-формами (круглими) та поодинокими тов-стими зернистими короткими та довгими паличками.
У мазку сьомо! субкультури, одержано! за 3 °С, вияв-леш видовжеш L-форми, з яких звшьняються зернисп форми та коротю палички. У дев'ятш субкультур! (термостат) у пол! зору мжроскопа заф!ксован! т!льки L-форми, кругло! форми та злегка червонуват!, поодинок!, елементарш тшьця.
Мазок !з восьмо! субкультури (3 °С) характеризувався наявнютю тих самих форм м!кобактер!й, що й у сьомш.
У мазку, приготованому з 12-! субкультури, що одержана в термостат!, виявлеш L-форми та елементарш тшьця (зерна) з ледь червонуватим вщтшком. У субкультур! 10-! (3 °С) та 18-! (37 °С) генерацш суттевих зм!н, пор!вняно з попередн!ми дослщженнями мазк!в, не виявлено. Хоча в мазку як першо!, так i друго! культур, заф!ксовано зерниси палички. У 12-й субкультур! (3 °С) виявлено видовжен! L-форми, з яких звшьняються некислотостшю зерна та палички, як коротю, так i довп, та поодинок! ледь червонуват! елементарш тшьця; у 19-й субкультур! (термостат) - L-форми, довп, коротю зернисп палички та елементарш тшьця з червонуватим вщтшком. 20-та (3 °С) та 21-ша (37 °С) генераци харак-теризувалась тими самими морфолопчними формами м!кобактер!й, що i 12- i 19-та.
Узагальнюючи динамшу морфолог1чних ознак, тинк-тор!альних властивостей i характер росту культур змше-них форм M. bovis (у тому числ! L-форм), робимо незапе-речний висновок, що за умов низько! температури (3 °С) у
чяа re^pyRnbcH, ня фoнi cтaбiльнocтi кулк^и, œrarao-тocтiйкi зepнa, зepниcтi пялички, зi змeншeнням ïx кшь-Rocri в чaci пopiвнянo з виидюю кyльтypoю, L-фopми.
Рис. 4. L- та iншi фopми М. bovis, пacaжoвaнi 4epe3 щiльнe живильнe cepeдoвищe:
злiвa - зя тeмпepaтypи 3 °С, cпpaвa - зя 37 °С: 6ap - 1 мкм; цифpaми ня фoтoгpaфiяx пoзнaчeнo нoмep cy6кyльтypи
B yмoвax тepмocтaтa ня фoнi змeншeння кiлькocтi тя змши мopфoлoгiï L-фopм з'являютьcя нeкиcлoтocтiйкi зepнa, кopoткi тя ниткoпoдiбнi пялички тя moAmo^ чepвoнyвятi eлeмeнтяpнi тiльця, яю, нaпeвнo, змiнюють xяpяктep pody кулк^и. Якщo зя вiдcyтнocтi eлeмeнтя-prnx тiлeць кyльтypя у виглядi cyцiльнoгo pocтy пo лiнiï виciвy зявиа дocлiджyвaниx мiкpoopгянiзмiв iнтeнcивнo po^a то з шявдю eлeмeнтяpниx тiлeць (чepeз 4-5 дiб культивувяння) вoня нaчeбтo пpoвялювaляcя щд вля^ ним т^шм у cepeдoвищe: iз чяcoм культя витончувя-ляcя, я чepeз 2-4 тижш cepeдoвищe «cтiкялo», щo cвiд-чить npo нeзвичaйнi, ocoбливi влacтивocтi циx фopм M. bovis.
Boднoчяc, нaшi (Tkachenko et al., 2008, 2010) шш-peднi дocлiджeння нeoднopaзoвo cвiдчили, щo швидкicть poзмнoжeння дocлiджyвaнoгo штяму м^бята^'ш, зни-жeння cтyпeня вipyлeнтнocтi, змшя якicнoгo тя кшькю-нoгo craany вiльниx жиpниx киcлoт cyттeвo зaлeжaть ввд pH cepeдoвищя. Тoмy в цюму нaпpямi нeoбxiдними ви-явилгея дocлiджeння впливу вмicтy пpoтoнiв у cepe-дoвищi ня пiгмeнтoyтвopeння, мopфoлoгiю тя тинктopi-aльнi вляcтивocтi фopм мiкoбaктepiй зя тeмпepятypи культивувяння 3 °С (зя 37 °С пacaжoвaнi мiкoбaктepiï ня цьoмy eтaпi дocлiджeнь втpятили здятнicть pocти ня ce-peдoвищi).
Пepeciявши дocлiджyвaнi мiкpoopгaнiзми тя onrnm-ши xяpaктep pocтy кулк^ дo 26-ï (cepeдoвищe з pH 7,17,2) i няcтyпниx (з 27-ï пo 37-му) гeнepaцiй, вiдмiтили, щo злeгкя пoмяpaнчeвoгo кoльopy кyльтypa M. bovis (pиc. 5) ня cepeдoвищi з pH 6,5 iз чяcoм (чepeз 2-3 тижнi) нябувяля iнтeнcивнiшoгo зябяpвлeння, ня cepeдoвищi iз pH 7,1-7,2 - зaлишяляcя мaйжe тaкoю caмoю (cтявaля злeгкя пoмяpянчeвoю) yпpoдoвж тpьox мicяцiв культивувяння.
Bивчaючи тд iмepcieю мaзoк, пpигoтoвлeний з куль-тypи 26-ï re^pa^i' мiкoбaктepiй, виявили (pиc. 6) œpe-вяжну бiльшicть нeкиcлoтocтiйкиx зepниcтиx фopм, ш-кoли (piдкo) киcлoтocтiйкi пялички тя, дocить pinpo, тoвcтi (15-20 мкм) тeмнo-cинi пялички з oднieю щшьт-cтю пoвepxнi. Пepший пepeciв тaкиx piзниx фopм iз 26-ï re^pa^f ня cepeдoвищe з pH 6,5 cyпpoвoджyeтьcя ш-явoю знaчнoï кiлькocтi cинix oвaлoпoдiбниx фopм ^з тeмними зepнaми в цeнIpi) з piзнoю oптичнoю щшь-нicтю пoвepxнi, дpiбниx зepeн, iнкoли з чepвoним ввдпн-кoм, якi poзтaшoвyютьcя тшьки нaвкoлo тя пoблизy ora-лiв (cинix). щo cвiдчить npo «виштoвxyвaння» зepeн з oвaлiв. Пoдiбнe виявлeнo в мязку, пpигoтовлeнoмy з кульки 33-ï тя 37-ï re^pa^: ^œ вiдмiчeнo тякoж нeзнячнy кiлькicть CTmx yтвopeнь, як1 нябули фopми товcтиx oвaлoпoдiбниx зepниcтиx пaличoк. Ha тя шбли-зу ниx (ябo «виштoвxyютьcя» з ниx) poзтaшoвaнi дpiбнi нeкиcлoтоcтiйкi (дyжe pinpo киcлoтocтiйкi) зepниcтi фopми (0,1-0,2 мкм). Типoвиx фopм пяли^к збудникя тyбepкyльoзy в цш тя пoпepeднiй гeнepaцiяx (нявiть нeкиcлoтоcтiйкиx) ж виявлeнo.
Пpoвiвши щe 10 пepeciвiв, ycтaнoвили, щo у пepшi п'ять (41-45-й) picI-кyльтypи вiдмiчявcя з чeтвepтоï' дo-би, як пpaвилo, у вигляд кpeмoвoгo нaльoтy пo лши ш-cißy з няступним фopмyвaнням oкpeмиx вeликиx cyxnx кoлoнiй пoмяpaнчeвoгo кoльopy (pиc. 7). У той жe чяc 45-тя cyбкyльтypя вияви^я cлизoвoю тя в'язкoю. У мязку, пpигoтoвлeнoмy iз cyбкyльтypи цьoгo пepeciвy
щд 1мерс1ею м1кроскопа, виявлено некислотост1ик1 зернисп та некислотостшк1 велик! (у 12 разш бшьш1 за палички) видовжеш овали з одшею щшьтстю поверхш, з яких «виштовхуються» коротш палички (рис. 8).
У наступи п'ять переавш (рис. 9) культура залиша-лася слизовою, а й! рют характеризувався через одну-шють д1б змшою тгменту (з помаранчевого на жовту-ватий).
б
Рис. 5. КультураL- ташших форм M. bovis:
а - на середовищ1 з рН 7,1-7,2, б - на середовищ1 з рН 6,5
Рис. 6. L- та iHii форми M. bovis: 26 - 26-та генеращя (рН середовища 7,1-7,2), 27, 33, 37 - ввдповвдно 27-, 33- та 37-ма генераци (рН середовища 6,5); бар - 1 мкм
Рис. 7. Культура змшених M. bovis: 45-й пасаж за 3 оС
Рис. 9. Культура M. bovis дисощативних форм 118-го варiанту: 50-й пасаж за 3 оС
Рис. 8. L- та iHii форми M. bovis:
45-й пасаж за 3 оС, бар - 1 мкм
У пол1 зору мазка, приготовленого з культури 50-го перес1ву, виявлено практично так1 сам1 форми мшроорга-н1зм1в: на фон1 некислотостшких зернистих овал1в (L-фор-ми) зареестровано також некислотост1йк1 зерна, як1 звшь-няються з них i розташовуються м1ж ними (рис. 10). На 60-му пересш встановлено культуру та морфолопчт форми м1кобактер1й, 1дентичн1 50-й субкультур! Отже, культивування дисоц1ативних форм M. bovis за низьких температур (3 °С) на середовищ1 з р1зним рН супровод-жуеться, на фот стабшьносп утворення п1гменту за рН < 7, стабшьтстю морфолопчних форм м1кобактер1й.
Рис. 10. M. bovis дисощативних форм 118-го варiанту:
50-й пасаж за 3 оС, бар - 1 мкм
Необхвдними виявились досл1дження можливих морфолопчних змш за тривалого збереження культури. Тому мшроскопш мазк1в, приготовлених 1з незм1нено! за виглядом i формою 27-! субкультури, витримано! за температури 3 °С, провели через 15 мюящв. Установлено (рис. 11) некислотостшш коротка та б1льш довп зернист1 палички та кислотост1йк1 елементарш т1льця (зернист1 форми).
а
Рис. 11. Елементарш тшьця та некислотостшка форми паличок M. bovis: культивування за температури 3 °С упродовж 15 м1сящв, бар - 1 мкм
Дослщивши на четверту добу помаранчево-червонуватий суц1льний по лши посшу рют культури (рис. 12) четверто! генераци, морфологш та тинктор1а-льш властивосп L-форм на середовищ1 Левенштейна -Йенсена без салщиловокислого натрш за 3 °С виявили некислотостшш утворення (рис. 13) з червонуватою оболонкою та темними зернами всередит овально! ви-довжено! форми (швидше паличкопод1бш). З деяких 1з них звтьняються злегка червонувап зерна та палички.
Рис. 12. Культура L-форм M. bovis (контроль)
Рис. 13. L- та ini форми M. bovis: бар - 1 мкм
Культура, одержана на середовищ1 з умстом 1 мг/см3 салщиловокислого натрш, сформувалася на шосту добу: слизова аро-жовтуватого кольору по лши поаву (рис. 14). М1кроскоп1я мазка (рис. 15), приготовленого з культури, свщчила про наявтсть мжрооргашзм1в, як i в контрол та за вмсту 0,5 мг/см3 салщиловокислого натрш, проте з чпташе вираженим забарвленням у червоний колр уае! клггани кр1м темних зерен усередиш
Рис. 14. Культура L-форм M. bovis: 1,0 мг/см3
Рис. 15. Культура L-форм M. bovis: бар - 1 мкм
За 37 °С культивування на середовищ1 без салщиловокислого натрш ркт культури вщшчено на 15-ту добу, а з його вмютом росту не виявлено.
У той же час у вихщних змшених форм, а також !х культур-ревертантв (видлених з оргашв морських свинок, яким 1нокульовано дослщжуват вар1анти вихвдних м1кроорган1зм1в - кислотостшю палички) виявлено п1дви-щення окисно-в1дновних реакций (дег1дрогеназна та ката-лазна активност1) з одночасною втратою в1рулентност1 м1кобактер1й, у тому числ1 у культур-ревертант1в.
Отже, результати експерименпв св1дчили, що L- та шш1 форми набули властивостей атипових мшобактерш.
Анал1зуючи результати досл1джень вм1сту вшьних жирних кислот у M. bovis типових в1рулентних i зм1не-них ав1рулентних форм, в1дм1тили появу ново! коротко-ланцюгово! ундеканово! кислоти в останшх. При цьому Г! синтез за 3 °С виявився в 15,6 раза штенсившшим, н1ж за 37 °С. У той же час за 3 °С культивування не синтезу-валися до р1вня, щоб !х можна було щентифшувати ви-користанним методом, лауринова й арахшова кислоти, як1 виявлялися у в1рулентних м1кобактер1ях. За 37 °С культивування ав1рулентних м1кобактер1й не виявлено тшьки одну з них (лауринову кислоту). Це св1дчить про глибош зм1ни метабол1зму м1кробно! кл1тини, яю, безпе-речно, зумовлен1 необх1дн1стю И виживання в умовах низьких плюсових температур, що супроводжувалися розмноженням i утворенням колон1й.
Вм1ст в1льних жирних кислот змшених мшобактерш суттево змшився пор1вняно з M. bovis в1рулентно! мате-ринсько! культури. Скелетн1 вшьт жирн1 кислоти (паль-м1тинова, оле!нова, стеаринова) у м1кобактер1ях дисо-щативних форм залишалися у висок1й концентрацп, що св1дчить про незалежн1сть !х вм1сту в1д зм1ни властивостей мшобактерш, !х б1олог1чно! активност1. Тобто змша культуральних, тинктор1альних, в1рулентних, бюмтчних та 1нших властивостей i морфолопчних ознак не викли-кае суттево! змши вм1сту скелетних в1льних жирних кислот. У той же час сшввщношення коротко- та довго-ланцюгових в1льних жирних кислот у в1рулентних субкультур (100+124 / 2) й ашрулентних м1кобактер1й (L- та шших форм) становило 9,94 : 1, 5,51 : 1 (3 °С) та 5,31 : 1 (37 °С) вщповщно. Це суперечить загальноприйнятим уявленням, оск1льки у в1рулентних м1кобактер1й не зм1нених морфолог1чних форм вщтчаеться значно нижчий вм1ст коротколанцюгових в1льних жирних кислот пор1вняно з довголанцюговими. Оск1льки досл1д-ження дисоц1ативних форм, одержаних в умовах низь-ких температур, проведен1 вперше, можливо, така законом1рн1сть сп1вв1дношення коротко- та довголанцю-гових кислот притаманна саме багаторазово пасажова-ним i генетично модиф1кованим м1кобактер1ям, що визначаеться особлив1стю !х метабол1зму. Пор1внюючи
аналопчт дат дослвджень для M. bovis, пасажованих за температуры 37 °С Bipynern™x мiкобактерiй вихвдно! материнсько! культуры (друга субкультура), вщштили, що стввщношення аналiзованих кислот принципово вiдрiзняeться вщ попередтх (1,84 : 1). Проте у мшобак-терiй 59-! субкультури стввщношення цих кислот дорiвнювало 4,89 : 1. Це свщчить про поступову змiнy спiввiдношення синтезу кислот у процеа пасажiв через штучне живильне середовище.
Вмiст ненасичених вiльних жирних кислот, яш характеризуют адаптивнi процеси метаболiзмy мшробно! клiтини, виявився у пальмгтооле!ново! та оле!ново! -нижчим у дисощативних форм мiкобактерiй, у лшолево! та лшоленово! - значно вищим, шж у вiрyлентних мiкроорганiзмiв материнсько! культури.
Можливо, саме ц1 особливостi вмкту ненасичених жирних кислот у дисощативних форм мшобактерш (L- та iншi форми) визначають ступшь вiрyлентностi, який могли б характеризувати довголанцюговi кислоти, оск1льки зниження вмiстy ненасичених кислот, яш, за даними Л.М. Моделя (Model, 1952), вщповщають за гальмування лейкопротеаз. Тобто !х низький вмют щдвищуе активнiсть захисних фактор1в макрооргатзму, що, ввдповщно, забезпечуе нейтралiзацiю довголанцю-гових вiльних жирних кислот i, можливо, визначае за-гальну ашруленттсть дослвджуваних форм мшобакте-рш, у яких вмiст ненасичених жирних кислот практично такий самий за високого вмюту довголанцюгових вiльних жирних кислот у патогенних мiкобактерiй: сп1вв1дношення ненасичених до довголанцюгових кислот становить 4,63 : 1, у ашрулентних - 3,34 : 1 (3 °С) та 2,69 : 1 (37 °С).
Необидно зазначити, що у другш генерацй' материнсько! культури дослвджуваного штаму аналiзованi по-казники складали 1 : 1,26, тобто вмют довголанцюгових вiльних жирних кислот суттево перевищував вмiст ненасичених кислот. Проте вже в 59-й сyбкyльтyрi аналь зоване сшввщношення становило 2,38 : 1, що свщчить про послiдовнi, тенденцiйнi змши синтетазних систем мiкробно! клiтини, зумовлет, беззаперечно, i! пристосу-ванням до змши умов довшлля. Через це порушуються не тшьки хiмiчнi, а й фiзичнi зв'язки компоненпв клпини (лiпiди, проте!ни, вуглеводи), що викликае поя-ву комплексiв iз новими якостями та властивостями, й, напевно, змшу генотипу.
Але чи постшш так1 явища в досладжуваних дисощативних формах M. bovis?
Персистенщя дослвджуваних мiкроорганiзмiв (27-ма субкультура некислотостшш палички та L-форми) в органiзмi морських свинок тривае дев'ять (перюд дослщу) i бiльше мюящв. Проте iз суспензй, приготовлено! з макроскотчно незмшених органiв дослвдних тварин, видiленi кислотостшш елементарнi тшьця (зерна) i типовi морфолопчт форми паличок, як1 на щшьному живильному середовищi утворювали на третю добу п1сля висiвy суспензй' помаранчеву культуру.
1нокуляц1я видiлених кислотостiйких мшобактерш (культура-ревертант) морським свинкам (1 мг/см3) не супроводжувалася розвитком алергiчного стану (алер-гiчна реакця на туберкулш та ААМ через 30, 60 i 90 дiб негативна), проте з органш евтанiзованих через три мюящ дослщних тварин видiленi кислотостшш мшо-
бактери, як1 на третю добу утворювали культуру пома-ранчевого кольору.
Очевидно, багаторазовi пасаж1 через щiльне штучне живильне середовище, тривале перебування (20 мюяцш) в умовах низько! температури змiнили генетичний баланс, що забезпечило !м виживання внаслщок втрати одних (характерних для патогенного мшрооргатзму) та набуття нових властивостей, частково притаманних iншим мшэбактер1ям, зокрема, атипових. У той же час персистенщя в органiзмi морських свинок типових морфолопчних кислотостiйких форм (палички), як ре-версували з L-форм, не супроводжуеться розвитком за-хворювання. Вони залишаються пiгментотвiрними та зберiгають здатнють утворювати колони (культура-ревертант) на щшьному живильному середовищi почи-наючи з першо! генерацй (з бюлопчного матерiалy морських свинок) на другу добу культивування.
Втрата сенсибiлiзyвально! здатносп у мшобактерш, багаторазово пасажованих i персистуючих в органiзмi морських свинок, може свщчити, звичайно, тшьки пев-ною мiрою, про втрату iмyногенно! здатносп, оск1льки вщомо, що розвиток алерпчно! (туберкулшово!) реакщ! та !! штенсивнють свщчать про iмyнологiчнy перебудову макрооргашзму (розвиток iнфекцiйного процесу) з на-буттям специфiчно! стiйкостi. Проте результата експе-рименту свщчили, що один iз рiзноманiтних показнишв клiнiчного прояву iнфекцiйного процесу - змша маси тша морських свинок, в оргатзм яких шокулювали 1 мг/см3 дослвджуваних мiкобактерiй, мае певну законо-трнють динамжи: на 10- та 20-ту добу дослщу маса тiла щдвищилася на 25 i 45 г вщповщно, на 35-ту добу вона знизилася пор1вняно з 20-ю добою на 35 г iз наступним щдвищенням на 50 г на 46-ту добу. Однак через 50 дiб, на друге введення 1 мг/см3 таких форм мшобактерш, подiбне зниження маси тша вщшчене через 15-20 дiб iз наступним виршнюванням попередньо! позитивно! динамши аналiзованого показника. Це може свщчити про залишкову вiрyлентнiсть дослщжуваних змiнених форм M. bovis iз можливим формуванням специфiчного протитуберкульозного iмyнiтетy без розвитку необхщ-ного рiвня, який виявлявся дагностикумом алерпчного стану та утворення виразки на дiлянцi уведення зависi мшобактерш.
Бактерiоскопiя мазшв-вщбитюв з органiв евтаназо-ваних через 80 дiб тварин виявила некислотостшш палички, зерна-тшьця. У конгролi маса тiла тварин тенден-ц1йно збiльшyвалася, а бактерiоскопiчнi дослщження (мазки-вщбитки) виявилися негативними. Очевидно, мшэбактерп з новими, генетично закршленими властивостями володють iншою здатнютю стимулювати доброяк1сний iнфекцiйний процес, без розвитку алерги необхщного р1вня, щоб вона виявлялася ППД для ссавщв та ААМ.
Можливо, згасання активносп генiв, вщповщальних за патогеннi властивосп, як1 визначаються окисно-вщновними процесами (дегщрогеназна, каталазна активност тощо) та генами, яш активiзyвалися (перебу-вали в «др1маючому» станi), активiзyють процеси синтезу тгменту з пригтченням да токсинiв патогенност!
Ми не встановили залежностi м1ж швидк1стю розм-ноження (строки утворення колонiй) i патогеннiстю, оск1льки вихщна материнська культура (третя генерацй)
дослвджуваних змшених форм M. bovis володша висо-кою в1рулентн1стю та формувала колони на другу-третю добу, не утворюючи тгменту та не володшчи вираже-ною депдрогеназною та каталазною активтстю (Mana-chenko et al., 1994).
Отже, селекцшована раса змшених форм мшобактерш з особливими властивостями може виявитися перспективною для конструювання протитуберкульозно! вакцини.
Висновки
Селекцшна раса змшених форм M. bovis: L-форми за пасаж1в через щшьне середовище за температури 3 °С, змшюючись морфолопчно, переходить у некислото-стшю паличков^ коков1 форми, за 37 °С - у некисло-тостшш (школи кислотостшш) елементарш тшьця (зерна); за температури 3 °С рют на щшьному селективному живильному середовищ1 помаранчево! культури ввдбу-ваеться на другу-третю добу культивування (школи на 24-ту годину), за 37 °С - жовтувато! культури в так1 сам1 строки, але шсля 20 перес1в1в ввдбуваетъся слабкий рют культури за ще! температури, який 1з часом припи-няеться; на МПА та МПБ M. bovis ростуть (3 i 37 °С, останш субкультури з 26-! генераци тшьки за 3 °С) на першу-другу добу культивування; на середовищi з умiстом салщиловокислого натрш за низько! температури M. bovis ростуть на шосту добу, а за 37 °С - на 15-ту; володшть вираженою депдрогеназною та каталазною активностями; авiруленгнi - упродовж дев'яти мiсяцiв частково реверсують у кислотостшю морфологiчнi фор-ми, не викликаючи туберкульозу в морських свинок, володшть низькою або не володшть узагалi сенси-бiлiзувальною здатнiстю (щодо ППД для ссавщв, у тому числ ААМ), не утворюють виразки на дiлянцi уведення мiкобактерiй; у першш генераци культура - ревертант (видiлена з органiв морсько! свинки) на другу добу утворюе помаранчеву культуру; бактерй' синтезують новi коротколанцюговi вiльнi жирнi кислоти, як1 не ви-являються у вiрулентних мшобактерш материнсько! культури.
Бiблiографiчнi посилання
Anaelom, N.J., Ikechukwu, O.J., Sunday, E.W., Nnaemeka, U.C., 2010. Zoonotic tuberculosis: A review of epidemiology, clinical presentation, prevention and control. J. Public Health Epidemiol. 2(6), 118-124. Davies, P.D.O., 2006. Tuberculosis in humans and animals: Are
we a threat to each other? J. R. Soc. Med. 99(10), 539-540. Davydenko, P.O., Bilan, M.V., Tkachenko, O.A., 2010. Sensybi-lizuval'ni, virulentni vlastyvosti ta lipidnyj sklad M. bovis, ba-gatorazovo pasazhovanyh cherez shhil'ne zhyvyl'ne seredovy-shhe z pH 7,1 [Sensitizing, virulence properties and lipid composition ofM bovis in nutrient medium with pH 7.1]. Ve-terynarna Medycyna Ukrajiny 2, 20-22 (in Ukrainian). De la Rua-Domenech, R., 2006. Human Mycobacterium bovis infection in the United Kingdom: Incidence, risks, control measures and review of the zoonotic aspects of bovine tuberculosis. Tuberculosis 86, 77-109. Downing, K.J., Mischenko, V.V., Shleeva, M.O., Young, D.I., Young, M., Kaprelyants, A.S., Apt, A.S., Mizrahi, V., 2005.
Mutants of Mycobacterium tuberculosis lacking three of the five rpf-like genes are defective for growth in vivo and for resuscitation in vitro. Infect. Immun. 73, 3038-3043.
Glickman, M.S., Jacobs, Jr, W.R., 2001. Microbial pathogenesis review of Mycobacterium tuberculosis: Dawn of a discipline. Cell 104, 477-485.
Haddad, N., Masselot, M., Durand, B., 2004. Molecular differentiation of Mycobacterium bovis isolates. Review of main techniques and applications. Res. Vet. Sci. 76, 1-18.
Krauss, H., Weber, A., Appel, M., Enders, B., Isenberg, D.H., Schiefer, G.H., Slenczka, W., von Graevenitz, A., Zahner, H., 2003. Zoonoses: Infectious diseases transmissible from animals to humans. 3rd ed. Amer. Society for Microbiology.
Model, L.M., 1952. Byologyja y byohymyja tuberkuleznyh my-kobakteryj [Biology and biochemistry of Mycobacterium]. AMN SSSR, Moscow (in Russian).
O'Reilly, L.M., Daborn, C.J., 1995. The epidemiology of Myco-bacterium bovis infections in animals and man: A review. Tuber. Lung. Dis. 76, 1-46.
Pavlik, I., Jahn, P., Dvorska, L., Bartos, M., Navotny, L., Ha-louzka, R., 2004. Mycobacterial infections in horses: A review of the literature. Vet. Med. Czech. 49(11), 427-440.
Perez-Lago, L., Navarro, Y., Garcia-de-Viedma, D., 2014 Current knowledge and pending challenges in zoonosis caused by Mycobacterium bovis: A review. Res. Vet. Sci. 97, S94-S100.
Sherman, D.R., Voskuil, M., Schnappinger, D., Liao, R., Har-rell, M.I., Schoolnik, G.K., 2001. Regulation of the Mycobacterium tuberculosis hypoxic response gene encoding al-phacrystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7534-7539.
Thoen, C.O., Steele, J.H., Kaneene, J.B. (eds.), 2014. Zoonotic tuberculosis Mycobacterium bovis and other pathogenic my-cobacteria. 3rd ed. John Wiley and Sons, Chichester, UK.
Tkachenko, O.A., Bilan, M.V., Miskiv, V.V., Davydenko, P.O., Zazhars'kyj, V.V., 2010. Biologichni vlastyvosti dyso-ciatyvnyh form M. bovis: Kul'tural'ni osoblyvosti za temperatur 3 i 37 °C [Biological properties of dissociative forms of M. bovis: Cultural features at 3 and 37 °C]. Veterynarna Medycyna Ukrajiny 3, 33-35 (in Ukrainian).
Tkachenko, O.A., Bilan, M.V., Zazhars'kyj, V.V., Davydenko, P.O., Miskiv, V.V., Koval'ov, A.V., 2010. Biologichni vlastyvosti dysociatyvnyh form M. bovis: Morfologichni oznaky ta tynktorial'ni vlastyvosti za temperatur 3 ta 37 °C [Biological properties of dissociative forms of M. bovis: Morphological characteristics and properties at 3 and 37 °C]. Veterynarna Medycyna Ukrajiny 12, 27-30 (in Ukrainian).
Tkachenko, O.A., Galatjuk, O.J., Bilan, M.V., 2008. Morfologichni aspekty reversiji nekyslotostijkyh nytkopodibnyh M. bovis v bakterial'nu kyslotostijku formu [Morphological aspects of M. bovis reversion in bacterial acid form]. Suchasni problemy tuberkul'ozu v Ukrajini: Prychyny ta shljahy jih podolannja [Modern problems of tuberculosis in Ukraine: Causes and ways to overcome them]. Kyiv. P. 149-153 (in Ukrainian).
Tufariello, J.M., Jacobs, W.R., Chan, J., 2004. Individual Myco-bacterium tuberculosis resuscitation-promoting factor homologues are dispensable for growth in vitro and in vivo. Infect. Immun. 72, 515-526.
Voskuil, M.I., Schnappinger, D., Visconti, K.C., Harrell, M.I., Dol-ganov, G.M., Sherman, D.R., Schoolnik, G.K., 2003. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J. Exp. Med. 198, 705-713.
Yuan, Y., Crane, D.D., Barry, C.E. 3rd, 1996. Stationary-phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis: Function of the mycobacterial alpha-crystallin homolog. J. Bacteriol. 178, 4484-4492.
Hadiümna do редкоnегli 27.08.2016
