CC BY
24
УДК 619:616.93:579.673.21:636
Ткаченко О. А., професор, д. вет. н.,Бшан М.В., ст. викладач, к. вет. н., Глебенюк В.В., асистент © Днтропетровський державный аграрный утверситет
ВПЛИВ ПАСАЖУ ЧЕРЕЗ МОРСЬКИХ СВИНОК НА Б1ОЛОГ1ЧНУ АКТИВН1СТЬ ТА Л1П1ДНИЙ СКЛАД M. BOVIS ШВИДКОРОСЛОГО ШТАМУ
Наведено результати пасажування M. bovis швидкорослого штаму через оргашзм морських свинок. Мтобактерп володтть високою здатшстю, за стабтьностг бюхгмгчних властивостей, змтювати свт лтдний склад.
Ключовi слова: пасажування мтобактерш, в1рулентшсть, лтдний
склад.
Вступ. За тривалих пересiвiв та збер^ання мжобактерш на штучних живильних середовищах знижуеться ix вiрулентнiсть [1, 2].
В той же час загальновщомо, що для вiдновлення вiрулентностi збудника туберкульозу потрiбно 1-3 "слiпиx" пасажiв через органiзм лабораторних тварин. При цьому не всi штами однаково вщновлюють свою вiрулентнiсть [3, 4]. Особливо актуальним це питання постае за циркуляци в стадах велико].' рогато].' худоби M. bovis швидкорослих штамiв [2, 5], оскiльки вони можуть володiти дещо вiдмiнними, вщ традицiйно вiдомиx патогенних мiкобактерiй, властивостями.
Метою нашо¥ роботи було вивчення бюлопчно' активностi та лiпiдного складу M. bovis швидкорослого штаму 3i втраченою вiрулентнiстю.
Матер1ал та методи дослщжень. Матерiалом для дослiджень були M. bovis швидкорослого штаму, яю збер^алися один рiк за температури +4 °С та культивувалися два роки за +37 °С з штервалом 2-4 мiсяцi на живильному середовищi ДП „Ветеринарна медицина".
У вихщно' та видiлениx в наступному культур мiкобактерiй вивчали культуральнi властивостк швидкiсть росту, характер та структуру колонш; морфологiчнi та тинкторiальнi властивоси.
Ступiнь вiрулентностi та сенсибiлiзуючу здатшсть визначали шляхом зараження двох морських свинок зависю збудника (1 мг/см3). Оцiнку специфiчниx туберкульозних змiн в органах тварин проводили за схемою М.С. Трiус [6]. Бiоматерiал, вщ евтаназованих через 3 мiсяцi свинок, обробляли методом А.П. Алжаево', а суспензш висiвали на живильне середовище 6-10 пробiрок. З метою поновлення вiрулентностi мiкобактерiй, проводили зараження морських свинок за загальноприйнятим методом [7], з наступним дослiдженням культурально-бiоxiмiчниx властивостей вихщно' (культура № 1) та видшених культур (№ 2 та 3) мжобактерш: рiст на середовищi iз салiцилатам натрiю за методом M. Tsukamura (1962); каталазну та пероксидазну активнiсть
© Ткаченко О.А., Бшан М.В., Глебенюк В.В., 2008
264
за методом Г.Н. Першин й ш. (1958); реакщю з акумуляцп 3ani3a за методом J. Scabo et al. (1963); стшюсть до 5 % хлористого натрш за методом Kestle et al. (1967); реакщю гiдролiзу ТВ1Н-80 за методом G. Wayne (1966); реакщю редукци нiтрaтiв за методом Tsukamura et al. (1966). Корд-фактор дослщжували на рiдкому середовищi Школьниково'
Лiпiдний склад дослiджувaли за методикою Фолча в модифшаци Блайя-Дайера пiсля накопичення бiомaси мшобактерш на середовищi ДП „Ветеринарна медицина" протягом 30 дiб за температури 37 0С.
Фрaкцiйний склад лшвдв вивчали методом тонкошарово! хроматографа (ТШХ) на пластинах Silufol (Чехiя) iз зaкрiпленим шаром силiкaгелю та подальшим кiлькiсним денситометруванням.
Анaлiз фракцп вшьних жирних кислот проводили за допомогою газорщинно1 хроматографа (ГРХ) на газовому хромaтогрaфi Chrom-5 (Чехiя) пiсля попереднього метилювання. На хроматограмах пiки щентиф^вали за допомогою стандартних сумiшей метилових ефiрiв жирних кислот i за часом !х утримання. Для кшькюно! оцiнки визначали площi пiкiв i розраховували вiдношення кожного пiку до суми компонент у вiдсоткaх [8].
Результати дослщжень. Пiсля тривалого зберiгaння та послiдуючого культивування M. bovis утворювали на живильному ДП „Ветеринарна медицина" видимi колонн на 3-4 добу у виглядi суцiльного росту по лшп посiву; при меншш концентрацп мiкробних тiл у виавному мaтерiaлi (0,1 мг/см3) - поодиною випуклi з гладенькою поверхнею, рiвними краями та блискучою поверхнею колонп. Через 30 дiб пiсля появи колонш спостерiгaвся перехiд остaннiх з S- у R-форму: колонп' опоясувала вузька матового кольору бахромка з ч^ко вираженими нерiвними краями (культура № 1). У мазках спостер^али червош палички розмiром 1-3 х 0,2 мкм з вираженою грaнуляцiею.
Введення мiкобaктерiй дослщжувано1 культури двом морським свинкам (№ 1 та 2) супроводжувалось сенсибiлiзaцiею щодо 1111Д-туберкулшу для ссaвцiв. У свинки № 2 через три тижнi, в дiлянцi шокуляци збудника утворився набряк-горбик щшьно1 консистенци розмiром 2 х 2 см, а в наступному виразка. Пiсля першо1 туберкулшзацп виразка почала загоюватись, i до 90 доби зникла повнiстю. На розтиш евтаназованих лабораторних тварин мaкроскопiчних пaтолого-aнaтомiчних змiн не знайдено. При бактерюлопчному дослiдженнi бiомaтерiaлу морсько1 свинки № 2 було видшено культуру № 2, а зi свинки № 1 - результат був негативний. Це можна пояснити недостатньою ефектившстю передпоЫвно1 обробки мaтерiaлу [9, 10] та низькими ростовими властивостями мжобактерш на штучних живильних середовищах [11].
Видшена культура на живильному середовищi почала формуватися на 6 добу, а в наступних генерaцiях на 2-3 добу. Колони були з рiвними краями та гладенькою поверхнею (S-форми). Культивування протягом 4 мюящв не призвело до змши форми колонш. Мшроскотчне дослiдження видшено1 культури показало наявшсть коротких товстих червоних паличок без грануляцп, розмiром 0,5-1 х 0,2 мкм.
265
Суспензieю бiоматерiалу морсько! свинки № 1 було заражено наступних свинок № 3 та 4. Обч^ дослщш тварини реагували на введення ППД-туберкулiну для ссавцiв, проте виразка на мшщ введення збудника була вщсутня. Тварини, яким вводили суспензiю загинули на 50-52 добу з характерними для туберкульозу патолого-анатомiчними змiнами (табл. 1).
Таблиця 1
В1рулентшсть та сенсибш1зуюч1 властивост1 М. Ъоу18 _швидкорослого штаму_
Морсью свинки, № Алерпчш дослщження, доба Строк загибел^ доба 1ндекс ураження
30 60 90
1 - + + - 0
2 + + + - 0
3 + - - 50 25
4 + - - 52 21
Як видно iз таблицi 1, пасажi через оргашзм морських свинок мiкобактерiй, яю втратили вiрулентнiсть, призводять до И поновлення.
З об'еднаного патматерiалу тварин № 3 та 4 було видшено мжобактери культури № 3, яю формували колони на 18 добу з часу виЫву суспензи. При цьому И культуральнi властивост , окрiм швидкостi росту, вщповщали культурi № 1.
Культурально-бiохiмiчнi властивостi всiх описаних культур були схожими: вони росли на середовищi iз салiцилатом натрш у концентрацп 0,5 мг/см3, не росли на середовищi з 5 % №С1, не редукували нiтрати, не гiдролiзували ТВ1Н-80, не акумулювали залiзо i володiли низькою каталазо-пероксидазною актившстю. Вивчення здатностi утворювати корд-фактор показало, що мжобактерп культур № 1 та 3 розмщуються у виглядi „кос" та „джгуив", тодi як № 2 - скупченнями по 3-5 кл^ин.
Дослiдження лiпiдного складу мжобактерш культур № 2 та 3 наведеш у таблицях 2-4.
Таблиця 2
Вмют загальних лшщ1в (% на наважку)
Культура, №
2 3
4,09±0,29 13,00±0,44
1з таблиц 2 видно, що кiлькiсть загальних лшвдв у мiкобактерiй культури № 2 майже у 3 рази нижча, шж культури № 3. Це свщчить про те, що мжобактери, тсля пасажування через оргашзм морських свинок, здатш поновлювати лшщний склад, який обумовлюе !х вiрулентнiсть.
Наступнi дослiдження засвiдчили, що фракци лiпiдiв знаходяться практично на одному рiвнi (табл. 3).
266
Таблиця 3
Фракцшний склад лш^в у M. bovis швидкорослого штаму _(ТШХ аналй, % вiд суми)_
Фракщя загальних ЛiПiДiB Культура, №
2 3
Фосфолшщи (полярнi лiпiди) 18,03±0,68 18,10±0,53
Диацилглiцероли 18,36±0,58 17,96±0,26
Стерини 16,72±0,67 16,82±0,35
Вшьш жирнi кислоти 17,05±0,57 16,98±0,59
Триацилглiцероли 15,74±0,53 15,93±0,68
Ефiри стеришв 14,09±0,48 14,21±0,64
X лiпiдiв 100 100
Мiж тим, вмют окремих вшьних жирних кислот у мiкобактерiй культури № 2 суттево вiдрiзнявся вщ таких культури № 3. Встановлено, що у мiкобактерiй культури № 2 сума насичених жирних кислот у 3,3 рази переважала кшьюсть ненасичених та у 1,8 рази у мшобактерш культури № 3, за рахунок бегеново! (15,79 %), лауриново!, миристиново!, пентадеканово!, маргариново!, нонадеканово!, арахшово!, генейкозаново!, трикозаново!, тетракозаново!, пентакозаново! та значно! кiлькостi насичено! неiдентифiковано! (26,81 %) кислот. Серед ненасичених жирних кислот виявлено у 1,9 рази бшьше лшолево! з лiноленовою кислот, шж у мiкобактерiй культури № 3.У мшобактерш культури № 3 видшено у 1,3 рази менше вiльних жирних кислот, на вiдмiну вiд таких культури № 2. Серед насичених жирних кислот переважали пальмггинова (21,14 проти 17,59 %) та стеаринова (9,94 проти 2,85 %), а лауринова, тридеканова, маргаринова, арахшова - зус^чались у виглядi сл^щв. Проте, у M. bovis ще! культури бшьше (у 2,4 рази) ненасичених жирних кислот, шж у мшобактерш культури № 2. Це обумовлено великою кшьюстю оле!ново! та пальмгголе!ново! кислот (54,38 проти 12,16 %; 2,28 проти 1,36 %).
Водночас у мiкобактерiй обох культур (№ 2 та 3) сума коротколанцюгових жирних кислот (С12:0 - С2о:о) переважала над довголанцюговими (С21:0 - С25:0) - у 4 та 8,2 рази вщповщно.
267
Таблиця 4
Вмкт вшьних жирних кислот у M. bovis швидкорослого штаму _ (ГРХ-анашз, % вщ суми)_
Вiльна жирна кислота Код Культура, №
2 3
Лауринова С12:0 0,03±0,01 слiди
Тридеканова С13:0 слiди слiди
Миристинова С14:0 1,36±0,07 0,47±0,10
Пентадеканова С15:0 1,16±0,18 0,16±0,08
альмiтолеiнова С16:1 1,36±0,06 2,28±0,33
Нещентифшована Сх 26,81±0,093 -
Пальмiтинова С16:0 17,59±0,66 21,14±0,56
Маргаринова С17:0 4,37±0,64 слiди
Олеiнова С18:1 12,16±0,58 54,38±0,99
Стеаринова С18:0 2,85±0,29 9,94±0,49
Лшолева+лшоленова С18:2 + С18:3 9,83±0,67 5,22±0,07
Нонадеканова С19:0 2,36±0,35 0,54±0,05
Арахiнова С20:0 0,13±0,04 слщи
Генейкозанова С21:0 0,78±0,08 0,54±0,08
Бегенова С22:0 15,79±0,68 8,13±0,43
Трикозанова С23:0 0,49±0,11 0,23±0,08
Тетракозанова С24:0 0,34±0,05 0,08±0,06
Пентакозанова С25:0 2,59±0,52 1,89±0,59
£ ненасичених £ насичених 23,35±0,72 56,88±0,73
76,65±0,88 43,12±0,59
Примпка: СА:0 - насичена жирна кислота (А - кшьюсть атомш вуглецю);
CA:N - ненасичена жирна кислота (N - кшьюсть подвшних зв'язкш);
Сх - неiдентифiкована жирна кислота
Отже, тривале збер^ання M. bovis швидкорослого штаму вплинуло на кшьюсть загальних лiпiдiв та вшьних жирних кислот, рiвень вмiсту яких досить легко поновлюеться за пасажу через органiзм тварин, зокрема морських свинок.
Висновки: M. bovis швидкорослого штаму володшть, за стабшьност бiохiмiчних властивостей, високою здатнiстю поновлювати втрачену ступiнь вiрулентностi. У M. bovis дослiджуваного штаму, за пасажування через органiзм морських свинок, вщбуваеться збiльшення у 3 рази вмюту загальних лiпiдiв за стабшьного спiввiдношення фракцiй лiпiдiв. Серед вшьних жирних кислот мжобактерш спостер^аеться змiна вмiсту у бiк тдвищення ненасичених кислот та зменшення насичених.
268
Лггература
1. Бокун А. О. Биологическая активность микобактерий туберкулеза в эпизоотическом инфекционном процессе // Проблемы туберкулеза. - 1989. -№1. - С. 51-54.
2. Зеленська М.В. Лшщний склад та вiрулентнiсть Mycobacterium bovis, видшених ввд велико! рогато! худоби степово! зони Укра!ни: Дис. ... канд. вет. наук: 16.00.03. - Одеса, 2006. - 164 с.
3. Юсковец М.К. Туберкулез сельскохозяйственных животных. - М.: Государственное издательство сельскохозяйственной литературы, 1953. -334 с.
4. Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулёза и атипичные микобактерии. - Будапешт: Академия наук Венгрии, 1975. - 334 с.
5. Ткаченко О. Швидкоростучi M. bovis у проблемi туберкульозу // Ветеринарна медицина Укра!ни. - 2004. - № 7. - С. 14-17.
6. Ященко Т.Н., Мечева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулёзе. - М.: Медицина, 1973. - 260 с.
7. Настанова по дiагностицi туберкульозу / В.М.Манченко, З.Р. Троценко, М.С.Павленко та ш. - Ки!в, 1994. - №9. - 25 с.
8. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. - М.: Мир, 1975. - 322 с.
9. Косенко В.И., Кадочкин А.М., Тажгалиев Н.М. Влияние обработки патологического материала на высеваемость микобактерий туберкулёза // Ветеринария. - 1984. - №5. - С. 67 - 68.
10. Обогащение биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулёз / В.А.Матузенко, В.А.Бусол, А.А.Ткаченко и др. // Ветеринария. - 1993. - №9. - С. 32 - 34.
11. Боганец Н.С. Эффективность питательных сред в диагностике туберкулёза // Ветеринария. - 2006. - №3. - С. 28 - 30.
Summary
Tkachenko O.A., Bilan M.V., Glebenjuk V.V. INFLUENCE OF PASSAGING THROUGH A GUINEA PIGS ON THE BIOLOGICAL ACTIVITY AND LIPIDS COMPOSITION THE M. BOVIS
QUICKLY GROWING STRAIN
They are brought results passaging M bovis quickly growing strain through the organism guinea pigs. Mycobacterium have the temple by ability, at stabilities biochemical characteristic, high ability at stabilities biochemical characteristic,владеют the temple by ability, at stabilities biochemical characteristic, change by biochemical composition.
Стаття надшшла до редакцИ 15.03.2008
269
