CC BY
98
УДК 577.29
Липид-белковые нанодиски: новые возможности для структурнофункциональных исследований водорастворимых мембраноактивных пептидов
З. О. Шенкарев1*, Е. Н. Люкманова1, А. С. Парамонов1, П. В. Пантелеев1, С. В. Баландин1,
М. А. Шулепко12, К. С. Минеев1, Т. В. Овчинникова1,3, М. П. Кирпичников1,2, A. С. Арсеньев1,3 1Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119234, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
3Московский физико-технический институт (государственный университет), 141700,
Долгопрудный Московской обл., Институтский пер., 9
*E-mail: zakhar-shenkarev@yandex.ru
Поступила в редакцию 07.10.2013
После доработки 19.03.2014
РЕФЕРАТ Липид-белковые нанодиски (ЛБН) представляют собой наноразмерные частицы, содержащие фрагмент бислойной липидной мембраны, стабилизированный в растворе молекулами аполипопротеина или специальным белком MSP. В представленной работе изучена возможность применения мембраномоделирующих сред на основе ЛБН для исследования водорастворимых пептидов, обладающих сродством к липидным мембранам. Показано, что порообразующий антимикробный пептид ареницин-2 из морского пескожила (заряд +6) вызывает разрушение ЛБН, содержащих как цвиттер-ионные молекулы фосфати-дилхолина (PC), так и анионные молекулы фосфатидилглицерина (PG). Напротив, токсин паука VSTxl (заряд +3), блокирующий потенциал-зависимую активацию К+-каналов, эффективно взаимодействует с ЛБН, содержащими анионные липиды (POPC/DOPG, 3 : 1), не вызывая их разрушения. VSTxl имеет меньшее сродство к ЛБН, содержащим цвиттер-ионные липиды (POPC), и слабо взаимодействует с белковой компонентой нанодисков - MSP (заряд -6). Нейротоксин II из яда кобры (NTII, заряд +4), ингибитор никотинового ацетилхолинового рецептора, имеет сравнительно небольшое сродство к ЛБН, содержащим анионные липиды (POPC/DOPG, 3 : 1 и POPC/DOPS, 4 : 1), и не связывается с ЛБН/POPC. Показано, что NTII взаимодействует с поверхностью ЛБН/POPC/DOPS в нескольких ориентациях, и обменные процессы между комплексами с различной топологией идут быстро по шкале ЯМР. Только одна из возможных ориентаций NTII допускает описанное ранее специфическое взаимодействие с полярной головкой фосфа-тидилсерина из мембранного окружения рецептора. Показано, что ЛБН могут применяться в структурнофункциональных исследованиях водорастворимых мембраноактивных нейротоксинов, а также для изучения механизма взаимодействия пептидных молекул с липидной мембраной.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА антимикробные пептиды, липид-белковые нанодиски, липопротеиновые частицы высокой плотности, мембраноактивные пептиды, мембраномоделирующие среды, нейротоксины, ЯМР-спектроскопия.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 -DSA - 5-доксилстеариновая кислота; Ar2 - ареницин-2 из морского пескожила Arenicola marina; DLPC - дилауроилфосфатидилхолин; DLPG - дилауроилфосфатидилглицерин; DOPG - диолеоилфосфатидилглицерин; DOPS - диолеоилфосфатидилсерин; MSP - фрагмент 44-243 аполипопротеина A1 человека (membrane scaffold protein); NTII - нейротоксин II из яда кобры Naja oxiana; POPC - пальмитоилолеоилфосфатидилхолин; POPE - пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин; POPG - пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин; RH - гидродинамический радиус частицы, радиус Стокса; TROSY - transverse relaxation-optimized spectroscopy; TRX - тиоредоксин из Escherichia coli; VSTx1 -
«вольт-сенсорный» токсин из яда паука Grammostola spatulata; АМП - антимикробный мембраноактивный пептид; ЛБН - липид-белковый нанодиск; МП - мембраноактивный пептид; пх.у - скорость процесса кросскорреляции между диполь-дипольной релаксацией и релаксацией, возникающей благодаря анизотропии химического сдвига ядра 15^ тк - эффективное время корреляции вращательных движений.
ВВЕДЕНИЕ
Мембраноактивные пептиды (МП) представляют собой класс биомолекул, играющих важную роль в существовании отдельных организмов и их сообществ. Например, антимикробные мембраноактивные пептиды (АМП), селективно действующие на мембраны различных клеток, - одни из основных эффекторов в системе «врожденного иммунитета» - древнейшей защитной системе эукариотических организмов [1]. Некоторые пептидные медиаторы нервной и эндокринной систем организма и ряд токсинов животного происхождения, нацеленных на рецепторы клеточной мембраны, также обладают мембранной активностью и действуют в несколько этапов, изначально связываясь с мембраной, окружающей рецептор, и только потом образуя лиганд-рецепторный комплекс [2, 3]. В этом случае реализуются механизмы так называемого «мембранного катализа», которые значительно увеличивают эффективность взаимодействия лиганд-рецептор [3].
Сложность исследования мембраноактивных пептидов связана с особенностями их пространственной организации. Из-за гидрофобных свойств и большой конформационной подвижности многие МП формируют «активную» пространственную структуру только в присутствии биологической мембраны или подходящей мембраномоделирующей среды (мембранного миметика). Эти факторы значительно затрудняют кристаллизацию МП и обусловливают необходимость использования альтернативных методов исследования. Одним из таких методов является ЯМР-спектроскопия высокого разрешения, которая позволяет изучать пространственную структуру и внутримолекулярную динамику МП в растворе мембраномоделирующих сред [4, 5]. Традиционно используемые мембранные миметики имеют ряд недостатков, которые ограничивают их применение для изучения специфических взаимодействий пептид-мембрана. Так, большая кривизна поверхности и рыхлая упаковка сред на основе детергентов (в форме мицелл или небольших смешанных бицелл с липидами) может приводить к значительным искажениям структуры пептида [6] и к появлению неспецифических взаимодействий пептид-детергент. В то же время среды, содержащие реальные бислойные мембраны в виде липидных везикул или липид/детергентных бицелл, обладают слишком большими размерами и не мо-
гут напрямую использоваться для структурнодинамических исследований МП методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения [4, 7].
Липид-белковые нанодиски (ЛБН), или реконструированные незрелые липопротеиновые частицы высокой плотности, представляют собой наноразмерные дискоидные частицы (обычно 10 х 4 нм), содержащие фрагмент бислойной липидной мембраны (~150 молекул липида), гидрофобная часть которого экранирована от растворителя двумя молекулами апо-липопротеина или его синтетического аналога MSP (membrane scaffold protein) [8]. В отличие от традиционно используемых мембранных миметиков, фрагмент липидной мембраны в составе липид-белкового нанодиска обладает повышенной стабильностью и сохраняет многие биофизические свойства, присущие настоящим мембранным системам, например фазовый переход из жидкокристаллического в гелевое состояние [9]. Недавно в ряде работ было показано, что ЛБН могут выступать в качестве альтернативной мембраномоделирующей среды для структурнофункциональных исследований мембранных белков и гидрофобных (слаборастворимых) МП [10-16], в том числе методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения [12-15]. Использование ЛБН, содержащих различные липиды и их смеси, позволяет изучать различные аспекты функционирования мембранных белков и МП [15, 16].
Вопрос о применимости мембраномоделирующих сред на основе ЛБН в структурных и биофизических исследованиях водорастворимых МП ранее не изучали. Следует отметить, что это не тривиальный вопрос, так как ЛБН, в отличие от везикул, бицелл и мицелл, содержат дополнительную компоненту - MSP, которая является анионным белком (заряд -6). В данной работе взаимодействие водорастворимых МП с ЛБН изучали на примере трех модельных катионных Р-структурных пептидов (рис. 1), которые имеют различные физикохимические свойства и представляют три класса мембраноактивных соединений. Антимикробный пептид ареницин-2 (Ar2, 21 а.о., 2772 Да, заряд + 6, средний индекс гидрофобности по шкале Kyte и Doolittle [17] —0.061) из целомоцитов морского мно-гощетинкового червя Arenicola marina селективно
1 Максимальное и минимальное значения индекса гидрофобности по шкале Kyte и Doolittle [17] равны +4.5 и —4.5 для poly-Ile- и polyArg-последовательностей соответственно.
взаимодействует с мембранами, содержащими отрицательно заряженные липидные молекулы, и образует в них олигомерные поры [18]. Токсин VSTx1 (34 а.о., 4010 Да, заряд +3, индекс гидрофобности -0.27) из яда паука Grammostola spatulata использует механизм «мембранного катализа» для взаимодействия с потенциал-чувствительными доменами К+-каналов, локализованными в клеточной мембране, и при этом не обладает способностью к порообразованию [3]. Нейротоксин II (ЫТП, 61 а.о., 6885 Да, заряд +4, индекс гидрофобности -1.10) из яда кобры Naja ох1апа блокирует активацию никотинового аце-тилхолинового рецептора, связываясь с его внеклеточным доменом, но, возможно, также использует механизм «мембранного катализа», взаимодействуя с полярными головками фосфатидилсерина (PS) из мембранного окружения рецептора [19]. Выбранные в качестве объектов исследования пептиды растворимы в воде в миллимолярных концентрациях, однако, они значительно отличаются друг от друга по своим гидрофобным/гидрофильным свойствам. Так, несмотря на большой положительный заряд, Аг2 является наиболее гидрофобным из исследуемых пептидов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реконструкция и очистка ЛБН
В качестве белка MSP в работе использовали рекомбинантный фрагмент 44-243 аполипопротеина A1 человека, содержащий на N-конце последовательность из шести остатков His. Очищенный белок MSP, полученный как описано в [20], смешивали в молярном соотношении 1 : 75 с липидами в присутствии детергента холата натрия (молярное соотношение холат/липиды 2 : 1) и инкубировали смесь в течение 3 ч при 4°С. При использовании насыщенных липидов (DLPC, DLPG) температуру реакции поддерживали не ниже 25°С. Самопроизвольную сборку ЛБН инициировали путем сорбции детергента на смолу Bio-Beads™ (Bio-Rad, США) в течение 1.5 ч. Очистку нанодисков производили на металлоаффинной смоле Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, США), уравновешенной буфером А (20 мМ Трис-HCl, 0.5 М NaCl, 1 мМ NaN3, pH 8.0). После нанесения реакционной смеси смолу промывали пятикратным объемом буфера А. Элюцию ЛБН проводили буфером А, содержащим 100 мМ имидазола. Концентрацию MSP определяли спектрофотометрически по поглоще-
Липид-белковый нанодиск (ЛБН) Ареницин-2 (Ar2) VSTx1
N
4 нм
1
Г
ю
—і
20
Нейротоксин II (NTII)
Ai2 v; vwr.' : ^V!.V у v;
1 І І10 I 1 20І I 30
vsTxi v, -.'W ';:л: :,v w w vi ал
1 г
. 10 I 20 I 30 40 I 50 I I 160
NTII !. '',f- -r' r v т ;.т;
Петля I
Петля II
Петля III
Рис. 1. Схема строения липид-белкового нанодиска и аминокислотные последовательности и пространственные структуры ареницина-2, VSTx1 и (PDB-коды 2JNI, 1S6X и 1NOR соответственно). Две молекулы MSP, экранирующие фрагмент фосфолипидной мембраны нанодиска от растворителя, показаны в виде тора. На последовательностях пептидов цветом показаны заряженные остатки и остатки Cys. В работе использовали рекомбинантный аналог VSTx1, дополнительно содержащий остатки Gly-Ser на Оконце (показаны серым цветом)
ТОМ б № 2 (2l) 20l4 | ACTA NATURAE | 93
нию при к = 280 нм. Концентрацию ЛБН определяли, предполагая, что каждый нанодиск содержит две молекулы MSP.
Гель-фильтрация
Гель-фильтрацию с разделением частиц по размеру проводили на смоле Superdex-200, на колонке Tricorn 5/200 (GE Healt^a^, Швеция) в буфере (10 мМ Tрис-HCl, 0.1 М NaCl, 1 мМ ЕDТА, 1 мМ NaN3, pH 7.4). В качестве калибровочных белков использовали тироглобулин (669 кДа, радиус Стокса RH = 8.5 нм), ферритин (440 кДа, RH = 6.1 нм), каталазу (232 кДа, RH = 5.22 нм), альдолазу (158 кДа, RH = 4.81 нм), БСА (67 кДа, RH = 3.55 нм), овальбумин (43 кДа, RH = 3.05 нм). Скорость потока через колонку - 0.3 мл/мин, детектирование производили на длине волны 280 нм. Размер частиц определяли по калибровочной кривой зависимости объема элюции от lgRH. Все приведенные ниже значения размера (диаметра) частиц соответствуют удвоенным значениям RH.
Получение рекомбинантного аналога Ar2
Рекомбинантный аналог ареницина-2, по аминокислотной последовательности полностью соответствующий природному пептиду, получен согласно протоколам [18, 21].
Продукция и очистка VSTx1
В работе использовали стандартные генноинженерные методики. Ген VSTxl получен с помощью ПЦР с шестью перекрывающимися синтетическими олигонуклеотидами (ЗАО «Евроген», Москва), оптимизированными по редким в Escherichia coli кодонам. Ген VSTxl был клонирован в вектор pET-32a(+) (Novagen) по сайтам KpnI и BamHI в единой рамке считывания с геном тиоредоксина (TRX). Затем последовательность, кодирующую сайт гидролиза гибридного белка энтерокиназой, предусмотренную в векторе pET-32a(+), заменили на последовательность, кодирующую сайт гидролиза тромбином. Полученную плазмиду назвали pET/TRX-VSTxl.
Клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали рекомбинантным вектором pET/TRX-VSTxl и рассе-вали на чашки Петри с LB-агаром (10 г бактотрипто-на, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 л среды, рН 7.4) и ампициллином (100 мг/л). Колонии с чашки переносили в питательную среду TB (12 г бакто-триптона, 24 г дрожжевого экстракта, 4 мл глицерина, 2.3 г КН^О^ 12.5 г K2HPO4 на 1 л среды, рН 7.4), содержащую ампициллин (100 мг/л), культивировали при 37°С с умеренным перемешиванием до достижения оптической плотности 0.6 о.е. Индуцировали транскрипцию гена TRX-VSTxl добавлением изопропил-P-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ)
до конечной концентрации 0.025 мМ и продолжали культивирование клеточной культуры в среде TB при 37°С в течение ночи.
Клеточную культуру центрифугировали (20 мин, 8000 об/мин, 4°C). Клеточный осадок с 1 л культуры ресуспендировали в буфере А. Клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (Branson Digital Sonifier) по 10 с с 12-кратным повтором. Лизат центрифугировали в течение 30 мин при 30000 g, далее отбирали надосадочную жидкость. Лизат очищали на металлоаффинной смоле, уравновешенной буфером А. После нанесения препарата белка колонку промывали последовательно трехкратными объемами: буфера А и буфера А, содержащего 50 мМ ими-дазола. TRX-VSTxl элюировали буфером А, содержащим 150 мМ имидазола. После очистки проводили специфический гидролиз гибридного белка тромбином. Препарат VSTxl выделяли с помощью вычитающей металлоаффинной хроматографии. Для окончательной очистки препарата VSTxl применяли ВЭЖХ на обращенной фазе (колонка С4, 4.6 х 250 мм, A300, Jupiter, Phenomenex). Выход токсина составил 1 мг/л бактериальной культуры. В отличие от природного токсина, рекомбинантный аналог VSTxl содержал на N-конце дополнительные остатки Gly-Ser, возникающие в результате гидролиза тромбином. Идентичность молекулярной массы рекомбинантного токсина расчетному значению подтверждена с помощью масс-спектрометрии.
Получение NTII и его Ш/^-меченого варианта Препарат рекомбинантного нейротоксина II был получен согласно [22]. ^/^-меченый препарат NTII получали следующим образом. Клетки BL21(DE3), трансформированные вектором pET-22b(+)/STII/NTII
[22], рассевали на чашки Петри с LB-агаром и ампициллином (100 мг/л). Колонии с чашки инокулиро-вали в 10 мл среды LB и культивировали при 37°С в течение 1 ч. Затем к клеткам каждый час добавляли по 10 мл среды LB, приготовленной на дейтерирован-ной воде (2H2O, 99% дейтерия), до тех пор, пока общий объем среды не достиг 110 мл. В этих условиях культивирование продолжили в течение ночи. После этого в стерильных условиях собирали клеточный осадок и ресуспендировали его в 1 л минимальной среды М9 (6 г Na2HPO4, 3 г KH2PO4, 0.5 г NaCl, 2 г l5NH4Cl, 240 мг безводного MgSO4, 11 мг CaCl2, 4 мл глицерина, 2 мг дрожжевого экстракта, 200 мкл 5% тиаминхлорида на 1 л среды, рН 7.4), приготовленной на 2H2O. Клетки инкубировали при 37°С до достижения культурой оптической плотности, равной 0.6 о.е. Транскрипцию гена stII-ntII индуцировали ИПТГ, который добавляли до конечной концентрации 0.05 мМ, и продолжали культивировать клеточную культуру в течение 1 сут.
Выделение и очистку 2Н,15П-ПТИ осуществляли согласно [22].
ЯМР-спектроскопия
ЯМР-спектры получали при температуре 40-45°С на спектрометрах AVANCE-700 и AVANCE-Ш-800 (Вгикег, Германия), укомплектованных датчиками с криогенно охлаждаемой 1Н-катушкой, с рабочей частотой по протонам 700 и 800 МГц соответственно.
Для измерения изотерм связывания токсинов с ЛБН и молекулами MSP образцы VSTx1 и ПТ11 (20 мкМ, 10 мМ Трис-Ас, pH 7.0) титровали раствором нанодисков (70 мкМ) различного липидного состава или раствором MSP (0.7 мМ). В каждой точке измеряли Ш 1Н-ЯМР-спектр. Анализ данных проводили, предполагая, что интенсивность наблюдаемых ЯМР-сигналов пептида пропорциональна его равновесной концентрации в растворе ([Р]^). Кривые связывания аппроксимировали либо уравнением равновесного распределения (1), либо с помощью изотермы Ленг-мюра (2), учитывая разведение исходных образцов при титровании:
[Р],
-----а®*------К -[PL
[ЛБН/Липид] р free’
1 [Р]^-(»-[ЛБН]-[Р]^),
Кп [р]м
(1)
(2)
где [ЛБН/Липид] - концентрация ЛБН (в предположении, что один нанодиск содержит две молекулы MSP) или концентрация липидов (в предположении, что один нанодиск содержит 150 молекул липида), [Р]Ьоип; - концентрация пептида, связанного с ЛБН ([Р]0 = [Р\гее + [Р]^™;), Кр - коэффициент распределения, п - число сайтов связывания пептида на поверхности нанодиска, К - константа формирования комплекса пептид-сайт связывания.
Взаимодействие ПТ11 с ЛБН изучали с использованием образца, содержащего 45 мкМ 2Н,15П-ПТ11 и 75 мкМ ЛБН/POPC/DOPS (4 : 1) (10 мМ Трис-Ас, pH 7.0). Для идентификации ПН-групп пептида, сближенных с поверхностью нанодиска, в 2D 15^1Н-TROSY-спектрах наблюдали изменения интенсивностей кросс-пиков ПТ11 при преднасыщении холи-новой группы липида РОРС. Сигнал (СН3)3№-группы (химический сдвиг - 3.2 м.д.) насыщали на мощности 125 Гц в течение 0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0, 1.5 и 3.0 с, используя задержку на релаксацию, равную 3 с. Для идентификации ПН-групп пептида, сближенных с гидрофобным регионом мембраны нанодиска, к образцу ПТ11 в комплексе с ЛБН/POPС/DOPS добавляли 5-доксилстеариновую кислоту (5-DSA), растворен-
ную в небольшом количестве метанола, до конечной концентрации 10, 30 и 75 мкМ. Ослабление интенсивности сигналов ПТ11, возникающее за счет парамагнитного усиления релаксации ядер :Н и 15П, наблюдали в 2D 15N,1H-TROSY-спектрах. Скорости процесса кросс-корреляции между диполь-дипольной релаксацией и релаксацией, возникающей из-за анизотропии химического сдвига ядра, 15П (пэт) измеряли для комплексов ПТ11 с ЛБН/POPС/DOPS при температуре 40°С на спектрометре AVANСE-Ш-800, используя эксперименты на основе 2D 15N,1H-TROSY
[23]. Время корреляции вращательных движений (тг) для HN-групп пептида было рассчитано из измеренных значений пхг
результаты и обсуждение
Взаимодействие ареницина-2 с нанодисками
Катионный АМП Аг2 содержит в основном положительно заряженные и гидрофобные остатки и в воде имеет структуру Р-шпильки, стабилизированной одной дисульфидной связью (рис. 1) [21]. Ареницин-2 селективно взаимодействует с мембранами, содержащими отрицательно заряженные молекулы липидов, и образует в них олигомерные поры, сформированные с участием фосфолипидов (так называемые тороидальные поры) [18]. В больших концентрациях Аг2, вероятно, приводит к мицеллизации бислоя [24]. Как предполагается, в составе поры Р-шпильки индивидуальных пептидов имеют трансмембранную ориентацию, так что N и С-концевые фрагменты и регион Р-поворота контактируют с полярными регионами на наружной и внутренней сторонах мембраны [18].
С целью изучения возможности получения стабильных комплексов Аг2 с ЛБН использовали нанодиски, содержащие нейтральные (РОРС) и анионные (DOPG) «длинноцепочечные» липиды. Ранее методом КД-спектроскопии было показано, что Аг2 не взаимодействует с везикулами, сформированными из РОРС, и с высокой аффинностью связывается с липосомами на основе DOPG [18, 21]. Для моделирования возможного перехода Р-шпильки Аг2 (длина ~ 3.5 нм) в трансмембранное состояние использовали смесь «короткоцепочечных» липидов различного заряда (DLPС/ DLPG = 4 : 1, жирнокислотные цепи длиной 12 атомов углерода, расстояние между фосфатными группами на противоположных сторонах мембраны ~ 3.4 против ~ 3.7 нм у длинноцепочечных липидов [25]). Ранее ЛБН на основе смеси DLPС/DLPG использовали для наблюдения переходов между поверхностно-связанным и трансмембранным состоянием пептидного каналообразующего антибиотика антиамебина I [15].
В ходе исследования водный раствор Аг2 добавляли к образцам нанодисков. Во всех случаях, даже
Объем элюции, мл
Рис. 2. Гель-фильтрационный анализ препаратов ЛБН после добавления мембраноактивных пептидов и анализ изотерм связывания VSTx1 с ЛБН и MSP. А - на хроматограммах показано положение пиков, соответствующее нанодискам, агрегатам MSP, и VSTx1. Б - взаимодействие VSTx1 с ЛБН/РОРС. Показаны фрагменты Ю 1Н-спектров 20 мкМ VSTx1, измеренных при различных концентрациях ЛБН. В - изотермы связывания VSTx1 с ЛБН и MSP, аппроксимированные уравнением равновесного распределения (уравнение (1), пунктирные линии) и уравнением Ленгмюра (уравнение (2), сплошные линии). Полученные параметры приведены в таблице
при добавлении малых концентраций пептида, растворы ЛБН сильно опалесцировали, а при эквимо-лярных концентрациях (Аг2/ЛБН = 1 : 1) и выше растворы мутнели, что указывало на разрушение нанодисков с образованием более крупных частиц. Анализ супернатанта препаратов с помощью гель-фильтрации подтвердил это предположение. В образцах выявлены большие комплексы, имеющие характерные размеры ~ 15 нм, остаточная фракция ЛБН диаметром ~ 10-11 нм, а также небольшое количество частиц диаметром ~ 6 нм (рис. 2А). Сравнение с результатами предыдущих исследований [20, 26] позволило предположить, что эти частицы представляют собой агрегаты белка MSP. По-видимому, Ar2 вызывает слияние нанодисков, сопровождаемое высвобождением молекул MSP. Сходный процесс известен как ремоделирование липопротеинов высокой плотности (lipoprotein remodeling), которое может происходить как in vitro, так и in vivo при взаимодействии липопротеиновых частиц с липофильными белками плазмы крови [27]. Ранее слияние нанодисков наблюдали в бесклеточных системах биосинтеза белка при котрансляционном встраивании мембранных белков в ЛБН, содержащие ненасыщенные липиды [26]. Процессы самопроизвольного слияния ЛБН in vitro идут чрезвычайно медленно, но они значительно ускоряются в денатурирующих условиях [28].
Для периферической стабилизации фрагмента мембраны молекулы MSP, обладающие амфифиль-ными свойствами, должны вносить в липидный бислой значительную положительную спонтанную кривизну. Аналогичное влияние на спонтанную кривизну
бислоя оказывают многие амфифильные мембраноактивные пептиды, в частности АМП, чье действие опосредовано формированием «тороидальных» пор -регионов с большой положительной кривизной [29], или мицеллизацией бислоя. Аг2 не взаимодействует с липосомами на основе РОРС [21], поэтому мы можем предположить, что слияние нанодисков, наблюдаемое в случае ЛБН/РОРС, не связано напрямую с по-рообразующей активностью пептида, а вызвано его присоединением к периферическому участку фрагмента липидной мембраны ЛБН. Присоединенные молекулы Аг2 смещают отдельные участки белка MSP, что приводит к образованию дефектов в структуре ЛБН и слиянию нанодисков с образованием липопротеиновых частиц, содержащих большие фос-фолипидные домены, и высвобождению свободных молекул MSP. В случае ЛБН, содержащих анионные липиды, может быть предложен альтернативный механизм формирования дефектов в структуре ЛБН, обусловленный способностью Аг2 взаимодействовать непосредственно с мембраной нанодиска.
Учитывая, что механизмы, связанные с изменением локальной кривизны липидного бислоя (образование «тороидальных» пор, мицеллизация бислоя), лежат в основе действия подавляющего большинства водорастворимых катионных АМП, мы можем предположить, что многие из этих молекул будут обладать разрушающим действием на ЛБН. Таким образом, нанодиски, вероятно, не подходят в качестве среды для исследования подобных пептидов. Следует отметить, что существуют другие классы поро- и каналообразующих биомолекул, которые могут изу-
чаться в средах на основе ЛБН. Так, описано формирование стабильных комплексов ЛБН с гидрофобным каналообразующим антибиотиком антиамебином I (верхний предел растворимости в воде 30 мкМ) [12, 15, 20], а также успешное встраивание в нанодиски интегральных мембранных белков, образующих ионные каналы и поры, таких, как К+-канал KcsA [20], никотиновый ацетилхолиновый рецептор [30], поро-образующий компонент токсина сибирской язвы [11], и ряда белков, имеющих структуру Р-бочонка [14].
Взаимодействие токсина VSTx1 с нанодисками и белком MSP
Токсин VSTx1 - небольшой Р-структурный пептид, стабилизированный тремя дисульфидными связями, образующими «цистеиновый узел» (рис. 1) [31]. VSTx1 слабо взаимодействует с мембранами на основе цвиттер-ионных липидов, имеет значительное сродство к интерфейсу фосфолипидных мембран, содержащих анионные липиды, и при этом не обладает мембранолитической активностью [31]. Согласно современным данным, VSTx1 ингибирует потенциалзависимую активацию К+-каналов и при образовании комплекса с потенциал-чувствительным доменом канала использует механизмы «мембранного катализа» [3]. Активность токсина значительно зависит от липидного состава и механического состояния бислойной мембраны, окружающей канал [32].
Ранее для исследования взаимодействия VSTx1 с липосомами использовали смесь фосфолипидов на основе цвиттер-ионного фосфатидилэтаноламина и анионного фосфатидилглицерина (POPE/POPG, 3 : 1) [3]. Однако формирование ЛБН, содержащих значительную фракцию фосфатидилэтаноламина, малоэффективно, вероятно, из-за высокой отрицательной спонтанной кривизны образуемого бислоя [20, 33]. Поэтому для оценки энергетики взаимодействия токсина VSTx1 с мембранами ЛБН использовали нанодиски, содержащие цвиттер-ионный фосфатидилхолин и анионный фосфатидилглице-рин (РОРС и смесь POPС/DOPG, 3 : 1). Для оценки вклада неспецифических взаимодействий, обусловленных присутствием в ЛБН белковой компоненты, использовали препарат MSP, не содержащий липиды. Титрование образца VSTx1 раствором ЛБН либо раствором белка MSP, который в водном окружении образует сравнительно большие агрегаты (диаметр ~ 6 нм), приводило к постепенному уменьшению интенсивности ЯМР-сигналов пептида (рис. 2Б), что указывало на ассоциацию VSTx1 с поверхностью нанодисков или молекулами MSP. В этом случае из-за медленной реориентации нанодисков и агрегатов MSP в растворе связывание пептида вело к значительному увеличению ширины ЯМР-линий и умень-
шению интенсивности сигналов. Расчеты показали, что в условиях эксперимента с хорошей точностью можно использовать предположение о том, что интенсивность наблюдаемого сигнала ЯМР прямо пропорциональна равновесной концентрации свободного пептида в растворе ([VSTx1]f).
Анализ измеренных кривых связывания с помощью уравнения равновесного распределения (уравнение 1, рис. 2В, таблица) показал, что VSTx1 эффективно взаимодействует с ЛБН, содержащими анионные липиды (смесь POPС/DOPG), и менее эффективно взаимодействует с нанодисками на основе цвиттер-ионных липидов (РОРС). Рассчитанные коэффициенты распределения (Кр ~ 17.8 х 103 и 2.6 х 103 М-1 соответственно) значительно превышали значения, наблюдаемые ранее для везикул POPE/POPG (3 : 1) и РОРС (Кр ~ 2 х 103 и < 0.002 х 103 М-1 соответственно) [3, 31]. Эти различия в аффинности токсина могут быть обусловлены как отличиями в упаковке молекул фосфолипидов в мембранах ЛБН и везикулах [34], так и использованием в экспериментах различных буферных систем. В работах [3, 31] связывание токсина изучали в буферах, содержащих 150 мМ КС1 и ПаС1 соответственно, в то время как в нашей работе использовали буфер без добавления соли. Увеличение ионной силы раствора, приводящее к частичному экранированию электростатических взаимодействий, вероятно, уменьшает сродство VSTx1 к липидным мембранам. Наблюдаемое слабое взаимодействие VSTx1 с белком MSP (рис. 2В, таблица), по-видимому, обусловленное электростатическим взаимодействием между положительно заряженной молекулой токсина и анионной молекулой MSP, также может выступать в роли дополнительного фактора, усиливающего аффинность токсина к ЛБН.
Анализ кривых связывания с помощью изотермы Ленгмюра (уравнение (2), рис. 2В, таблица) позволил установить, что VSTx1 имеет примерно одинаковую аффинность к сайтам на поверхности нанодиска или на молекуле MSP (Кп ~ 0.05 х 106 - 0.13 х 106 М-1, таблица), однако, число сайтов связывания значительно отличается. Так, нанодиск, содержащий РОРС (~150 молекул), может связать до ~10 молекул токсина, а добавление отрицательно заряженных липидов увеличивает число сайтов связывания до ~ 35 (~4 молекулы липидов на молекулу токсина). В свою очередь, каждая молекула MSP (в отсутствие липидов) способна связать до 1.6 молекулы VSTx1, что ведет к практически полной компенсации ее заряда.
Гель-фильтрационный анализ комплексов VSTx1/ ЛБН не выявил разрушения нанодисков при связывании токсина. На хроматограммах (рис. 2А) видны отдельные пики для частиц диаметром ~10 —11
Энергетические и стехиометрические параметры, описывающие взаимодействие VSTx1 и с ЛБН и MSP, полученные с использованием уравнения равновесного распределения (уравнение (1)) либо уравнения изотермы Ленгмюра (уравнение (2))
Равновесное распределение Изотерма Ленгмюра
Пептид ЛБН или MSP K (ЛБН, MSPX2)* Р х 106, М-1 K (Липиды)* х 103, М-1 K ** х 10n, М-1 n***
ЛБН/POPC 0.39 ± 0.02 2.6 ± 0.2 0.06 ± 0.01 9.6 ± 1.5
VSTxl ЛБН/POPC/DOPG (3 : 1) 2.68 ± 0.24 17.8 ± 1.6 0.13 ± 0.02 34.5 ± 3.9
MSPX2 0.10 ± 0.01 0.05 ± 0.02 3.2 ± 0.9
NTII ЛБН/POPC/DOPG (3 : 1) 0.32 ± 0.01 2.13 ± 0.07
ЛБН/POPC/DOPS (4 : 1) 0.16 ± 0.01 1.07±0.07
*КР - коэффициент распределения. В качестве концентрации «неводной» среды использовали концентрацию ЛБН или липидов, предполагая, что один нанодиск содержит две молекулы MSP и 150 молекул липида. **Кп - константа формирования комплекса пептид-сайт связывания.
***п - число сайтов связывания пептида на поверхности нанодиска.
и ~2.0 нм, которые, вероятно, соответствовали нанодискам и свободному токсину, диссоциированному с поверхности нанодиска (для хроматографии использовали буфер, содержащий 100 мМ ПаС1).
Взаимодействие нейротоксина NTII с нанодисками
Нейротоксин II (ЫТП) - катионный негидрофобный пептид, стабилизирован четырьмя дисульфидными связями и имеет так называемую «трехпетельную» Р-структурную организацию, характерную для токсинов змей (рис. 1) [35]. ПТ11 является высокоспецифичным ингибитором никотинового ацетилхолино-вого рецептора мышечного типа, своей центральной петлей он блокирует сайты связывания лигандов, располагающиеся на внеклеточном домене рецептора [36]. В отличие от VSТx1, ПТ11 не имеет явно выраженной мембранной активности. В то же время в ходе исследований, проведенных с использованием методов :Н,15П- и 31Р-ЯМР-спектроскопии на липосомах DOPC/DOPS/холестерин (3 : 1 : 1), моделирующих мембранное окружение ацетилхолинового рецептора, предположили, что механизм действия ПТИ также включает элементы «мембранного катализа» [19]. По-видимому, сайт, локализованный в области «головы» токсина вблизи остатков G1u2, Asp57 и А^58 (рис. 3Б), способен в стехиометрии 1 : 1 связывать заряженную головку молекулы фосфатидилсерина (PS) биологической мембраны, окружающей рецептор. Это взаимодействие, возможно, играет роль на начальных этапах действия ПТИ и служит для придания молекуле токсина ориентации, оптимальной для образования комплекса токсин-рецептор [19].
Формирование ЛБН из смеси фосфолипидов POPC/DOPS/холестерин (3 : 1 : 1) при помощи стандартного протокола сборки нанодисков (см. «Экспериментальную часть») оказалось малоэф-
фективным, поэтому были выбраны ЛБН на основе смеси POPC/DOPS (4 : 1). Кроме того, для сравнения были протестированы нанодиски на основе РОРС и POPC/DOPG (3 : 1). Титрование образца ПТ11 растворами нанодисков показало, что токсин не связывается с нанодисками на основе цвиттер-ионных липидов (РОРС) и имеет небольшое сродство к ЛБН, содержащим анионные липиды (POPС/DOPG и POPС/DOPS) (рис. 3А, таблица). Большую аффинность ПТ11 к ЛБН на основе POPС/DOPG (3 : 1) можно объяснить большим зарядом мембраны нанодиска (относительное содержание заряженного липида 25% против 20% у мембраны POPС/DOPS (4 : 1)). Кроме того, в мембране, содержащей DOPS, заряды ПН3+-и СООН-групп серина образуют диполь, который может экранировать отрицательный заряд фосфатной группы. Таким образом, кажущийся заряд полярной головки у DOPS будет меньше, чем у DOPG. Полученные данные позволяют сделать предположение об отсутствии значительной селективности у молекулы ПТ11 при взаимодействии с анионными липидами, различающимися структурой полярных головок (фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин).
Отсутствие детектируемого связывания ПТ11 с ЛБН/РОРС косвенно указало на отсутствие неспецифического взаимодействия токсина с белковой компонентой нанодисков - MSP. Так же, как и в случае с VSТx1, гель-фильтрационный анализ комплексов ПТП/ЛБН не выявил разрушения нанодисков при связывании токсина (рис. 2А). На хроматограммах видны отдельные пики, соответствующие нанодискам и свободному токсину (диаметр ~2.6 нм).
Топологию взаимодействия молекулы ПТ11 с поверхностью мембраны POPС/DOPS в составе ЛБН изучали с использованием 2Н,15П-меченого аналога ПТ11 ЯМР-эксперименты проводили в условиях, ког-
:£
*
5
15
10
5
0
« •f 1 1 J? А
-0-ЛБН/POPC/DOPG (3 : 1) ■ ЛБН/РОРС/йОРБ (4 : 1) ЛБН/РОРС - - ^Разведение
5 10
[ЛБН], мкМ
15
Преднасыщение ^(СН,)3-группы РОРС (Ослабление > 40%)
PRE 5-DSA
(Ослабление > 35%)
Уровень
N+(^3)3-
групп
Рис. 3. Анализ изотерм связывания N711 с ЛБН и возможная топология взаимодействия молекулы N711 с поверхностью мембраны РОРС/йОРБ в составе ЛБН. А - изотермы связывания N711 с ЛБН аппроксимированы уравнением равновесного распределения (уравнение (1)). Полученные параметры приведены в таблице. Б - структура N711 окрашена в соответствии с полученными экспериментальными данными (рис. 4Г,Д). Остатки, формирующие предполагаемый сайт связывания с полярной головкой фосфатидилсерина [19], выделены голубыми кружками
0
да практически весь токсин был связан с поверхностью нанодиска. Несмотря на значительное уширение и ослабление сигналов связанного пептида (рис. 4А), применение дейтерированного аналога ПТП и экспериментов TROSY, оптимизированных для уменьшения поперечной релаксации ядер :Н и 15П позволило получить ^/^-корреляционный спектр ПТ11 в комплексе с ЛБН (рис. 4Б). Сравнение 1Н и 15П химических сдвигов молекулы ПТ11 в водном окружении и в комплексе с ЛБН не выявило значительных изменений в пространственной структуре токсина при образовании комплекса. Изменения химических сдвигов, превышающие 0.03 и 0.2 м.д. соответственно, отмечены только для одного остатка А^32 (данные не показаны).
Скорости кросс-корреляции релаксации ядер 15П (Пх^, измеренные для НП-групп ПТИ в комплексе с ЛБН (рис. 4В), показали большой разброс значений (от 2.5 до 40 Гц, среднее значение 16.3 ± 9.2 Гц, частота 800 МГц, 40°С), что соответствовало временам корреляции вращательных движений (тг) в диапазоне от 2 до 31 нс, со средним ~ 12.5 нс. Рассчитанное среднее значение тг соответствовало реориентации глобулярной частицы диаметром ~ 5.4 нм и массой ~ 34 кДа, что значительно превышает размеры молекулы ПТ11, но существенно меньше размеров нанодиска. Полученные данные указывают на значительную анизотропию взаимодействий в комплексе ПТП/ЛБН, которая может объясняться либо наличием дополнительных степеней свободы у молекулы токсина в составе комплекса, либо вовлечением молекулы ПТ11 в быстрый (по шкале ЯМР) обменный процесс между связанным и свободным состояниями.
Возможную ориентацию ПТ11 на поверхности мембраны нанодиска определяли, измеряя перенос намагниченности между протонами липидов и НП
группами нейротоксина за счет ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО). Наибольший отклик в ЯМР-спектрах пептида детектировался при насыщении сигналов холиновой группы РОРС. Существенное падение интенсивности 1Н,15П-кросс-пиков наблюдалось для остатков, локализованных на двух участках молекулы ПТ11: 1) в области «головы» токсина, вблизи от предполагаемого сайта связывания фос-фатидилсерина, и 2) в центральной (второй) петле на уровне остатков Тгр27, Тгр28 и 11е35 (рис. 3Б, 4Г). Наблюдаемое уменьшение интенсивности указывало на пространственную сближенность соответствующих НП-групп токсина с поверхностью бислоя ЛБН.
Дополнительно с целью определения топологии ПТИ на поверхности нанодиска использовали ли-пофильный спиновый зонд 5-DSA, который встраивается в бислой таким образом, что его спиновая метка располагается в гидрофобном регионе мембраны вблизи от области, занимаемой полярными головками. Наибольшее ослабление интенсивностей НП-сигналов, вызванное эффектом парамагнитного усиления релаксации, наблюдалось у остатка №г21 из «головы» токсина и остатков из третьей и второй петель (рис. 3Б, 4Д), что указывало на наличие контакта соответствующих НП-групп с гидрофобным регионом бислоя ЛБН.
Полученные данные не согласуются с одной преимущественной ориентацией молекулы ПТИ на поверхности мембраны нанодиска (рис. 3Б). Вероятно, токсин взаимодействует с поверхностью нанодиска в нескольких (минимум двух) ориентациях и участвует в быстрых (по шкале химических сдвигов ЯМР) обменных процессах между комплексами с различной топологией. При этом только одна из возможных топологий (рис. 3Б) «совместима» со специфическим взаимодействием ПТИ с полярной головкой фосфа-
NTII + ЛБН/POPC/DOPS (4 : 1) (pH 7.0, 40°C)
I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I
10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 U м.д.
I 1 1 1 T I I I I | 1 I T 1 1 1 1 I T I 1 I I I 1 1 I I 1 I I I I 1 1 1 I T I I I I I I I 1 I 1 1 | T 1 T I I I I I 1 | I ‘
10 20 30 40 50 60
Рис. 4. Анализ взаимодействия N711 с ЛБН методом ЯМР-спектроскопии. А - сравнение 1й 1Н-спектров 45 мкМ 2Н,15^меченого аналога N711 в водном растворе (внизу) и в комплексе с 75 мкМ ЛБН/РОРС/йОРБ (4 : 1) (вверху). Б - 2й 1H,15N-TROSY-спектр 45 мкМ 2Н,15^меченого N711 в комплексе с 75 мкМ ЛБН/РОРС/йОРБ (4 : 1).
В - скорость кросс-корреляции релаксации ядер ^ (пх^ молекулы N711 в комплексе с ЛБН/РОРС/йОРБ (4 : 1). Среднее значение показано пунктиром. Г, Д - относительное ослабление интенсивностей 1H,15N-TROSY-кросс-пиков N711 в комплексе с ЛБН/РОРС/йОРБ, вызванное (Г) преднасыщением сигнала холиновой группы РОРС в течение 1.5 с или (Д) парамагнитным усилением релаксации (PRE) от 75 мкМ 5-йБА
тидилсерина в предполагаемом сайте связывания [19]. Таким образом, в комплексе ПТ11 с ЛБН/РОРС/ DOPS неспецифические электростатические и гидрофобные взаимодействия имеют сравнимую энергию со специфическими взаимодействиями.
Следует отметить, что динамическое равновесие между комплексами с различной топологией может играть определенную роль в функционировании периферических мембранных белков и мембраноактивных пептидов. Так, в ходе недавнего ЯМР-исследования комплекса GTP-азы Rheb (семейство Ras) с ЛБН было установлено, что белок имеет две возможные ориентации относительно поверхности мембраны нанодиска. При этом заселенность этих состояний меняется в ходе гидролиза GTP [37].
ВЫВОДЫ
В представленной работе на примере трех модельных Р-структурных пептидов: ареницина-2, VSTx1 и ЫТП, исследована возможность применения ЛБН для изучения специфических взаимодействий пептид/мембрана и механизмов «мембранного катализа» в функционировании водорастворимых мембраноактивных антимикробных пептидов и нейропептидов. Установлено, что нанодиски, содержащие молекулы фосфатидилхолина и фосфатидил-глицерина, могут разрушаться при взаимодействии с катионными порообразующими пептидами и, возможно, не подходят в качестве мембраномоделирующей среды для изучения подобных молекул. В то же время среды на основе ЛБН могут приме-
няться для исследования энергетики, стехиометрии и топологии взаимодействия мембраноактивных нейротоксинов с липидной мембраной. В ходе подобных исследований необходимо учитывать возможность неспецифических взаимодействий пептидных молекул с белковой компонентой М^Р и с липидной мембраной нанодиска.
Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», РФФИ (гранты № 12-04-31485, 12-04-01639 и 14-04-01270), Министерством образования и науки РФ (соглашение № 8789), стипендией Президента РФ (СП-5823.2013.4) и грантом Президента РФ (НШ-1766.2014.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zasloff M. // Nature. 2002. V. 415. № 6870. P. 389-395.
2. Thomas L., Scheidt H.A., Bettio A., Beck-Sickinger A.G., Huster D., Zschornig O. // Eur. Biophys. J. 2009. V. 38. № 5.
P. 663-677.
3. Lee S.Y., MacKinnon R. // Nature. 2004. V. 430. № 6996.
P. 232-235.
4. Maler L. // Mol. Membr. Biol. 2012. V. 29. № 5. P. 155-176.
5. Oxenoid K., Chou J.J. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2013. V. 23.
№ 4. P. 547-554.
6. Chou J.J., Kaufman J.D., Stahl S.J., Wingfield P.T., Bax A. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. № 11. P. 2450-2451.
7. Warschawski D.E., Arnold A.A., Beaugrand M., Gravel A., Chartrand Ё., Marcotte I. // Biochim. Biophys. Acta. 2011.
V. 1808. № 8. P. 1957-1974.
8. Bayburt T.H., Sligar S.G. // FEBS Lett. 2010. V. 584. № 9.
P. 1721-1727.
9. Denisov I.G., McLean M.A., Shaw A.W., Grinkova Y.V., Sligar S.G. // J. Phys. Chem. B. 2005. V. 109. № 32. P. 15580-15588.
10. Frauenfeld J., Gumbart J., van der Sluis E.O, Funes S., Gartmann M., Beatrix B., Mielke T., Berninghausen O., Becker T., Schulten K., et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011. V. 18. № 5.
P. 614-621.
11. Katayama H., Wang J., Tama F., Chollet L., Gogol E.P., Collier R.J., Fisher M.T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 8. P. 3453-3457.
12. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Sobol A.G., Ovchinnikova T.V., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Blommers M.J., Arseniev A.S. // J. Am. Chem. Soc. 2008.
V. 130. № 7. P. 2140-2141.
13. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Paramonov A.S., Shingarova L.N., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Blommers M.J.J., Arseniev A.S. // J. Am. Chem. Soc. 2010. V. 132. № 16.
P. 5628-5629.
14. Hagn F., Etzkorn M., Raschle T., Wagner G. // J. Am. Chem. Soc. 2013. V. 135. № 5. P. 1919-1925.
15. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Gizatullina A.K., Zhuravleva A.V., Tagaev A.A., Yakimenko Z.A., Telezhinskaya I.N., Kirpichnikov M.P., Ovchinnikova TV., et al. // Chem. Biodivers. 2013. V. 10. № 5. P. 838-863.
16. Schuler M.A., Denisov I.G., Sligar S.G. // Meth. Mol. Biol.
2013. V. 974. P. 415-433.
17. Kyte J., Doolittle R.F. // J. Mol. Biol. 1982. V. 157. № 1. P. 105-132.
18. Shenkarev Z.O., Balandin S.V., Trunov K.I., Paramonov A.S., Sukhanov S.V., Barsukov L.I., Arseniev A.S., Ovchinnikova TV. // Biochemistry. 2011. V. 50. № 28. P. 6255-6265.
19. Lesovoy D.M., Bocharov E.V., Lyukmanova E.N., Kosinsky Y.A., Shulepko M.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P.,
Efremov R.G., Arseniev A.S. // Biophys. J. 2009. V. 97. № 7.
P. 2089-2097.
20. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Solozhenkin O.I., Gagnidze I.E., Nekrasova O.V., Chupin V.V., Tagaev A.A., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Kirpichnikov M.P., et al. // Biochemistry (Mosc.). 2009. V. 74. № 7. P. 756-765.
21. Ovchinnikova TV., shenkarev Z.O., Nadezhdin K.D., Balandin S.V., Zhmak M.N., Kudelina I.A., Finkina E.I., Kokryakov V.N., Arseniev A.S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 360. № 1. P. 156-162.
22. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Schulga A.A., Ermolyuk Y.S., Mordvintsev D.Y., Utkin Y.N., Shoulepko M.A., Hogg R.C., Bertrand D., Dolgikh D.A., et al. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 34. P. 24784-24791.
23. Chill J.H., Louis J.M., Baber J.L., Bax A. // J. Biomol. NMR. 2006. V. 36. № 2. P. 123-136.
24. Andra J., Jakovkin I., Grotzinger J., Hecht O., Krasnosdembskaya A.D., Goldmann T., Gutsmann T., Leippe M. // Biochem. J. 2008. V. 410. № 1. P. 113-122.
25. Nagle J.F., Tristram-Nagle S. // Biochim. Biophys. Acta.
2000. V. 1469. № 3. P. 159-195.
26. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Khabibullina N.F., Kopeina G.S., Shulepko M.A., Paramonov A.S., Mineev K.S., Tikhonov R.V., Shingarova L.N., Petrovskaya L.E., et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1818. № 3. P. 349-358.
27. Clay M.A., Pyle D.H., Rye K.-A., Barter P.J. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 12. P. 9019-9025.
28. Jayaraman S., Gantz D.L., Gursky O. // Biophys. J. 2005.
V. 88. № 4. P. 2907-2918.
29. Huang H.W. // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1758. № 9.
P. 1292-1302.
30. Sheng J.R., Grimme S., Bhattacharya P., Stowell M.H.B., Artinger M., Prabahakar B.S., Meriggioli M.N. // Exp. Neurol. 2010. V. 225. № 2. P. 320-327.
31. Jung H.J., Lee J.Y., Kim S.H., Eu Y.J., Shin S.Y., Milescu M., Swartz K.J., Kim J.I. // Biochemistry. 2005. V. 44. № 16. P. 6015-6023.
32. Schmidt D., MacKinnon R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 49. P. 19276-19281.
33. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Butenko I.O., Petrovskaya L.E., Paramonov A.S., Shulepko M.A., Nekrasova O.V., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S. // Biochim. Biophys. Acta. 2013. V. 1828. № 2. P. 776-784.
34. Nakano M., Fukuda M., Kudo T., Miyazaki M., Wada Y., Matsuzaki N., Endo H., Handa T. // J. Am. Chem. Soc. 2009.
V. 131. № 23. P. 8308-8312.
35. Golovanov A.P., Lomize A.L., Arseniev A.S., Utkin Y.N., Tsetlin V.I. // Eur. J. Biochem. 1993. V. 213. № 3. P. 1213-1223.
36. Teixeira-Clerc F., Menez A., Kessler P. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 28. P. 25741-25747.
37. Mazhab-Jafari M.T., Marshall C.B., Stathopulos P.B., Kobashigawa Y., Stambolic V., Kay L.E., Inagaki F., Ikura M.
// J. Am. Chem. Soc. 2013. V. 135. № 9. P. 3367-3370.
