N-концевые партнеры для эффективной продукции рецепторов, сопряженных с G-белками, в бактериальных бесклеточных системах Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.29

N-Концевые партнеры для эффективной продукции рецепторов, сопряженных с G-белками, в бактериальных бесклеточных системах

Е. Н. Люкманова1*, З. О. Шенкарев1, Н. Ф. Хабибуллина12, Д. С. Кульбацкий1,

М. А. Шулепко12, Л. Е. Петровская1, А. С. Арсеньев1, Д. А. Долгих1,2, М. П. Кирпичников1,2 1Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

2Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 *E-mail: ekaterina-lyukmanova@yandex.ru Поступила в редакцию 31.08.2012

РЕФЕРАТ Семейство рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCR), - одно из наиболее многочисленных семейств мембранных белков человека. Эти рецепторы, несмотря на их огромную важность для новых разработок в области фармакологии и медицины, остаются малоизученными. Основной фактор, сдерживающий структурно-функциональные исследования GPCR, - отсутствие высокоэффективных систем гетеро-логической продукции. Бесклеточные белоксинтезирующие системы, основанные на экстрактах из клеток Escherichia coli, в последнее время привлекают большое внимание в качестве эффективной альтернативы клеточным системам продукции рекомбинантных мембранных белков. Продукция GPCR в бактериальных бесклеточных системах затруднена из-за проблем, связанных с низкой эффективностью процесса инициации трансляции. Выход рецепторов может быть увеличен путем экспрессии слитых конструкций, содержащих дополнительные N-концевые аминокислотные последовательности-партнеры. В представленной работе для увеличения эффективности бесклеточного синтеза 02-адренорецептора, мускаринового M1 холинорецептора и соматостатинового рецептора типа 5 человека предложены три новые N-концевые последовательности. Показано, что использование N-концевого фрагмента (6 а.о.) бактериородопсина грамположительной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR-tag), N-концевого фрагмента (16 а.о.) рибону-клеазы А (S-tag) и белка Mistic из Bacillus subtilis позволяет увеличить выход GPCR в 5-38 раз и получить 0.6-3.8 мг целевого белка из 1 мл реакционной смеси, что достаточно для структурно-функциональных исследований.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА бесклеточные системы синтеза, рецепторы, сопряженные с G-белками, инициация трансляции.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотный остаток; ББС - бесклеточная белоксинтезирующая система; МБ - мембранный белок; РС - реакционная смесь; ПС - питающая смесь; TM - трансмембранный; ^2AR -Р2-адренергический рецептор человека; ESR - бактериородопсин из Exiguobacterium sibiricum; ESR-tag -N-концевой фрагмент (6 а.о.) ESR; GPCR - рецепторы, сопряженные с G-белками; M1-mAChR - мускари-новый ацетилхолиновый рецептор человека типа М1; SSTR5 - соматостатиновый рецептор человека типа 5; S-tag - N-концевой фрагмент (16 а.о.) рибонуклеазы А; T7-tag - N-концевой фрагмент (11 а.о.) лидерной последовательности белка 10 бактериофага T7; TRX - тиоредоксин из Escherichia coli.

ВВЕДЕНИЕ

Интегральные мембранные белки (МБ) участвуют во многих процессах, необходимых для жизни отдельных клеток и многоклеточных организмов. Эти белки ответственны за клеточную энергетику, межклеточное узнавание, а также за процессы проведения сигналов и транспорта различных веществ через

клеточную мембрану [1]. Согласно современным данным, МБ составляют более 25% всех аминокислотных последовательностей, закодированных в геноме высших организмов, включая человека [2]. Один из фармакологически наиболее важных классов МБ - рецепторы, сопряженные с G-белками ^РСИ). В геноме человека идентифицировано более 800 генов, коди-

рующих рецепторы этого семейства [3]. Именно мембранные рецепторы этого класса служат мишенями для ~30% современных лекарственных средств [4]. Рецепторы семейства GPCR имеют гомологичную пространственную организацию, они содержат семь трансмембранных (ТМ) спиралей, а также внеклеточный N-концевой и внутриклеточный C-концевой участки [5]. Сайты связывания низкомолекулярных соединений (лигандов) во многих случаях локализованы в ТМ-домене рецептора, в то время как пептидные гормоны и регуляторы белковой природы взаимодействуют с N-концевым участком и внеклеточными петлями [5].

GPCR представляют исключительный интерес для новых разработок в области фармакологии, однако их структурно-функциональные исследования значительно затруднены [5], что во многом связано с невозможностью выделения достаточных количеств белковых препаратов из природных источников, а также с трудностями, возникающими при создании высокоэффективных систем гетероло-гической продукции этих МБ [6]. В течение последнего десятилетия совместное использование систем экспрессии, основанных на эукариотических клетках, и новых методов рентгеноструктурного анализа позволило определить пространственные структуры ряда рецепторов семейства GPCR [5], включая Р2-адренорецептор (P2AR) [7] и мускариновые хо-линорецепторы M2 и M3 (mAChR) человека [8, 9]. Эти работы позволили значительно продвинуться в понимании принципов пространственной организации GPCR, однако для детального исследования функциональной динамики и механизмов работы мембранных рецепторов требуется применение спектроскопических методов высокого разрешения, таких, как гетероядерная ЯМР-спектроскопия [10]. Для применения современных методов ЯМР-спектроскопии необходимо иметь миллиграммовые количества белкового препарата, меченного стабильными изотопами (2H, 13C, 15N) [10], что при использовании эукариотических систем сопряжено со значительными финансовыми затратами. В то же время применение традиционных бактериальных систем экспрессии для продукции GPCR зачастую не позволяет добиться высоких выходов целевого белка и осложнено необходимостью разработки протоколов ренатурации [11].

В последнее время бесклеточные белоксинтезиру-ющие системы (ББС) [12] и особенно системы, основанные на бактериальных экстрактах, приобретают все большую популярность в качестве альтернативного инструмента для рекомбинантной продукции МБ [13]. По сравнению с системами, основанными на клеточной продукции, ББС обладают рядом пре-

имуществ. Среди них можно выделить продукцию исключительно целевого белка, возможность синтеза токсичных белков, простую процедуру синтеза селективно изотопно-меченных препаратов, а также возможность прямого внесения в реакционную смесь (РС) различных агентов и кофакторов, способствующих стабилизации нативной пространственной структуры синтезированного белка в растворе [12, 13]. Например, для продукции МБ в растворимой форме в РС могут добавляться компоненты мембраномоделирующих сред, такие, как мицеллы детергентов, липид-детергентные бицеллы, липосомы и липид-белковые нанодиски [13-15].

Согласно опубликованным данным, прямая экспрессия генов GPCR в ББС малоэффективна [14, 16-18]. Одной из возможных причин считается низкая эффективность процесса инициации трансляции [18], вызванная образованием вторичной структуры 5'-концевым фрагментом мРНК [19, 20]. Введение на 5'-конец гена целевого белка дополнительных нуклеотидных последовательностей, кодирующих N-концевые полипептидные партнеры, такие, как фрагмент лидерной последовательности белка 10 бактериофага T7 (T7-tag, 11 аминокислотных остатков, а.о., здесь и далее длина последовательности указана с учетом N-концевого остатка Met) [14, 16], белок тиоредоксин Escherichia coli (TRX) [17] или синтетические последовательности длиной 1-6 а.о. [18], во многих случаях позволяет решить эту проблему и добиться необходимого уровня продукции GPCR.

В представленной работе для увеличения эффективности бесклеточной продукции GPCR человека на примере P2AR, M1-mAChR и соматостатинового рецептора типа 5 (SSTR5) предложены три новых N-концевых партнера. Показано, что использование нуклеотидных последовательностей, кодирующих N-концевой фрагмент (6 а.о.) бактериородопсина грам-положительной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR-tag), N-концевой фрагмент (16 а.о.) рибонуклеа-зы А (N-концевой фрагмент S-пептида, S-tag) и белок Mistic Bacillus subtilis, позволяет увеличить выход рецепторов в 5-38 раз, обеспечивая продукцию целевых белков на уровне, достаточном для дальнейших структурно-функциональных исследований.

экспериментальная часть

Дизайн и клонирование генов GPCR с дополнительными 5'-концевыми последовательностями

В работе использованы укороченные гены рецепторов P2AR, M1-mAChR и SSTR5 человека, содержащие дополнительные замены, и 3'-концевые последо-

вательности, кодирующие 10 остатков His (His-tag) (см. «Результаты и обсуждение»). Молекулярные массы целевых белков составляли 38.2, 32.6 и 32.7 кДа соответственно. Нуклеотидные последовательности, кодирующие T7-tag (11 а.о., MASMTGGQQMG), Stag (16 а.о., MKETAAAKFERQHMDS), TRX (11.8 кДа) и белок Mistic (12.8 кДа), были введены в одной рамке считывания на 5'-конец укороченных генов GPCR (рис. 1) с использованием стандартных методов генной инженерии. Нуклеотидная последовательность, кодирующая ESR-tag (6 а.о., MEEVNL), была добавлена при помощи одностадийной ПЦР на 5'-конец укороченных генов GPCR взамен участков, кодирующих N-концевые внеклеточные фрагменты рецепторов (см. «Результаты и обсуждение»). Все эти генные конструкции были клонированы в вектор pET22b(+) («Novagen», США) под контроль Т7-промотора. Полученные векторы назвали pET22b( + )/GPCR, pET22b(+)/T7-tag-GPCR, pET22b(+)/S-tag-GPCR, pET22b( + )/TRX-GPCR, pET22b( + )/Mistic-GPCR и pET22b(+)/ESR-GPCR (рис. 1).

Бесклеточная продукция GPCR

GPCR синтезировали в бесклеточной системе диализного типа на основе S30 экстракта из E. coli, используя протоколы [15, 21]. Конечная концентрация компонентов РС составляла: 100 мМ HEPES-KOH («Fluka», США), pH 8.0, 8 мМ Mg(OAc)2, 90 мМ KOAc, 20 мМ ацетилфосфат калия («Sigma», США), 20 мМ фосфоенолпируват калия («Aldrich», США), набор аминокислот (по 1.3 мМ каждой), за исключением Arg, Cys, Met, Trp, Asp, Glu, концентрация каждой из которых составляла 1 мЫ, 0.15 мг/мл фолиевой кислоты («Sigma»), каждый из четырех рибону-клеозидтрифосфатов в концентрации 1 мМ, ингибитор протеиназ (X1 Complete protease inhibitor®, «Roche Diagnostics», Германия), 0.05% NaN3, 2% по-лиэтиленгликоль 8000 («Sigma»); 0.3 ед./мкл ингибитора рибонуклеаз RiboLock («Fermentas», Литва), 0.04 мг/мл пируваткиназы («Fermentas», Литва), 5.5 мкг/мл T7-полимеразы, 0.3 мг/мл плазмидной ДНК, 0.5 мг/мл суммарной тРНК (из E. coli MRE 600) («Roche Dagnostics», Швейцария), 30% от общего объема РС экстракта S30 из E. coli. Питающая смесь (ПС) имела такой же состав, как и РС, исключая высокомолекулярные компоненты: экстракт S30, плазмиду, ферменты, ингибитор рибонуклеаз. Синтез осуществляли без добавления каких-либо мембраномоделирующих сред в РС и ПС. Объем РС составлял 50 мкл, объем ПС - 750 мкл. РС помещали в реактор, отделенный от раствора ПС полупроницаемой целлюлозной мембраной (размер пор 12 кДа, «Sigma», США). Инкубацию проводили в течение 20 ч при 30°С и умеренном перемешивании.

pET22b(+)

Ndel

Ьш

Сайт для тромбина

Hindi!!

TRX

GPCR

His10

pET22b(+) Ndei Сайт для тромбина Hindii|

-------^—

pET22b(+)

Mistic

Nde! ___I

GPCR

pET22b(+)

S-tag

Nde!

His10 Hindi!! —

GPCR

His10

pET22b(+)

T7-tag GPCR

Ndei

Hindiii

Ф- J---------

His10

Hindiii ----------

pET22b(+)

ESR-tag GPCR His10 Ndei

GPCR

Hindiii ► J---------

His10

Рис. 1. Дизайн экспрессирующих векторов, содержащих гены GPCR и дополнительные 5'-концевые последовательности. Последовательности, кодирующие ^концевые партнеры, гены GPCR, сайты гидролиза тромбином и полигистидиновые последовательности, показаны розовым, фиолетовым, оранжевым и зеленым соответственно. Показаны сайты эндонуклеаз рестрикции, по которым гены GPCR клонировали в вектор рЕТ22Ь(+)

Выделение и очистка препаратов GPCR

РС, содержащие синтезированные GPCR, центрифугировали в течение 15 мин при 14000 об/мин. Полученные осадки солюбилизировали в буфере А (20 мМ Tрис-HCl, 250 мМ NaCl, 1 мМ NaN3, pH 8.0), содержащем 1% додецилсульфата натрия (SDS), 1 мМ дитио-треитола и 8 М мочевины. Солюбилизированные белки наносили на колонку, содержащую №2+-сефарозу («GE Healthcare», Швеция), промывали 10 объемами буфера А, содержащего 1% SDS, и элюировали тремя объемами буфера А, содержащего 1% SDS и 500 мМ имидазола. Образцы GPCR диализовали против буфера А, содержащего 1% SDS.

Фракции элюата анализировали при помощи электрофореза в ПААГ и Вестерн-блотинга, используя моноклональные антитела мыши против гексагисти-диновой последовательности (His-tag® Monoclonal antibody, «Novagen», США). Количество очищенных препаратов GPCR определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм. Спектры КД получали

U

Q-

С

5

га

х

с

<и

ю

0

1 I

га

m

0 О. х т <и

н

1 У

и

Ч

О

х

.0

со

3.8-

3.6-

3.4-

3.2-

3.0-

2.8-

2.6-

2.4-

2.2

2.0-

1.8-

1.6-

1.4-

1.2-

1.0-

0.8-

0.6-

0.4-

0.2

0.0

□ P2AR

П M1-mAChR

□ SSTR5

1

П.Э. ESR-tag Mistic S-tag TRX Т74ад

Рис. 2. Анализ эффективности бесклеточного синтеза GPCR в зависимости от 5'-концевой последовательности генов. Уровень синтеза GPCR в отсутствие дополнительных 5'-концевых последовательностей обозначен «П.Э.» (прямая экспрессия). Уровень синтеза гибридных белков показан «незаполненными» столбцами, количества синтезированных целевых белков (цветные столбцы) показаны за вычетом доли, занимаемой ^концевыми партнерами. Каждое значение получено на основе усреднения результатов трех повторных опытов, относительная величина стандартного отклонения не превышала 15%. Количественное содержание препаратов GPCR оценивали спектрофотометрически по поглощению при 280 нм после очистки с помощью №2+-аффинной хроматографии

Делеция С-концевых участков рецепторов привела к удалению остатков Сys (241, 435 и 320), которые, как предполагается, являются сайтами посттрансля-ционного присоединения остатков пальмитиновой кислоты в молекулах Р2АИ, М1-тА^И и SSTR5 соответственно [7, 23, 24]. Кроме того, из молекулы М1-тА^Г был удален фрагмент цитоплазматической петли 3 ^3), которая также не участвует в связывании лигандов [8, 9, 25]. Полученные гены кодировали участки 25-340, 19-224/354-426 и 37-319 рецепторов Р2АГ, М1-тА^Г и SSTR5 человека соответственно. Для последующей очистки рекомбинантных белков с помощью №2+-аффинной хроматографии на 3'-концевые участки генов дополнительно вводили последовательности, кодирующие His10-tag.

Укороченные гены рецепторов Р2АГ, М1-тА^Г и SSTR5 кодировали 10, 9 и 10 остатков Сys соответственно, из которых только остатки из внеклеточной области, возможно, участвуют в формировании внутримолекулярных дисульфидных связей (Сys106-Сys191 и Сys184-Сys190 в Р2АГ; Сys98-Сys178 и Сys391-Сys394 в М1-тА^Г; Сys112-Сys186 в SSTR5, нумерация приведена для нативной последовательности рецепторов). С целью уменьшения агрегации рекомбинантных белков в результате образования «ненативных» межмолекулярных ди-сульфидных связей, при помощи сайт-направленного мутагенеза заменили остатки Сys, имеющие трансмембранную и цитоплазматическую локализацию. Так, используя данные [26, 27], остатки Сys77, Сys116 и Сys125 в последовательности Р2АГ были заменены на Val, а остатки Сys285, Сys327 и Сys265 - на Ser. В M1-mAСhR остатки Сys69, Сys205, Сys417, Сys421, Сys435 и Сys460 заменили на Ser [28]. В SSTR5 остатки Сys129, Сys237 и Сys260 заменили на Ser; остатки Сys169, Сys218 и Сys220 - на Val; а остатки Сys51 и Сys298 - на Gly. Кроме того, в последовательность P2AR дополнительно внесли «стабилизирующую» замену Glu122Trp [29].

при комнатной температуре на спектрометре J-810 («Jasco», Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн генов GPCR

Для увеличения стабильности препаратов GPСR и уменьшения тенденции рекомбинантных белков к агрегации использовали укороченные варианты рецепторов, дополнительно содержащие точечные замены. При помощи методов генной инженерии были удалены Ы- и С-концевые внемембранные участки, не участвующие в связывании лигандов [7-9, 22-24].

Экспрессия генов GPCR в бесклеточной системе

Добавление в РС бесклеточной системы мембраномоделирующих компонентов в некоторых случаях позволяет синтезировать МБ в растворимой и функционально активной форме [13-18]. Однако многие из подобных добавок, например молекулы детергентов, способны негативно влиять на продуктивность системы, частично или полностью ингибируя синтез целевого белка [14-17]. Поэтому в нашей работе для сравнительного анализа эффективности экспрессии генов GPCR с дополнительными 5'-концевыми участками мы не использовали мембраномоделирующие среды в процессе синтеза. При этом целевые белки накапливались в виде осадка РС. Осадки рас-

творяли в «жестком» детергенте SDS в присутствии мочевины и восстанавливающего агента дитиотреи-тола. Количество синтезированных белков оценивали спектрофотометрически после очистки растворенных осадков при помощи №2+-аффинной хроматографии. Синтез целевых белков подтверждали с использованием моноклональных антител против гексагистиди-новой последовательности.

Как и ожидалось, прямая экспрессия укороченных генов ft2AR, M1-mAChR и SSTR5 в ББС на основе экстракта S30 из E. coli была малоэффективна. Выход целевых белков после очистки не превышал 0.1 мг с 1 мл РС (рис. 2). Следует отметить, что ранее мы наблюдали высокоэффективную продукцию (выход до 1.6 мг/мл [15]) бактериородопсина из грампо-ложительной бактерии Ex. sibiricum (ESR) - структурного гомолога рецепторов семейства GPCR, также содержащего семь ТМ-спиралей [30]. Мы предположили, что низкий выход модельных GPCR связан с малой эффективностью инициации трансляции, вызванной образованием вторичной структуры фрагментом мРНК в области начала целевого гена. Для подтверждения этого предположения в генах укороченных GPCR заменили 5'-концевые последовательности, кодирующие внеклеточные N-концевые аминокислотные остатки, предшествующие первой ТМ-спирали (остатки 25-33, 19-23 и 37-38 в P2AR, M1-mAChR и SSTR5 соответственно), на нуклеотидную последовательность, кодирующую первые 6 а.о. бактериородопсина ESR (ESR-tag, длина последовательности указана с учетом N-концевого остатка Met) (рис. 1). Эта замена позволила значительно увеличить эффективность продукции целевых белков (рис. 2). При этом выход гибридного белка ESR-tag-P2AR был сравним с выходом белка ESR, в то время как уровень синтеза двух других гибридных белков -ESR-tag-M1-mAChR и ESR-tag-SSTR5 - был примерно в 3 раза ниже (~ 0.5 мг/мл).

Сравнение эффективности синтеза GPCR с различными N-концевыми партнерами

Полученные результаты подтвердили важную роль 5'-концевой последовательности гена в эффективной экспрессии в бесклеточной системе. Однако выходы целевых белков, достигнутые с использованием ESR-tag, возможно, не были оптимальными. Так, в литературе описаны примеры синтеза рекомбинантных МБ в ББС диализного типа на основе экстракта S30 клеток E. coli с выходом до 4-6 мг/мл [14]. С целью дальнейшей оптимизации системы синтеза модельных GPCR мы опробовали четыре N-концевых партнера. Два из них, T7-tag (11 а.о.) и белок TRX (11.8 кДа), ранее применяли для бесклеточной продукции рецепторов семейства GPCR [14, 16, 17], в то время как белок

Mistic (12.8 кДа) использовали для продукции GPСR в клетках Е. со11 [31, 32]. Кроме того, опробовали последовательность, кодирующую Ы-концевой фрагмент (16 а.о.) рибонуклеазы А (Ы-концевой фрагмент S-пептида, S-tag), который применяется для детекции и очистки препаратов рекомбинантных белков при помощи аффинной хроматографии [33], но не использовался ранее в качестве Ы-концевого партнера для получения рекомбинантных МБ. В отличие от метода, использованного при дизайне гибридных генов с 5'-концевой последовательностью, кодирующей ESR-tag, нуклеотидные последовательности, кодирующие T7-tag, TRX, Mistic и S-tag, были добавлены в единой рамке считывания на 5'-конец генов укороченных вариантов GPСR (рис. 1).

В большинстве случаев использование Ы-концевых партнеров вело к увеличению выхода модельных рецепторов, причем степень выхода различалась у разных белков. Так, например, использование T7-tag увеличило выход M1-mAСhR и SSTR5 до ~ 0.5 мг/мл, в то время как уровень P2AR оставался низким и был сравним с выходом, наблюдаемым при прямой экспрессии. Использование TRX также обеспечивало небольшое увеличение эффективности синтеза целевых белков - до ~ 0.3-0.7 мг/мл (здесь и далее приведены количества целевых белков за вычетом доли, занимаемой белками-партнерами, рис. 2). В то же время применение Ы-концевых партнеров Mistic и S-tag позволило значительно повысить продукцию P2AR и M1-mAСhR (рис. 2). При этом наибольший выход P2AR (~ 1.9 мг/мл) наблюдался при использовании белка Mistic, а максимальный выход М1-mAСhR (~ 3.6 мг/мл) отмечен в случае гибридного белка с последовательностью S-tag (рис. 2). Однако ни одна из использованных последовательностей-партнеров не позволила добиться значительного увеличения уровня продукции SSTR5. Выход этого рецептора (0.4-0.7 мг/мл) был близким при использовании разных гибридных конструкций (рис. 2). По-видимому, в случае SSTR5 инициация трансляции не является единственным фактором, критически важным для эффективности бесклеточного синтеза. Возможно, для увеличения уровня продукции этого рецептора в бактериальной бесклеточной системе требуется дальнейшая оптимизация нуклеотидной последовательности гена, например замена редко встречающихся у Е. со11 вариантов кодонов. Следует отметить, что близкий по величине выход SSTR5 (~ 0.5 мг/мл) наблюдали ранее в бактериальной ББС диализного типа при использовании гибрида полноразмерного (не укороченного) рецептора с Ы-концевой последовательностью T7-tag [34].

Как уже отмечалось, увеличение эффективности синтеза белка при использовании дополнительных

N-концевых последовательностей связано, возможно, с уменьшением способности 5'-концевого фрагмента мРНК к образованию вторичной структуры. Для подтверждения этого предположения проведено моделирование вторичной структуры 5'-концевых фрагментов мРНК, использованных нами для продукции GPCR. Моделирование проводили в программе M-fold, позволяющей оценивать свободную энергию образования вторичной структуры РНК [35]. Свободная энергия образования вторичной структуры была рассчитана для фрагментов мРНК, включающих 4 нуклеотида до стартового кодона, стартовый кодон и 34 нуклеотида гена целевого белка или партнера, следующих за стартовым кодоном, как описано в работе [20]. Расчеты показали (таблица), что нативные последовательности укороченных рецепторов способны образовывать стабильные вторичные структуры (AG ~ -5.6, -8.2 и -19.3 ккал/моль для P2AR, M1-mAChR и SSTR5 соответственно). Использование последовательностей T7-tag и TRX лишь незначительно уменьшало стабильность вторичной структуры 5'-концевого фрагмента мРНК (AG ~ -5.5...-7.8 ккал/моль). В то же время использование N-концевой последовательности бактериоро-допсина ESR значительно уменьшало стабильность вторичной структуры 5'-концевого фрагмента мРНК P2AR и M1-mAChR (AG ~ -3.1 и -3.5 ккал/моль соответственно). Наименее стабильные вторичные структуры мРНК получены при использовании последовательностей Mistic и S-tag (AG ~ -1.3 и -3.3 ккал/моль соответственно). Качественная корреляция рассчитанных энергий с уровнем синтеза GPCR косвенно подтверждает важную роль образования вторичной структуры 5'-концевым фрагментом мРНК в снижении эффективности инициации трансляции и, как следствие, общей эффективности бесклеточного синтеза.

Модификация 5'-концевой области гена целевого белка не единственный метод предотвращения формирования вторичной структуры мРНК и увеличения эффективности инициации трансляции. На эти процессы также могут влиять нуклеотидные последовательности, которые находятся в нетранслируемых 5'-концевых областях этих мРНК. В представленной работе мы использовали генетические конструкции на основе вектора pET22b(+) («Novagen»), содержащего последовательность lac-оператора между T7-промотором и сайтом связывания рибосомы (RBS). Согласно опубликованным данным, использование векторов pIVEX («Roche Applied Science», США), не содержащих lac-оператор, может увеличить эффективность прямой экспрессии генов GPCR в бактериальных ББС [34]. Для проверки этого предположения мы протестировали эффективность прямой

Свободная энергия образования вторичной структуры 5'-концевым фрагментом мРНК (AG, ккал/моль)

Партнер/GPCR P2AR M1-mAChR SSTR5

Прямая экспрессия -5.6 -8.2 -19.3

ESR-tag -3.1 -3.5 -6.4

Mistic -1.3 -1.3 -1.3

S-tag -3.3 -3.3 -3.3

TRX -7.8 -7.8 -7.8

T7-tag -5.5 -7.6 -7.3

Примечание. Свободная энергия рассчитана в программе М4оЫ [35] для фрагментов мРНК, включающих 4 нуклеотида до стартового кодона, стартовый кодон и 34 нуклеотида гена целевого белка или партнера, следующих за стартовым кодоном.

экспрессии укороченного гена M1-mAChR при использовании вектора pIVEX2.3. Выход целевого белка в этом случае (~ 0.1 мг/мл) был не больше, чем при прямой экспрессии гена M1-mAChR, клонированного в вектор pET22b(+). Полученные данные согласуются с результатами исследования обонятельных GPCR, продукция которых в бактериальной бескле-точной системе с использованием векторов pIVEX была малоэффективной [36]. Кроме того, для высокоэффективной экспрессии клонированных в векторы pIVEX генов белков человека также требуется использование N-концевых последовательностей-партнеров [37].

Другим способом решения проблем, связанных с низкой эффективностью инициации трансляции в ББС, может быть рациональный дизайн 5'-конце-вой последовательности гена целевого белка с использованием синонимичных замен (без изменения кодируемой последовательности), цель которого -уменьшение способности мРНК к формированию вторичной структуры [20]. Так, подобный подход применили для продукции цитокинов млекопитающих в тех случаях, когда наличие последовательности-партнера (N-концевого фрагмента хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, 5 а.о.) препятствовало формированию пространственной структуры целевого белка [38].

Анализ рекомбинантных GPCR

Очищенные препараты GPCR, солюбилизированные в «жестком» детергенте SDS (1%), проанализировали при помощи электрофореза в ПААГ. Репрезентативные фрагменты электрофореграмм показаны на рис. 3. Полученные препараты, как и препараты

116

66 1*

45 •

35 1

25 «•

18 и

14 41

кДа 1

I

щР

Высоко-

мол.

агрегаты

Димеры

GPCRs

Моно-

меры

GPCR

xg т

I I—,

00 I—

I

00

2 3 4

P2AR

С

5

Ш т Ш т -*7 "V o'

оо

6 7 8

та : -t— _J I

_ 00

9 10

M1-mAChR SSTR5

Рис. 3. Электрофоретический анализ синтезированных GPCR с различными ^концевыми партнерами после очистки с помощью №2+-аффинной хроматографии.

В образцах выявлены как мономеры, димеры и три-меры рецепторов, так и агрегаты более высокого порядка. 1 - маркеры молекулярной массы; 2, 5, 9 -рецепторы, синтезированные без ^концевых партнеров (П.Э. - прямая экспрессия); 3, 6, 10 - рецепторы с последовательностью S-tag; 4, 7, 11 - рецепторы с последовательностью Т7-+ад; 8 - ESR-tag-M1-mAChR

других МБ [39], имели аномальную электрофоретическую подвижность, вызванную, вероятно, неполной денатурацией молекул МБ SDS. На элек-трофореграммах выявлены отдельные полосы, соответствующие мономерам, димерам, тримерам рецепторов и агрегатам более высокого порядка (рис. 3). Подобное поведение типично для GPCR, которые в составе биологической мембраны формируют димеры и тримеры, а также склонны к спонтанной агрегации из-за гидрофобных взаимодействий ТМ-спиралей даже в растворах «жестких» детергентов [31]. Степень агрегации препаратов GPCR зависела от типа рецептора и последовательности П-концевого партнера, а также, возможно, от концентрации белкового препарата в образце. Так, например, наибольшее количество высокомолекулярных агрегатов отмечено в образце S-tag-M1-тА^Г, синтез которого был наиболее эффективным. Методом КД-спектроскопии проанализирована вторичная структура гибрида ESR-tag-M1-mAChR, который в растворе SDS обладал меньшей степенью агрегации (рис. 4). Анализ полученных данных выявил преобладание а-спиральной структуры (а-спираль - 65%, Р-лист - 4%, Р-поворот - 9%, неупорядоченная структура - 22%), что указывает на частично сформированную вторичную структуру рецептора в окружении молекул SDS. Следует

Длина волны,нм

Рис. 4. КД-спектр ESR-tag-M1-mAChR в растворе 1% SDS

отметить, что содержание а-спиральных элементов в молекуле укороченного рецептора М1-тА^Г, рассчитанное по аналогии с известными кристаллическими структурами М2 и М3-тА^Г [8, 9], должно составлять ~72%.

Для дальнейшего изучения рекомбинантных GPCR необходима либо оптимизация процедуры солюбилизации целевых белков из осадка РС с последующей разработкой методов ренатурации полученных препаратов, либо применение мембраномоделирующих сред в процессе бесклеточного синтеза, что в некоторых случаях позволяет синтезировать МБ в функционально активной форме [13, 15, 34, 35].

ВЫВОДЫ

Результаты, полученные в нашей работе, показали, что применение в качестве П-концевых партнеров аминокислотных последовательностей ESR-tag, S-tag и белка Mistic позволяет добиться высокоэффективной продукции GPCR человека в бесклеточной системе на основе S30 экстракта из Е. соИ. Использование этих последовательностей обеспечивает продукцию целевых белков (0.6-3.8 мг/мл) на уровне, достаточном для дальнейших структурно-функциональных исследований. Представленная работа впервые показывает возможность применения ESR-tag и S-tag для увеличения уровня гетерологической продукции МБ. •

Работа поддержана ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», РФФИ (грант № 11-04-01864-а), программой «У.М.Н.И.К.» и Министерством образования и науки (№ соглашений 8268 и 8789).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lundstrom K.H. Structural Genomics on Membrane Proteins. Boca Raton, FL: CRC Press, 2006.

2. Wallin E., von Heijne G. // Protein Sci. 1998. V. 7. № 4.

P. 1029-1038.

3. Fredriksson R., Lagerstrom M.C., Lundin L.G., Schioth H.B.

// Mol. Pharmacol. 2003. V. 63. № 6. P. 1256-1272.

4. Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L. // Nat. Rev. Drug. Discov. 2006. V. 5. № 12. P. 993-996.

5. Rosenbaum D.M., Rasmussen S.G., Kobilka B.K. // Nature. 2009. V. 459. № 7245. P 356-363.

6. McCusker E.C., Bane S.E., O'Malley M.A., Robinson A.S. // Biotechnol. Prog. 2007. V. 23. № 3. Р. 540-547.

7. Cherezov V., Rosenbaum D.M., Hanson M.A., Rasmussen S.G., Thian F.S., Kobilka T.S., Choi H.J., Kuhn P., Weis W.I., Kobilka B.K., et al. // Science. 2007. V. 318. № 5854. P. 1258-1265.

8. Haga K., Kruse A.C., Asada H., Yurugi-Kobayashi T., Shiroi-shi M., Zhang C., Weis W.I., Okada T., Kobilka B.K., Haga T., et al. // Nature. 2012. V. 482. № 7386. P. 547-551.

9. Kruse A.C., Hu J., Pan A.C., Arlow D.H., Rosenbaum D.M., Rosemond E., Green H.F., Liu T., Chae P.S., Dror R.O., et al. // Nature. 2012. V. 482. № 7386. P 552-556.

10. Cavanagh J., Fairbrother W.J., Palmer A.G., III, Skelton N.J., Rance M. Protein NMR Spectroscopy Principles and Practice. 2nd ed. N.Y.: Academic Press, 2006.

11. Kiefer H. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1610. № 1.

P. 57-62.

12. Shirokov V.A., Kommer A., Kolb V.A., Spirin A.S. // Methods Mol. Biol. 2007. V. 375. P. 19-55.

13. Schneider B., Junge F., Shirokov V.A., Durs,t F., Schwarz D., Dotsch V., Bernhard F. // Methods Mol. Biol. 2010. V. 601.

P. 165-186.

14. Klammt C., Schwarz D., Fendler K., Haase W., Dotsch V., Bernhard F. // FEBS J. 2005. V. 272. P. 6024-6038.

15. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Khabibullina N.F., Kopeina G.S., Shulepko M.A., Paramonov A.S., Mineev K.S., Tikhonov R.V., Shingarova L.N., Petrovskaya L.E., et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1818. № 3. P. 349-358.

16. Klammt C., Schwarz D., Eifler N., Engel A., Piehler J., Haase W., Hahn S., Dotsch V., Bernhard F. // J. Struct. Biol. 2007.

V. 158. № 3. P 482-493.

17. Ishihara G., Goto M., Saeki M., Ito K., Hori T., Kigawa T., Shirouzu M., Yokoyama S. // Protein Expr. Purif. 2005. V. 41.

P. 27-37.

18. Haberstock S., Roos C., Hoevels Y., Dotsch V., Schnapp G., Pautsch A., Bernhard F. // Protein Expr. Purif. 2012. V. 82.

№ 2. P. 308-316.

19. Hall M.N., Gabay J., Debarbouille M., Schwartz M. // Nature. 1982. V. 295. P 616-618.

20. Kudla G., Murray A.W., Tollervey D., Plotkin J.B. // Science. 2009. V. 324. № 5924. P. 255-258.

21. Хабибуллина Н.Ф., Люкманова Е.Н., Копеина Г.С., Шенкарев З.О., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. // Биоорган. химия. 2010. Т. 36. № 5. С. 654-660.

22. Greenwood M.T., Hukovic N., Kumar U., Panetta R., Hjorth

S.A., Srikant C.B., Patel Y.C. // Mol. Pharmacol. 1997. V. 52.

№ 5. P 807-814.

23. Hukovic N., Panetta R., Kumar U., Rocheville M., Patel Y.C. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 33. P. 21416-21422.

24. Kaye R.G., Saldanha J.W., Lu Z.L., Hulme E.C. // Mol. Pharmacol. 2011. V. 79. № 4. P. 701-709.

25. Shapiro R.A., Nathanson N.M. // Biochemistry. 1989. V. 28.

№ 22. P. 8946-8950.

26. Gether U., Lin S., Ghanouni P., Ballesteros J.A., Weinstein H., Kobilka B.K. // EMBO J. 1997. V. 16. № 22. P. 6737-6747.

27. Fraser C.M. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. № 16. P. 9266-9270.

28. Savarese T.M., Wang C.D., Fraser C.M. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 16. P 11439-11448.

29. Roth C.B., Hanson M.A., Stevens R.C. // J. Mol. Biol. 2008.

V. 376. № 5. P. 1305-1319.

30. Petrovskaya L.E., Lukashev E.P., Chupin V.V., Sychev S.V., Lyukmanova E.N., Kryukova E.A., Ziganshin R.H., Khatypov R.A., Erokhina L.G., Spirina E.V., et al. // FEBS Lett. 2010.

V. 584. № 19. P 4193-4196.

31. Петровская Л.Е., Шульга А.А., Бочарова О.В., Ермолюк Я.С., Крюкова Е.А., Чупин В.В., Бломмерс М.Ж.Ж., Арсеньев А.С., Кирпичников М.П. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 7. С. 1001-1013.

32. Chowdhury A., Feng R., Tong Q., Zhang Y., Xie X.Q. // Protein Expr. Purif. 2012. V. 83. № 2. P. 128-134.

33. Terpe K. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 60. № 5.

P. 523-533.

34. Klammt C., Perrin M.H., Maslennikov I., Renault L., Krupa M., Kwiatkowski W., Stahlberg H., Vale W., Choe S. // Protein Sci. 2011. V. 20. P. 1030-1041.

35. Zuker M. // Nucl. Acids Res. 2003. V. 31. № 13. P. 3406-3415.

36. Kaiser L., Graveland-Bikker J., Steuerwald D., Vanberghem M., Herlihy K., Zhang S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008.

V. 105. № 41. P. 15726-15731.

37. Michel E., Wflthrich K. // J. Biomol. NMR. 2012. V. 53. № 1.

P. 43-51.

38. Goerke A.R., Swartz J.R. // Biotechnol. Bioeng. 2008. V. 99.

№ 2. P 351-367.

39. Rath A., Glibowicka M., Nadeau V.G., Chen G., Deber C.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 6. P. 1760-1765.