CC BY-ND
13
50
ЗНиСО июль IW (292)
УДК 579.843.1:577.112:616-092
ЛЕКТИНЫ В РЕАЛИЗАЦИИ АНТИЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ
ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ
В.А. Коршенко, И.Я. Черепахина
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора,
Ростов-на-Дону, Россия
Антилактоферриновая активность (АЛфА) является одним из факторов, способствующим персистенции холерных вибрионов в организме человека при формировании вибриононоситель-ства. Показано, что в механизме АЛфА в качестве начального звена, специфически связующего лактоферрин на поверхности микробных клеток, принимают участие лектины холерных вибрионов, обеспечивая тем самым возможность для последующего расщепления этого белка с помощью экзопротеаз возбудителя. Лектины - это протеины или гликопротеины, не относящиеся к классу иммунных, способные к обратимому связыванию с углеводной частью гликоконъюга-тов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов. Являясь гликопротеинами, лектины обеспечивают комплементарное высокоспецифичное углевод-белковое связывание активных центров клеток-мишеней (в частности, лактоферрина). Доказано, что все холерные вибрионы Эль-Тор и Бенгал обладают лектиновыми рецепторами, специфичными для гексоз (особенно, маннозе). Атоксигенные штаммы V. cholerae O1 и О139, наряду с рецепторами гексоз, обладают лектинами, специфичными для аминосахаров. Ключевые слова: лектины, лактоферрин, холерный вибрион, антилактоферриновая активность.
V.A. Korshenko, I.Ya. Cherepakhina □ LECTINS IN THE IMPLEMENTATION OF ANTI-LA CTOFERRIN ACTIVITY OF VIBRIO CHOLERAE □ Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.
Anti-lactoferrin activity (AlfA) is one of the factors contributing to the persistence of V. cholerae in human body in formation of human vibriocarriers. It is shown that in the AlfA mechanism cholera vibrio lectins are participating as an initial link specifically binding to lactoferrin at the surface of microbial cells, providing for subsequent cleavage of this protein with the help of V. cholerae exoproteases. Lectins are proteins or glycoproteins of non-immune class, capable to reversibly bind to the carbohydrate fraction of glycoconjugates without breaking the covalent structure of any of the recognizable glycosyl ligands. As glycoproteins, lectins ensure the complementary highly specific carbohydrate-protein binding of the active sites of target cells (namely lactoferrin). It is proved that all V. cholerae El Tor and Bengal strains possess hexose-specific lectin receptors (especially mannose). Atoxigenic V. cholerae O1 and O139 strains possess, in addition to hexose receptors, lectins specific to aminosugars.
Key words: lectins, lactoferrin, Vibrio cholerae, anti-lactoferrin activity.
Антилактоферриновая активность, один из «маркеров персистенции» холерных вибрионов, способствующая деградации системы защиты хозяина, обеспечивая вибрионам длительное при формировании вибриононоситель-ства выживание в макрорганизме. В основе механизма действия антилактоферриновой активности (АЛфА) лежат процессы, направленные на инактивацию лактоферрина (Лф) микроорганизмом. Рядом зарубежных исследователей установлено, что, преодолевая бактерицидный и бактериостатический эффект лактоферрина, патогены могут решать проблему дефицита железа, отбирая его непосредственно у трансфер-рина и/или лактоферрина [18]. Такой механизм получения железа присутствует у высоко адаптированных бактерий и определяется связыванием белковой молекулы лактоферрина или трансферрина, содержащей железо, с поверхностными рецепторами микроорганизма [15]. A.J. Beddek и A.B. Schryvers [14] показали, что у грамнегативных бактерий существуют поверхностные рецепторы, способные специфически связывать лактоферрин в организме хозяина и экстрагировать железо из лактоферрина в качестве источника железа для размножения.
В качестве биосенсоров, детектирующих определенные углеводные последовательности, могут выступать лектины, являющиеся специ-
фическими лигандами в углевод-белковом взаимодействии [1, 3, 8, 10]. Лектины были обнаружены в растительном, животном мире, а также у микроорганизмов [11, 16].
Лектины - это протеины или гликопротеины, не относящиеся к классу иммунных, способные к обратимому связыванию с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения кова-лентной структуры любых из узнаваемых гли-козильных лигандов [4, 6, 13].
Специфичность взаимодействия лектинов с молекулами определяется характерной углеводной группой, в связи с этим один и тот же лектин может взаимодействовать с различными гликопротеинами, содержащими данную углеводную группу [11]. Лектины, входя в структуру тканей животных, растений, микроорганизмов, принимают участие как в регулировании их метаболизма, так и в защите от некоторых агентов внешней среды.
При этом распознавание «врага» идет с обеих сторон. Так, клеточные лектины, расположенные на мембране или в цитоплазме макроорганизма, узнают патогенные микроорганизмы, связывают их и подавляют рост и размножение; в свою очередь, микроорганизмы с помощью собственных лектинов могут узнавать и связывать субстраты, действующие на возбудителя бактерицидно или бактериостатически.
июль IW (292) ЗНиСО
51
^зс В настоящее время доказано, что все холерные вибрионы Эль-Тор и Бенгал (токсигенные gg и атоксигенные) обладают лектиновыми рецеп-= торами, специфичными гексозам - глюкозе, ^^ маннозе, галактозе; гемолитические атоксиген-ные штаммы V.cholerae О1 и 0139, наряду с ^ рецепторами гексоз, обладают лектинами, специфичными аминосахарам: Д-глюкозамину, Д-галактозамину, N-ацетил-Д-глюкозамину, которые полностью отсутствуют у токсигенных штаммов [6, 9].
На изучение роли лектинов в детекции лак-тоферрина нас побудили сведения P. Rouge, C. Chatelain, D. Pere [17] о белок-углеводной связи маннозоспецифичного растительного лектина кон-канавалина А с трансферрином (сывороточным белком плазмы крови, который, так же как и лактоферрин, входит в группу трансферринов).
Как известно, лактоферрин содержит 3 % гексоз, 1 % гексозамина и особенно богат ман-нозой [5], т. е. потенциальная связь лактофер-рина с лектинами, расположенными на поверхности клеток холерных вибрионов, вполне может быть реализована.
Цель исследования - изучить возможности рецепции лектинов с различными углеводами из группы гексоз (маннозой, глюкозой и галактозой), аминосахаров (Д-глюкозамином и Д-га-лактозамином) и определить на этом фоне уровень антилактоферриновой активности.
Материалы и методы. В работе было использовано восемь штаммов холерных вибрионов: два - V. cholerae О1 c генотипом (ctxAB tcpA ), выделенных от больных холерой; два - V. cholerae 01 c генотипом (ctxAB-tcpA ) - от вибриононосителей; два штамма из речной воды, лишенные генов токсино - и пи-леобразования (ctxAB~tcpA~); один токсигенный штамм V.cholerae 0139, выделенный от больного (ctxAB tcpA ), и один нетоксигенный, выделенный из речной воды, (ctxABtcpA).
Из суточных агаровых культур готовили взвесь микроорганизмов густотой 1 млрд м.к./мл на забуференном физиологическом растворе и смешивали с углеводами, так чтобы конечная концентрация каждого сахара была 1 %. Смеси инкубировали в течение часа при 37 °С. Затем к опытной пробе добавляли раствор лактоферри-на в конечной концентрации 100 нг/мл и оставляли на контакт 18-24 часа. По истечении срока определяли значения лактоферрина в опытных и контрольных пробах и рассчитывали уровень АЛфА. Определение концентрации лак-тоферрина проводили твердофазным иммуно-ферментным методом с использованием тест-системы «Лактоферрин» производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) [2]. Регистрацию результатов осуществляли на фотометре ELx800 BioTek при длине волны 450 нм.
Антилактоферриновую активность выражали в абсолютных величинах - (нг/мл) лакто-феррина, инактивированного микроорганизмом, и рассчитывали по формуле: АЛфА = Кк - Ко, где
АЛфА - антилактоферриновая активность;
Кк — концентрация лактоферрина в контроле;
Ко — концентрация лактоферрина в опыте.
Для интерпретации результатов введены условные значения уровней АЛфА:
0—40 — низкий; 41—70 — средний; от 71 и более — высокий.
О роли лектинов в АЛфА судили по снижению ее уровня после контакта холерных вибрионов с сахарами в результате блокировки ими поверхностных лектиновых рецепторов и как следствие — снижению или отсутствию связи с лак-тоферрином. Результаты представлены в табл. 1.
Результаты исследования. У всех изученных штаммов наблюдалось снижение уровня АЛфА после инкубации с различными углеводами в результате блокировки ими поверхностных лектиновых рецепторов, но в различной степени.
Так, при изучении влияния маннозы на последующее определение АЛфА было показано, что этот углевод обладал наиболее выраженной связующей активностью при взаимодействии как с холерными вибрионами О1 серо-группы, так и с вибрионами 0139 серогруппы, что выражалось впоследствии в резком снижении антилактоферриновой активности как в количественных, так и в процентных показателях: у токсигенных штаммов (е(хЛБ ^рЛ ) О1 серогруппы на 80—81,3 % (15 и 14 нг/мл против 75 нг/мл в контроле), 0139 серогруппы — на 82,1 % (10 нг/мл против 56 нг/мл в контроле).
У нетоксигенных (^ЛБ^ерЛ ) штаммов показатели снижения были также достаточно высокими, но ниже, чем у токсигенных штаммов (69,3—69,6 %; 23—24 нг/мл против 75—79 нг/мл в контроле — у V. еко1егае 01 и 68,4 % (18 нг/мл против 57 нг/мл в контроле) — у V. екоЫтае 0139.
Особый интерес в этом плане вызывают потенциально эпидемически опасные штаммы (^ЛБ-^рЛ ), обладающие, по нашим данным, наиболее высокой АЛфА. У этих штаммов после контакта с маннозой антилактоферриновая активность снизилась на 87,2—88,2 % (12 и 11 нг/мл против 94 и 93 нг/мл в контроле). Эти результаты могут свидетельствовать о роли маннозочувствительных пилей адгезии, являющихся лектинами [12], в связывании лактофер-рина, богатого маннозой.
Достаточно высокой связующей активностью обладали глюкоза и галактоза. После контакта с глюкозой у токсигенных штаммов О1 и О139 серогрупп отмечено снижение АЛфА на 49,3—67,9 % (с 75 и 56 нг/мл соответственно в контроле, до 37—38 и 22 нг/мл в опыте), у аток-сигенных — на 49,4—61,4 % (с 75—79 и 57 нг/мл соответственно в контроле, до 37—39 и 22 нг/мл в опыте). У потенциально патогенных штаммов О1 серогруппы после контакта с глюкозой отмечено снижение антилактоферриновой активности на 54,8—57,4 % (42 и 40 нг/мл против 93 и 94 нг/мл — в опыте).
52
ЗНивО июль М (292)
Таблица 1. Влияние взаимодействия холерных вибрионов с углеводами на уровень АЛфА
Штаммы Источник выделения Место выделения Гены патогенности Сахар АЛфА (нг/мл) Снижение показаний АЛфА (%)
- 75
V. ско1егае Е1 Тог 18374 манноза 15 80,0
больной Казань сХЛВ+1срЛ+ глюкоза 38 49,3
галактоза 40 46,7
Д-глюкозамин 56 25,3
Д- галактозамин 60 20,0
- 75
V. ско1егае Е1 Тог 17471 манноза 14 81,3
больной Кизляр сХЛВ+1срЛ+ глюкоза 37 50,7
галактоза 41 45,3
Д-глюкозамин 57 24,0
Д-галактозамин 59 21,3
- 94
V. ско1егае Е1 Тог 18821 манноза 12 87,2
носитель Каменск сХАВ-гсрЛ+ глюкоза 40 57,4
галактоза 48 49,0
Д-глюкозамин 65 30,9
Д-галактозамин 69 26,6
- 93
V. ско1егае Е1 Тог 18257 манноза 11 88,2
носитель Астрахань сХЛВ- крЛ+ глюкоза 42 54,8
галактоза 45 51,6
Д-глюкозамин 63 32,3
Д-галактозамин 66 29,0
- 75
V. ско1егае Е1 Тог 17899 манноза 23 69,3
вода открытого р. Темерник сХАВКрЛ- глюкоза 37 50,7
водоема галактоза 44 41,3
Д-глюкозамин 47 37,3
Д-галактозамин 53 29,3
- 79
V. ско1егае Е1 Тог 18777 манноза 24 69,6
вода открытого водоема р. Д°н сХЛВКрЛ- глюкоза 39 49,4
галактоза 48 39,2
Д-глюкозамин 50 36,7
Д-галактозамин 52 30,7
- 56
V. ско1егае О139 16065 манноза 10 82,1
больной Азов сХЛВ+1срЛ+ глюкоза 18 67,9
галактоза 31 44,6
Д-глюкозамин 42 25,0
Д-галактозамин 44 21,4
- 57
V. ско1егае О139 18925 манноза 18 68,4
вода р. Ангара сЫЛВ^гсрЛ глюкоза 22 61,4
галактоза 33 42,1
Д-глюкозамин 42 26,3
Д-галактозамин 43 24,6
Галактозоспецифические лектины после взаимодействия с этим углеводом также обусловливали снижение АЛфА, но в более низком проценте, чем при взаимодействии с глюкозой. Так, у (МхЛВ ?срЛ ) штаммов обеих се-рогрупп показатели снижения составляли 44,646,7 % (31 и 40-41 нг/мл - в опыте против 56 и 75 нг/мл - в контроле), у нетоксигенных - 39,242,1 % (33 и 44-48 нг/мл - в опыте против 57 и 75-79 нг/мл - в контроле). Как и при исследовании вышеуказанных углеводов, наиболее активными в отношении галактозы оказались по-
тенциально эпидемически опасные штаммы, у которых наблюдалось снижение АЛфА на 4951,6 % (с 93-94 нг/мл - в контроле до 4548 нг/мл - в опыте).
Что касается аминосахаров (глюкозамина и галактозамина), то выраженного снижения ан-тилактоферриновой активности после контакта с ними не отмечено, при этом более активны-мив этом отношении были нетоксигенные штаммы О1 серогруппы (36,7-37,3 % снижения, с 79 и 75 нг/мл до 47-50 нг/мл после контакта с глюкозамином; 29,3-30,7 % снижения,
июль IW (292) ЗНиСО
Q
до 52-53 нг/мл - после инкубации с галактоза-Is— мином). У токсигенных штаммов показатели снижения были еще более низкими (24,0-= 25,3 %, с 75 до 57 и 56 нг/мл - после контакта с глюкозамином, 20,0-21,3 %, до 60 и 59 нг/мл -^^ с галактозамином). У потенциально патогенных штаммов показатели снижения колебались ^ от 30,9 до 32,3 % (с 94 и 93 до 65, 63 нг/мл) после контакта с глюкозамином и от 26,6 до 29 % (до 66-69 нг/мл) - после контакта с галактоза-мином).
Штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы практически не отличались от вибрионов Эль-Тор (у токсигенного штамма процент снижения активности после контакта с глюко-замином составлял 25,0 % (с 56 до 42 нг/мл), галактозамином - 21,4 % (до 44 нг/мл), у не-токсигенного - 26,3 % (с 57 до 42 нг/мл после контакта с глюкозамином), 24,6 % (до 43 нг/мл) - после галактозамина.
Заключение. Показано, что у всех изученных штаммов наблюдалось снижение уровня АЛфА после инкубации с различными углеводами, но максимально выраженное - в опытах с маннозой, что свидетельствует о потенциальной возможности связи маннозоспецифичных лектинов холерных вибрионов с лактоферри-ном. Поскольку все указанные углеводы являются составной частью лектинов, можно сделать вывод, что в качестве рецепторов они могут принимать участие в реализации АЛфА, связывая лактоферрин, для последующего его расщепления с помощью протеаз [7].
ЛИТЕРАТУРА
1. Алешин В.Н. и др. Лектины: свойства, сферы применения и перспективы исследования / В.Н. Алешин, В.Г. Лобанов, А.Д. Минакова // Известия вузов. 2005. № 1. С. 5-7.
2. Валышева И.В. и др. Новый метод определения антилак-тоферриновой активности микроорганизмов / И.В. Валышева, А.В. Валышев, О.Л. Карташова [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 4. С. 64-67.
3. Гришин А.В. и др. Лектины Pseudomonas aeruginosa как мишени для новых антибактериальных соединений / А.В. Гришин, М.С. Кривозубов, А.С. Карягина, А.Л. Гинц-бург // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2015. Т. 7. № 2 (25). С. 32-45.
4. Игнатов В.В. Углеводузнающие белки-лектины // Соро-совский образовательный журнал. 1997. № 2. С. 14-20.
5. Канышкова Т.Г. и др. Лактоферрин и его биологические функции / Т.Г. Канышкова, В.Н. Бунева, Г.А. Не-винский // Биохимия. 2001. Т. 66. № 1. С. 5-13.
6. Колякина А.В. Лектиновые рецепторы холерных вибрионов: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Ростов-на-Дону. 2009. 18 с.
7. Коршенко В.А. и др. Роль гемагглютинин/протеазы в реализации антилактоферриновой активности холерных вибрионов / В.А. Коршенко, О.В. Дуванова // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер со-вещ. специалистов Роспотребнадзора. Ростов-на-Дону. 2013. Вып. 26. С. 186-188.
8. Лахтин М.В. и др. Лектин-конъюгативные системы в организме человека / М.В. Лахтин, А.В. Караулов,
B.М. Лахтин [и др.] // Иммунология, аллергология, ин-фектология. 2012. № 1. С. 27-36.
9. Ломов Ю.М. и др. Специфичность лектиновых рецепторов холерных вибрионов / Ю.М. Ломов, Н.Р. Телес-манич, А. К. Колякина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. № 6. С. 68-72.
10. Лукьянов П.А. и др. Современная гликобиология и медицина / П.А. Лукьянов, Н.В. Журавлева // Вестник ДВО РАН. 2004. № 3. С. 24-34.
11. Луцик М.Д. и др. Лектины / М.Д. Луцик, Е.Н. Панасюк, А.Д. Луцик. Львов: Вища школа: Изд-во при Львов. ун-те, 1981. 155 с.: ил.
12. Соколов A.B. и др. Исследование рекомбенантного лак-тоферрина человека, секретируемого в молоко трансгенных мышей / A.B. Соколов, М.О. Пулина, А.В. Кристи-ян [и др.] // Доклады Академии Наук. 2006. T. 411. № 2. С. 267-270.
13. Телесманич Н.Р. и др. Роль галактозоспецифичного рецептора - лектина в бактерицидной активности гемолизина Vibrio cholerae не О1/О139 / Н.Р. Телесманич, Е.А. Меньшикова, Е.М. Курбатова, Е.В. Гончарен-ко // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010. № 1. С. 10-14.
14. Beddek A.J. et al. The lactoferrin complex in gram negative bacteria / A.J. Beddek, A.B. Schryvers // Biometals. 2010. Vol. 23. P. 377-386.
15. Gray-Owen S.D. et al. Bacterial transferring and lactoferrin receptors / S.D. Gray-Owen, A.B. Schryvers // Trends Microbiol. 1996. Vol. 4. No. 5. P. 185-191.
16. Netter E. Bacterial hemagglutination and hemolysis / E. Netter // Bacteriol. Rev. 1956. Vol. 20. P. 166-188.
17. Rouge P. et al. Comparation des reaction de precipitation entre les hemagglutinines de trios especes du genre Vicia et les glycoproteines de serum humain normale / P. Rouge,
C. Chatelain, D. Pere // Planta med. 1977. Vol. 31. P. 141145.
18. Valenti P. et al. Lactoferrin: an important host defence against microbial and viral attack / P. Valenti, G. Antonini // Cell. Mol. Life. Sci. 2005. Vol. 62. No. 22. P. 25762587.
Контактная информация:
Коршенко Виктория Александровна, тел.: +7 (863) 234-47-99, e-mail: podroikina@rambler.ru
Contakt information:
Korshenko Viktoriya, phone: +7 (863) 234-47-99, e-mail: podroikina@rambler.ru
V
