CC BY
27
УДК 616.932
Н.Е.Гаевская
ХАРАКТЕРИСТИКА УМЕРЕННЫХ ФАГОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ЭЛЬТОР, ИЗОЛИРОВАННЫХ ОТ ЛЮДЕЙ
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Атоксигенные холерные вибрионы эльтор, выделенные от людей, могут быть использованы для отбора холерных фагов I и V морфогруппы. Умеренные фаги I морфогруппы, продуцируемые атоксигенными холерными вибрионами, обладают узким спектром литической активности в отношении холерных вибрионов 0139 серогруппы.
Холера - острое диарейное заболевание, которое поразило человечество более двух тысяч лет назад и до сих пор остается одной из основных причин заболеваемости и смертности значительного количества людей в различных странах мира [5]. До недавнего времени заболевания холерой вызывались токсигенными штаммами Vibrio cholerae, содержащими гены холерного токсина, однако в последние годы все чаще выделяют штаммы Vibrio cholerae eltor, лишенные генов холерного токсина, но способные вызывать у людей холероподобные диареи различной степени тяжести [12]. Заболевания, вызванные атоксигенными вибрионами, протекают в виде спорадических случаев или локальных вспышек. Они отмечены в Индии, Аргентине, России и ряде других стран [9, 16, 17].
Установлено, что полный набор генов вирулентности (ctxAB, tcpA, toxR) содержат штаммы, выделенные лишь во время эпидемий холеры. Штаммы, изолированные в межэпидемический период, чаще всего лишены генов ctxAB и tcpA.. В этот же период обнаруживаются также нетоксиген-ные штаммы, содержащие гены tcpA и toxR [11, 14]. По-видимому, их этиологическая опасность обусловлена рядом дополнительных токсинов, набор которых и уровни экспрессии могут быть неодинаковыми у разных штаммов [7]. За счет этих факторов патогенности происходят спорадические или групповые вспышки, и длительное время атоксигенные штаммы выявляются в окружающей среде.
В настоящее время уже доказана перспективность использования специфических фагов для идентификации vet" штаммов холерных вибрионов и дифференциации их от vct+ штаммов [8]. Дифференциация vct+ и vet” вибрионов является важной задачей эпидемиологического надзора за холерой, которая осложняется их достаточно большим фенотипическим и генотипическим сходством.
Известно, что нетоксигенные холерные вибрионы эльтор являются носителями, умеренных фагов II, XI и XII серотипов [2]. Выделение умеренных фагов из числа исследуемых неэпидемических штаммов холерных вибрионов вызывает необходимость дальнейшего поиска новых индикаторных культур и диагностических фагов с широким спектром действия. Применение холерных фагов необходимо для комплексной оценки эпидемической
значимости холерных вибрионов.
В коллекции МЖК Ростовского противочумного института собраны атоксигенные штаммы V. cholerae eltor, изолированные от людей. Эти штаммы были выделены на территории России и стран ближнего зарубежья в эпидемически благополучные и неблагополучные по холере периоды в 1969-2000 гг. Вибрионы этой группы были охарактеризованы по фенотипическим и молекулярно-генетическим особенностям [12]. Однако данных по фагочувствительности и лизогении изученных вибрионов, выделенных от людей, а также по чувствительности к умеренным фагам холерных вибрионов 0139 серогруппы недостаточно.
Поэтому целью нашей работы являлась характеристика умеренных фагов, выделенных из атокси-генных штаммов холерных вибрионов эльтор, изолированных от людей.
Материалы и методы
В работе использовали 23 штамма V. cholerae eltor, выделенные от вибрионосителей и больных с разной степенью выраженности диарейного синдрома. Микроорганизмы холерных вибрионов эльтор были типичными по биологическим свойствам, но не содержали гена токсинообразования (ctxAB). Используемые в работе атоксигенные штаммы по молекулярно-генетическим признакам имели различия [12] (табл. 1).
Фаготипирование холерных штаммов проводили по способу, изложенному в методических рекомендациях М.С.Дрожевкиной и Ю.И.Арутюнова [6].
В ходе работы использовали диагностические холерные фаги классический (фаг С), эльтор, ctx+ и ctx”, фаг ФБ, продуцируемый штаммом V. cholerae 0139 ctx+ tcp+, и 11 фагов, выделенных нами из атоксигенных штаммов V. cholerae eltor. В экспериментах в качестве индикаторных для фагов применяли штаммы: V. cholerae cholerae 145, V. cholerae eltor 75M, KM 199 (13169), V. cholerae 0139 KM 152 (16373). Кроме того, для установления спектра лизиса фагов в опытах были использованы 10 токси-генных штаммов V. cholerae eltor и 36 штаммов V. cholerae 0139 серогруппы, из которых 10 (Н-1262, 17625, 17626, 17673, 17674, 17677, 17678, 17684, 17785, 17786) изолированы из внешней среды, остальные получены от людей.
Характеристика штаммов У. cholerae eltor CTX", выделенных от людей, по фаговым тестам
Таблица 1
Инв. № штамма Место, год выделения Чувствительность к фагам Фаго- тип Лизогения (морфо-группа фага) Индикаторные штаммы для фагов
С Эльтор ctx+ ctx" ФБ V. cholerae 145 V. eltor 75 M - V. eltor KM 199(13169) V. cholerae 0139 KM 152 (16373)
ctxAB" zot" асе" tcpA" rstA" rstC toxR* rtxA* rtxC+ hap*
2105 Ростов. обл.,х. Веселый, 1969 - - - ■ - + 16 + (V) + + - -
4161 Донецкая обл., 1971 - + - - + h/t + (I) - - + +
4178 Донецк, 1971 - + - + - 14 - ' - - -
4346 Донецкая обл., 1971 - - + - 10 - - - -
4349 Донецкая обл., 1971 - + - + + 14 - - - -
5244 Донецк, 1972 - + - - + h/t + (1) - - + +
5245 Донецк, 1972 - + - - + h/t + (1) - - + +
5277 Иолотань, Туркмения, 1971 - + - - + h/t + (D - - + +
5464 Ростов-на-Дону, 1972 - + - - - + h/t - - - - -
5478 Жданов, 1972 - . + + - + 15 - - - - -
5766 Крым, 1972 - + - - + 15 + (V) + - + -
6119 Крым, 1973 - + + - + 15 + (V) + + - -
6932 Астраханская обл., 1972 - - + + 16 - - - - -
7930 Одесская обл., 1974 - - - - - h/t + (V) + - - -
9082 Керчь, 1975 - - - - + - 16 + (V) + + - -
9898 Краснодар, 1977 - - + + h/t •■ + (!)• , -, . + +
9945 Чарджоу, Туркмения, 1977 - - - + + 15 - - - - - ■
9967 Чимкент, Казахстан, 1977 - ■ + - + . + h/t + № - - + +
14197 Грузия, 1981 - + + + 13' - ■ - -
14213 Ташауз, Туркмения, 1976 - - + - h/t ■ - - ■ - ■ -
18250 Кировская обл., 2000 - -■ - + + h/t - - -
13765
13767
Хорезмская обл., Узбекистан, 1988
Хорезмская обл., Узбекистан, 1988
ctxAB" zot асе" tcpA+ rstA rstC" toxR+ rtxA* rtxC+ hap+ -i- + - + h/t ' ■ -
+ + - + h/t ' -
Примечание. «+» - наличие признака, «-» отсутствие признака, н/т- фаготип не определяется.
Выделение фагов и изучение их биологических свойств проводили по общепринятым методам, адаптированным к работе с холерными фагами [1]. Строение корпускул фагов исследовали в электронном микроскопе системы 1еш-100В при увеличении 80 тыс. раз по методу, изложенному ранее [3].
Питательные среды для экспериментов включали бульон и 0,7, 1,5 % агар Мартена, pH 7,6-7,8.
Результаты и обсуждение
В начале исследований определена фагочувст-вительность отобранных атоксигенных холерных штаммов к диагностическим холерным фагам -классическому (фагу С) и эльтор. Как видно из табл. 1,| все культуры трех групп маркированных штаммов резистентны к классическому фагу, а фагом эльтор лизировалось 65 % штаммов V. ско1егае еНог. К фагу йх+ чувствительны 26 % культур, а к фагу с(х” - 39 %. 8 штаммов V. сИо1егае еког резистентны к обоим фагам (с1х+, с1х~). Фагом ФБ про-лизировалось 78 % культур вибрионов эльтор.
: По| фаготипу культуры V. ско1егае еког распре-
делились следующим образом: 4 штамма имели 15-й фаготип, 3 штамма - 16-й; 2 штамма - 14-й и по одному штамму - 10 и 13-й, у 12 штаммов фаготип не определялся.
I Следующим этапом наших исследований было изучение атоксигенных штаммов V. с1го1егае еког на наличие'лизогении. В ходе опытов из 11 штаммов V. с!го1егае еког выделены умеренные фаги (табл. 1). При электронной микроскопии одни фаги были ни-
тевидной формы и отнесены к I морфогруппе по А.С.Тихоненко [13], у других - наблюдали многогранную головку и отросток с сокращающимся чехлом. Размеры фаговых корпускул V морфогруппы составляли 82,0—135,5 нм. Из 6 штаммов изолированы фаги I морфогруппы XII серотипа, а из 5 - V морфогруппы II серотипа. Все фаги I морфогруппы лизировали индикаторный штамм V. cholerae 0139 серогруппы - КМ 152 (16373). Фаги V морфогруппы отличались между собой по лизабельности индикаторных штаммов 01 серогруппы и не лизировали холёрный вибрион 0139 серогруппы.
В дальнейшем мы изучили чувствительность двенадцати атоксигенных нелизогенных культур V. cholerae eltor к выделенным умеренным фагам (табл. 2)..Три штамма (4349, 14213, 18250) лизиро-вались фагами II серотипа 5766, 6119 и 9082. Остальные культуры по фагочувствительности отличались друг от друга. Два фага 5244 и 5245 имели узкий диапазон литической активности, проявляясь на индикаторном штамме V. cholerae eltor 13169 ctx" tcp+. Три штамма V. cholerae eltor (4178, 5464, 6932) были фагорезистентными.
Изучение спектра лизиса выделенных умеренных фагов на десяти токсигенных штаммах V. cholerae eltor показало (табл. 2) фагочувствитель-ность четырех штаммов и резистентность остальных культур к данным фагам. Штаммы 381 и 517/130 лизировались одним фагом 5277, штамм 75- двумя фагами 2105 и 6119, в то время как штамм 12025 - тремя фагами 5245, 5277 и 7930.
Чувствительность атоксигенных и токсигенных штаммов V. cholerae eltor к выделенным умеренным фагам
Таблица 2
Штаммы
V. cholerae eltor
Фаги, выделенные из штаммов V. cholerae eltor
І морфогруппа V морфогруппа
4161 1 5244 1 . 5245 | 5277 | 9898 2105 1 5766 1 6119 1 7930 | 9082 | 9967
Атоксигенные
4178,5464, 6932 4346
4349, 14213, 18250
5478
9945
13765
13767
14197
75
381,517/130 757, 1861,2044, 3119,5879, 9312/1
12025
+
+
+
+
+
+
+ + ' + + +
+
Токсигенные
Примечание. Номера фагов соответствуют номерам лизогенных штаммов, из которых они выделены; «+» - наличие признака; «-» - отсутствие признака.
Наибольшую литическую активность в отношении токсигенных штаммов проявил фаг 5277.
В табл. 3 представлены результаты взаимодействия штаммов V. с!го1егае 0139 серогруппы со свежевыделенными умеренными холерными фагами. Как видно из таблицы, все умеренные фаги, проявляющие литическую активность по отношению к холерным вибрионам 0139 серогруппы, частично лизировали штаммы, выделенные от людей, и были не активны к штаммам, изолированным из внешней среды. Из 36 штаммов V. ско1егае 0139, взятых в исследования, лизировались 6 токсигенных
штаммов. При этом культуры 0139 серогруппы были представлены двумя группами: чувствительные и резистентные к фагам I морфогруппы. Наибольшее число штаммов V. с!го1егае 0139 лизировалось фагом 5277 (17 %). Количество лизированных
штаммов фагами 4161 и 5244 составило 11 и 6% соответственно. Наименьшей литической активностью обладал фаг 9967 (3 %).
Заслуживают интереса три культуры V. сИо1е-гае 0139 серогруппы, выделенные в г. Азове. Эти штаммы по чувствительности к фагам отличались друг от друга, если штамм Р-16064 лизировался фа-
Чувствитсльпость штаммов 0139 серогруппы к выделенным умеренным фагам
Таблица 3
Холерные вибрионы 0139 серогруппы
Место выделения
Фаги, выделенные из атоксигенных штаммов V. cholerae eltor
2105,5245,5766,6119,7930,9082,9898 1 4161 | 5244 | 5277 | 9967
ctx* tcp*
P-16063 Россия, Азов, 1993 - - - +
P-16064 - + - +
P-16065 - - - -
P-16I3I Россия, Ростов-на-Дону, 1993 - - - -
1306 Киргизия, Бишкек, 1994 - + - +
1311 Киргизия, Токмак, 1994 - - - -
АР 1, AP2 Индия, Andhra Pradesh, 1992 - - -
VO 15, VO 20 Индия, Vellore, 1992 - - - -
SG 24, SG 25 Индия, Calcutta, 1992 - - - -
MDO 12 Индия, Madurai, 1992 - + + +
MDO 25 - - - -
PO 2 Индия, Maharashtra, 1992 - - - +
PO 7 - - - -
MO 28 Индия, Madras, 1992 - + + +
MO 45 (Япония) - - - -
55,59, 62,70,71,88 Получены из Франции, Париж, ин-т Пастера, 1994 ctx" tcp-
H-1262, 17673, 17674, 17785,17786 Россия, Новосибирск, 1996-1977 - - ■ ■
17625, 17626,17677, 17678,17684 Россия, Москва, 1977 - - - -
Примечание. Номера фагов соответствуют номерам лизогенных штаммов, из которых они выделены; «+» - наличие признака; «-» - отсутствие признака.
гами 4il 61 и 5277, то штамм Р-16063 был чувствителен только к фагу 5277, а штамм Р-16065 был резистентным ко всем фагам, что говорит об их отличительных особенностях, хотя они изолированы в одном месте в один и тот же период времени (Азов, 1993 г.). В этом же аспекте интерес представляют штаммы MDO 12, МО 28 и РО 2, которые изолированы на территории Индии в 1992 г. Штамм MDO 12 оказался чувствителен ко всем изученным фагам, штамм МО 28 только к трем, а штамм РО 2 - к одному. А из 10 авирулентных штаммов, чувствительных к фагам, не обнаружено.
Установлено, что 22 атоксигенных холерных вибриона эльтор, различающихся по генетическим маркерам, имели различную чувствительность к диагностическим холерным фагам: эльтор, ctx+, ctx", ФБ, и лишь штамм 7930 был резистентным ко всем вышеперечисленным фагам. Изолированные от людей на, пяти различных территориях с 1969 по 2000 год атоксигенные холерные штаммы имели, разнообразные фаготипы.
Результаты наших опытов показывают, что штаммы V. cholerae eltor относятся к пятому, шестому и седьмому вариантам схемы оценки эпидемической значимости холерных вибрионов по чувствительности к бактериофагам ctx+ и ctx". Для оценки эпидемической значимости этих штаммов проводились дополнительные исследования на наличие генов ctxAB, tcpA и токсигенности на крольчатах-сосунках, которые показали, что у двух штаммов отсутствует ген ctx АВ, а у остальных гены ctx АВ и tcpA, и все культуры атоксигенны.
В исследования были взяты штаммы V. cholerae 0139 серогруппы, которые, как установлено ранее [4], устойчивы к диагностическим холерным фагам. Изолированные нами фаги I морфогруппы из штаммов холерных вибрионов эльтор обладали узким спектром литической активности в отношении этой группы вибрионов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Адамс М. Бактериофаги / Пер. с англ. - М., 1961. -522 с. - 2. Караваева- Т.Б. Дифференциация эпидемических и
неэпидемических вибрионов эльтор по типу иммунитета их умеренных фагов: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1993. - 23ic.-3. Кудрякова Т. Д., Саямов С.Р.//Микробиол. журн. - 1993. - Т. 55, № 1. - С. 53-57. - 4. Кудрякова Т.А., Мишанькин Б.H., Македонова Л.Д. и др. // Матер. юбил. науч. конф., поев. 50-летию Центра военно-технич. пробл. биол. защиты НИИ Микробиол. МО РФ. - Екатеринбург, 1999. - 5. Ломов Ю.М. // Холера: Матер. VIII Рос. на-уч.-практ. і конф. по пробл. «Холера». - Ростов н/Д, 2003. -С. 13-23. т 6. Методические рекомендации по фаготипиро-ванию холерных вибрионов / Сост.: Дрожевкина М.С.. Арутюнов Ю.И. jr М., 1983. - 10 с. - 7. Монахова Е.В., Михась Н.К., Писанов Р.В. // Пробл. особо опасн инф. - 2004.-Вып. 87. -!С. 51-54. - 8. Остроумова Н.М., Мороз В.П., Караваева Т.Б. // ЖМЭИ. - 1993. - № 4. - С. 116-120. -
9. Савелиев В.Н. // Холера: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. «Холера». - Ростов н/Д, 2003. - С. 244-245. -
10. Смирнова Н.И. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. -1999. -№'4. - С. 3-11.-11. Смирнова Н.И., Костромити-на Е.А., Челдышева Н.Б. и др.//Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 2002.-№ 4. - С. 12-18. - 12.Смоликова Л.М., Монахова Е.В., Кудрякова Т.А. и др. // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов н/Д, 2004. - Вып. 17. -С. 65-67. - 13. Тихоненко A.C. Ультраструктура вирусов бактерий. - М., 1968. - 170 с. - 14. Karaolis D.K.R., Johnson J., В а і 1 е у С.С. et al. II Proc. Nat. Acad. Sei. USA. -1998. - Vol. 95. - P. 3134-3139. - 15. Li M., Kotetishvili M., Chen Y.,-' Sözhamannan S. // Appl. Environ. Microbiol. -2003.-Vol. 69, N3.-P. 1728-1738. - 16. Pal A., Saha P.K., Nair G.В. et.al. II Indian J. Med. Res.- 1999. - Vol. 109. -P. 208-211.' - 17. Pichil M., Rivas M., Chinen I. et al. II J. Clin. Microbiol. -2003. - Vol. 41, N 1. -P, 124-134.
N.E.Gajevskaya
Characterization of Temperate Bacteriophages Derived. from1Non-Toxinogenic Vibrio cholerae El Tor Strains Isolated from Patients
.. Rqstov-On-Don Anti-Plague Research Institute
| J
Non-toxinogenic cholera El Tor vibrios isolated from human patients may be used! to make selections for 1 and V morphologic groups' phages. Temperate bacteriophages morphogroup I produced by non-toxinogenic cholera vibrios were found to manifest a narrow scope of lytic activity for V. cholerae serogroup 0139.
Поступила 26.01.05..
УДК 616.932:575
Г.А.ЕРОШЕНКО, Е.Ю.ЩЕЛКАНОВА
ПОЛИМОРФИЗМ УЧАСТКА ДНК, ФЛАНКИРУЮЩЕГО ГЕНЫ БИОСИНТЕЗА О-АНТИГЕНА, У ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE НЕ 017 НЕ 0139
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
В геноме штаммов V. cholerae не 01 / не 0139 (02, 037, 041, 042, 043 и 056 серогрупп), выделенных от больных людей в Российской Федерации и других странах СНГ, присутствуют гены rjg, gmhD и orf2, которые фланкируют кластер генов биосинтеза О-антигена. Выявлен полиморфизм участка ДНК, содержащего gmhD и orf2, что свидетельствует о вариабельности структуры этого генетического локуса у холерных вибрионов разных серогрупп.
Вид Vibrio cholerae представляет собой генетически неоднородную группу вибрионов, которая делится на 206 серогрупп в зависимости от антиген-
ных свойств поверхностных полисахаридов. Большие эпидемии холеры связаны, в основном, с вибрионами 01 серогруппы, которые также генетиче-
