CC BY
34
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616.932:575
Г.А.Ерошенко, Л.М.Куклева, Н.Ю.Шавина, В.В.Кутырев
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ НЕ О1 / НЕ 0139 СЕРОГРУППЫ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ В АСТРАХАНИ В 1976-2003 гг.
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Установлено, что штаммы V. cholerae не О1 / не О139 серогруппы, циркулирующие на территории Астраханской области, лишены генетических детерминант основных факторов вирулентности, расположенных на мигрирующих генетических элементах. Они содержат лишь те из известных в настоящее время генов V. cholerae, которые необходимы для жизнедеятельности холерных вибрионов и их персистенции в условиях внешней среды.
Ключевые слова: холерные вибрионы не О1 серогруппы, гены вирулентности, мигрирующие генетические элементы, эпидемический потенциал.
В настоящее время возбудителями холеры признаны только токсигенные холерные вибрионы 01 и О139 серогрупп. Вибрионы других (не О1 / не 0139) серогрупп, как считается, способны вызывать лишь отдельные случаи или небольшие вспышки холероподобных заболеваний. По последним данным, слабопатогенные холерные вибрионы не О1 / не 0139 серогруппы представляют собой достаточно неоднородную группу вибрионов с различным набором генов вирулентности [1, 10, 20]. Эти вибрионы не имеют филогенетического родства с ток-сигенными и эпидемически опасными штаммами О1 и 0139 серогрупп, но они могут получать от последних различные факторы вирулентности, расположенные на мигрирующих генетических элемен -тах (МГЭ), таких как умеренный нитчатый холерный бактериофаг CTXphi, который содержит гены ctxAB, zot и ace, кодирующие биосинтез холерных токсинов - CT, Zot и Ace, а также нитчатый бактериофаг RS1phi с геном rstC - активатором транскрипции генов ctxAB [6, 19, 22]. Основной фактор колонизации V. cholerae - токсинкорегулируемые пили адгезии (TCP) - кодируется опероном tcpA-E, который вместе с регуляторным геном toxT и геном альдолазы aldA, входят в состав острова патогенности VPI [6, 16]. Второй остров патогенности VPI-2 содержит структурный ген nanH нейраминидазы, имеющей большое значение в патогенезе холеры. У возбудителя холеры имеется еще один генетический элемент - остров персистенции EPI, который включает в себя оперон msh, необходимый для биосинтеза маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии (MSHA) и образования биопленки [7, 15]. Биопленка является трехмерной структурой, представляющей собой массивное скопление клеток и позволяющей популяции вибрионов противостоять агрессивному воздействию внешней среды.
Часть генов, ассоциированных с вирулентностью холерных вибрионов, располагается в составе основной или «коренной» части хромосомы. К ним относится регуляторный ген toxR, контролирующий функцию более 20 различных генов, в том числе и генов вирулентности, ген rtx токсина RTX и ген hapA, кодирующий растворимую гемагглютинин-протеазу (HAP) [6, 19].
В отечественной и зарубежной литературе встречаются сообщения о переносе генов, ассоции-
рованных с вирулентностью, в штаммы V. cholerae [3, 13]. 8.М.Рагцдце et al. [13] получили эксперимен-тальным путем вирулентный штамм 0139 серогруппы из атоксигенного, но образующего ТСР вибриона в результате заражения его бактериофагом СТХрЫ, несущим гены СТ [13]. Показана возможность передачи этого бактериофага в штамм 0141 серогруппы [11], а также случаи переноса в штаммы не О1 серогруппы других МГЭ [9, 19]. Таким образом, штаммы не 01 серогруппы, содержащие часть генов вирулентности, могут представлять собой повышенную опасность, поскольку на их основе могут образовываться штаммы с полным набором генов вирулентности. По данным зарубежных ученых, штаммы V. cholerae не О1, выделяемые на эндемичных по холере территориях, содержат различные наборы генов вирулентности и персистенции и являются природными резервуарами этих генов [17].
На территории Российской Федерации часто регистрируются заболевания, вызываемые вибрионами не О1 / не 0139 серогруппы, в том числе значительные количества этих вибрионов практически ежегодно выделяются от людей с различными формами гастроэнтеритов в Астрахани. Генетические особенности таких штаммов остаются к настоящему моменту малоисследованными. Не вполне определен их эпидемический потенциал. В связи с этим целью нашей работы было исследование генетических особенностей штаммов не О1 / не О139 серо-группы, выделенных от больных людей в Астрахани в 1976-2003 гг., и изучение распространения в популяции этих штаммов генов, ассоциированных с вирулентностью V. cholerae. Исследование таких штаммов представляет собой важную научно-практическую задачу, поскольку позволит оценить их эпидемический потенциал и возможность образования на их основе новых патогенных штаммов.
Материалы и методы
В работе использованы штаммы, полученные из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб». Все они выделены от больных людей с гастроэнтеритами различной тяжести. Штаммы выращивали на бульоне и агаре Хоттингера, рН7,6. Препараты ДНК штаммов получали кипячением бактериальной взвеси в концентрации 10 - м.к. в 1 мл
дистилированной воды в течение 30 мин, затем цен -трифугировали в течение 10 мин при 12000 об./мин и использовали в реакции амплификации со специфическими праймерами на отдельные гены [2, 4, 5], а также в RAPD ПЦР со случайными праймерами [5]. Амплификацию фрагментов генов проводили на программируемом термостате «Терцик» (ДНК Технология). Учет результатов осуществляли методом электрофореза в 2 % агарозном геле с последующим просмотром гелей при УФ освещении и регистрировали с помощью фотодокументирующей системы («BioRad»).
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы было изучено распространение у штаммов не О1 / не О139 серогруппы, выделенных в 1976-2003 гг. в Астрахани от больных людей, генов основных факторов вирулентности возбудителя холеры - CT и TCP, кодируемых соответственно умеренным холерным бактериофагом CTXphi и островом патогенности VPI. Тестирование 27 штаммов, выделенных в Астрахани, со специфическими праймерами на гены ctxAB, zot, ace [2, 4, 5], показало, что ни один из штаммов не содержал CTXphi и, следовательно, не мог образовывать холерного токсина, а также токсинов Zot и Ace. В геноме тестированных штаммов отсутствовал и другой нитчатый фаг RS1phi, являющийся сателлитом первого бактериофага и включающий ген rstC - активатор транскрипции генов ctxAB. В ПЦР с праймерами на ген rstC все изученные штаммы дали отрицательный результат. Таким образом, анализ штаммов из Астрахани показал, что они не содержат генов биосинтеза CT и генов других холерных токсинов.
Тестирование штаммов на присутствие острова патогенности VPI, кодирующего второй основной фактор патогенности - TCP, проводили в ПЦР на гены кластера tcp, регуляторного гена toxT и гена альдолазы aldA. Единственным штаммом из 27 изученных, у которого тестировались гены VPI, был V. cholerae 14520, выделенный в Астрахани в 1976 г. У него выявлены гены tcpP/H, кодирующие регуляторные белки TcpP/H, которые принимают участие в регуляции вирулентности V. cholerae. В то же время гена tcpA структурной субъединицы TCP у штамма 14520 не обнаружено. Возможно, что этот штамм содержит другую аллель гена tcpA, которая часто присутствует у штаммов, выделяемых из внешней среды [14, 17]. В геноме V. cholerae 14520 есть и другой ген острова VPI - ген альдолазы aldA, но отсутствует регуляторный ген toxT, который играет важную роль в регуляции вирулентности V. cholerae. По-видимому, в штамме 14520 содержится неполный остров патогенности VPI, который отличается по составу генов от VPI вирулентных штаммов О1 и О139 серогрупп. О присутствии неполных островов VPI в геноме холерных вибрионов, изолированных за рубежом и в России, ранее сообщали и другие авторы [5, 14, 17]. Остальные 26 штаммов не О1 / не О139 серогруппы, выделенные в Астрахани от больных людей, генетических маркеров острова VPI не имели, что свидетельствует о его отсутствии у этих штаммов.
Далее в нашей работе было проведено изучение присутствия в геноме штаммов не О1 / не О139 се-рогруппы второго острова патогенности VPI2 и
островов пандемичности VSPI и VSPII [5, 17]. Генетическим маркером острова VPI является ген nanH, кодирующий продукцию нейраминидазы, имеющей большое значение в патогенезе холеры. Присутствие этого гена установлено только у штамма 14520 и у контрольного вирулентного штамма Р16064 серогруппы 0139, в то время как у всех других использованных в работе штаммов он отсутствовал. Ни у одного из штаммов, включая и 14520, не выявлено островов пандемичностиVSPI и VSPII, которые впервые были обнаружены у вирулентных вибрионов биовара эльтор, возбудителей текущей седьмой пандемии холеры и у второй эпидемической серогруппы V. cholerae 0139 (в том числе выявлены нами и у штамма Р16064).
Таким образом, изучение распространения генов, непосредственно связанных с вирулентностью и расположенных на МГЭ у штаммов, выделенных от больных людей в Астраханской области, показало, что подавляющее большинство штаммов лишено этих генов. Встречаются лишь единичные штаммы (14520), которые не несут генов основных факторов вирулентности (ctxAB, tcpA, toxT), но содержат некоторые из генов, ассоциированных с вирулентностью (aldA, tcpP/H, nanH). Происхождение таких штаммов как 14520 неизвестно. Возможно, они завезены на территорию России из-за рубежа.
На втором этапе работы нами исследовано распространение генов, связанных с выживанием и персистенцией вибрионов, а также генов, расположенных в составе основной части хромосомы. В последнее время большое значение уделяется изучению механизмов выживания вибрионов во внешней среде, в том числе и вирулентных вибрионов, которые могут сохраняться в водных экосистемах в межэпидемический период [7, 18, 21]. Важную роль в этом играет способность вибрионов образовывать трехмерную биопленку, которая обеспечивает коллективную устойчивость вибрионов к агрессивному воздействию внешней среды. Структурный и секреторный опероны генов msh, кодирующих биосинтез и секрецию MSHA, образующих биопленку, расположены на острове персистенции EPI. Проведенное нами тестирование штаммов не О1 / не О139 серо-группы показало, что гены msh выявляются у части штаммов не О1 / не О139 серогруппы, циркулирующих в Астрахани. Ген mshQ выявлялся у штамма 14520, выделенного в 1976 г., а также у 33 % штаммов не О1 / не О139 серогруппы, изолированных в Астрахани в 2000 г., и у 50 % штаммов 2002 г. выделения. У других штаммов, полученных в 1976 г., и у всех штаммов 1981, 1999 и 2003 гг. гены msh не обнаружены. Вероятно, наличие этих генов способствует выживанию вибрионов во внешней среде, но оно, по-видимому, не является обязательным, поскольку вибрионы, лишенные генов msh и не образующие биопленку, также успешно перси-стируют во внешней среде.
В процессах регуляции жизнедеятельности и вирулентности у вирулентных вибрионов важнейшую роль играют гены toxR и hapA. Ген toxR регулирует функцию 20 различных генов у V. cholerae. Проведенное нами ПЦР тестирование штаммов не О1 / не О139 серогруппы с праймерами на toxR показало, что он имеется у всех изученных штаммов. Выявлен у всех изученных штаммов и ген hapA, кодирующий многофункциональный белок HAP, уча-
ствующий, в том числе, и в реализации вирулентности V. cholerae [21]. По-видимому, ToxR и HAP жизненно необходимы для холерных вибрионов, и нарушение их генов значительно снижает жизнеспособность вибрионов. У всех штаммов не О1 / не 0139 серогруппы, выделенных в Астрахани, присутствовал кластер генов rtx, кодирующий биосинтез распространенного бактериального токсина RTX. Следовательно, все изученные штаммы содержали гены toxR, hapA и rtx, расположенные в основной части хромосомы. По-видимому, эти гены являются «древними» генами, издавна присущими холерным вибрионам.
В результате проведенных исследований выявлены следующие генотипы у вибрионов не О1 / не 0139 серогруппы, выделенных в Астрахани с 1976 по 2003 год, и контрольного штамма Р16064, изолированного в 1994 г. в Ростовской области:
1) ctxAB+zot+ace+(CTXphi)--rstC (RS1Phi)--tcpA+
tcpP/HraldA+toxT*(yPI)-+-nanHr(VPI2)--mshQ+(EPI)--attRS^-rtxA+--toxR+-hap+ (шт. Р16064 серогруппы
0139, Ростовская обл., 1994),
2) tcpP/H+aldA+(VPI)--nanH+(VPI2)--mshA/Q+ (EPI)--attRS+ -rtxA+--toxR --hap+ (шт. 14520, Астрахань, 1976),
3) —mshQ+(EPI)--attRS+--rtxA+--toxR+--hap+ (Астрахань, 2000, 2002),
4) ——————————————————————————————rtxA +--toxR +——hap+
(Астрахань, 1976, 1981, 1999, 2000, 2002, 2003).
На рис. 1 представлено схематическое изображение содержания различных генов у штаммов, выделенных в Астрахани в 1976-2003 гг.
Изучение распространения генов вирулентности, а также генов, связанных с жизнедеятельностью клетки, у штаммов V. cholerae не 01 / не 0139, изолированных от больных людей в Астрахани в 19762003 гг., показало, что подавляющая часть этих штаммов не содержит МГЭ - фагов CTXPhi и RS1Phi, островов патогенности VPI и VPI2 и панде-мичности VSPI и VSPII, и ассоциированных с ними генов вирулентности - ctxAB, zot, ace, tcp, rstC, toxT, aldA и nanH. Но некоторые из вибрионов не 01/ не 0139 серогруппы содержат остров персистенции EPI, и все вибрионы несут гены, которые необходимы для жизнедеятельности вибрионов. Таким образом, популяция вибрионов не 01 / не 0139 серогруп-пы, циркулирующая в Астрахани и вызывающая гастроэнтериты у людей, является по изученным нами генам типично «водной» и в настоящее время не представляет эпидемической опасности. Штаммы, лишенные всех известных МГЭ с основными и второстепенными факторами патогенности, не могут
1 ",и 1 I r.zw. 11 ТІ J — 1 II
1 'LK- 1 1 II чу "JJ-'iôV. іу C-v-* -к* ы 1 1 -JÏ*| 1 « 1
1 іль-інс- CV-а iïJ- ïi 1 1 їі-л 1 1 1
jj|£ 1 U-Ji 1 1 -n 1
I-
г! | | =* | | л
дать начало новому высоковирулентному штамму, даже в случае приобретения ими одного из факторов вирулентности. Однако эти данные не следует экстраполировать на все вибрионы не О1 серогруппы, выделяемые в различных регионах и в разные годы. По данным зарубежных исследователей, вибрионы не О1 / не 0139 серогруппы, циркулирующие на эндемичных по холере территориях, являются природными резервуарами генов вирулентности и содержат различные их комбинации, которые на фоне интенсивного генетического обмена могут привести к образованию новых вирулентных штаммов не О1 серо-группы [7, 13]. По данным отечественных исследователей, состав водных вибрионов в водоемах в Российской Федерации может значительно пополняться штаммами с различным набором генов вирулентности в эпидемический период [5].
Чтобы установить имеют ли штаммы не О1 / О139, вызывающие заболевания у людей, общее происхождение, мы провели молекулярное ти-пирование штаммов, выделенных в Астрахани в 2000 и 2002 гг. (рис. 2). Для этого мы применили ЯЛРБ ПЦР с использованием случайного праймера 1281 [5]. Как видно из рис. 2, штаммы, выделенные в 2000 г. (дор. 1-6) и в 2002 г. (дор. 7-9) имеют разные профили амплификации в ЯЛРБ ПЦР, что служит доказательствам отсутствия близкого генетического родства между ними. Из этого следует, что заболевания людей в Астрахани в 2000 и 2002 гг. были вызваны разными вибрионами, не имеющими клонального родства. Исключение составили лишь два штамма, выделенные в 2000 г., -V. ско1егав 407 и 408, которые имели одинаковые профили амплификации (дор. 4 и 5) и, следователь -но, одинаковое происхождение. Из рисунка также видно, что все штаммы не О1 / не О139 серогруппы не имеют клонального родства со штаммами О1 се-рогруппы биовара эльтор (дор. 10 и 11), вызвавшими текущую седьмую пандемию холеры.
Таким образом, следует заключить, что штаммы V. ско1егае не О1 / не О139 серогруппы, циркулирующие на территории Астраханской области, не имеют генетических детерминант основных факторов вирулентности, расположенных на МГЭ, а содержат лишь
і ■■ ■( j f < .'м
Рис. 2. Результаты КЛРБ-ПЦР (с праймером 1281) штаммов не О1 / не О139 серогруппы, выделенных в Астрахани (1-6 - в 2000 г., 7-9 - в 2002 г.), и вирулентных штаммов О1 серогруппы биовара эльтор (10 - Т-23, Индия, 1962; 11 - 9352, Восточный Пакистан, 1969)
Рис. 1. Схема генотипов штаммов не О1 серогруппы:
1 - вирулентный штамм Р16064 серогруппы О139 (Ростовская обл., 1994 г.) и выделенные в Астрахани штаммы не О1 / не О139; 2 - штамм 14520 (Астрахань, 1976 г.); 3 - 7 штаммов (Астрахань 2000, 2002 гг.);
4 - 19 штаммов (Астрахань 1976, 1981,1999, 2002, 2003 гг.)
те из известных в настоящее время генов V. cholerae, которые необходимы для жизнедеятельности холерных вибрионов и их персистенции в условиях внешней среды. В то же время следует отметить, что остаются не установленными те факторы вирулентности и колонизации, которые позволяют вибрионам не О1 / не О139 серогруппы вызывать заболевания у людей. В последних публикациях показано, что важную роль в этом может играть энтеротоксин вибрионов не О1 / не О139 серогруппы, который отличается от холерного токсина [8], а также система секреции III типа, выявленная у некоторых «водных« вибрионов, выделенных от людей [12]. Так ли это, покажут дальнейшие исследования, направленные на изучение генетических особенностей штаммов V. cholerae не О1 / не О139.
Работа поддержана грантом РФФИ № 05-0448727.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Покровский
B. И. и др. // Акт. пробл. холеры. - М., 2000. - С. 62-126. -2. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 97-103. - 3. Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Ерошенко Г.А. и др. // Биотехнол. - 2004. - № 3. -
C. 12-18. - 4. Осин А.В., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. // Генетика. - 2005. - Т. 41, № 1. -
С. 1-10. - 5. Смирнова Н.И., Костромитина Е.А., Осин А.В., Кутырев В.В. // Вестник РАМН. - 2005. -№ 7. - С. 19-24. - 6. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. // Мол. генет. - 2006. - № 1. - С. 9-19. - 7. Alam M., Sultana M., Nair G.B. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. -Vol. 72. - P. 2849-2855. - 8. Begum K., Ahsan C.R., Ansa-ruzzaman M. et al. // Cell. Mol. Immunol. - 2006. - Vol. 3. -P. 115-121. - 9. Burrus V., Waldor M.K. // J. Bacteriol. -2006. - Vol. 55. - P. 173-183. - 10. Chakraborty S., Mukho-
padhyay A.K., Bhadra R.K. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol. 66. - P. 4022-4028. - 11. Dalsgaard A., Serichantalergs O., Forslund A. et al. // J. Clin. Microbiol. -2001. - Vol. 39. - P. 4086-4092. - 12. Dziejman M., Serruto
D., Tam V.C. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. -Vol. 102. - P. 3465-3470. - 13. Faruque S.M., Asadulghani, Rahman M.M. et al. // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68. -P. 4795-4801. - 14. Faruque S.H., Kamruzzaman M., Me-raj I.M. et al. // Infect. Immun. - 2003. - Vol. 71. - P. 10201025. - 15. Faruque S.H., Biswas R., Udden S.M. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 103. - P. 6350-6355. -16. Jermyn W.S., Boyd E.F. // Microbiology. - 2005. - Vol. 151 (Pt 1). - P. 311-322. - 17. Li M., Kotetishvili M., Chen Y., Sozhamannan S. // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. -Vol. 69. - P. 1728-1738. - 18. Matz C., McDougald D., Moreno A.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 102. -P. 16819-16824. - 19. O’Shea Y.A., Reen F.J., Quirke A.M., Boyd E.F. // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 10. -P. 4657-4671. - 20. Sharma C., Thungapathra M., Ghosh A. et al. // J. Clin. Microbiol. - Vol. 36. - P. 756-763. - 21. Silva A.J., Leitch G.J., Camilli A., Benitez J.A. // Infect. Immun. - 2006. - Vol. 74. - P. 2072-2079. - 22. Waldor M.K., Mekalanos J.J. // Science. - 1996. - Vol. 272. - P. 1910-1924.
G.A.Yeroshenko, L.M.Koukleva, N.Yu.Shavina, V.V.Kutyrev
Genetic Peculiarities of Vibrio cholerae Strains Non-O1 / Non-O139 Serogroup Isolated from Patients in Astrakhan in 1976-2003
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
V. cholerae strains serogroup non-O1 / non-O139 circulating in the territory of Astrakhan Region were shown to be deprived of the main virulence factors’ genetic determinants located on the migrating genetic elements. Of the V. cholerae genes known hitherto, they contained only those necessary for their vital activity and persistence in the environments.
Key words: cholera vibrios non O1 serogroup, virulence genes, migrating genetic elements, epidemic potential.
nocTynn^a 18.08.06.
УДК 616.932:576.851.3
Н.А.Осина, Т.В.Бугоркова, А.Н.Куличенко К ВОПРОСУ О РЕВЕРСИИ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Получена реверсия некультивируемых форм холерных вибрионов в 10 % случаев, если переход в некульти-вируемое состояние осуществляли в 0,9 % растворе натрия хлорида при температуре 4-6 °С в течение 18-24 дней, и в 30 % - при 18-месячной инкубации в среде, содержащей 50 мг/% аминного азота, при температуре 2022 °C. Рекультивацию осуществляли с использованием жидкой питательной среды, содержащей среду 199, солевой раствор, дрожжевой аутолизат и инактивированную эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. У ревертантов отмечено снижение агглютинабельности холерными диагностическими сыворотками, чувствительности к холерным бактериофагам ХДФ-3,4,5, утрата в 100 % случаев способности ферментировать орнитин и в 16 % - сахарозу.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, некультивируемые формы, реверсия.
В настоящее время накоплено достаточно данных, свидетельствующих о способности неспорообразующих бактерий к длительному существованию во внешней среде в виде клеток со значительно сниженной метаболической активностью, не обнаруживаемых традиционными методами культивирования на питательных средах. Подобное со-
стояние покоя с потерей роста у грамотрицательных бактерий называют некультивируемым (НС), а сами бактерии - некультивируемыми формами (НФ). Способность к переходу в НС выявлена более чем у 30 видов патогенных бактерий, в том числе и холерных вибрионов [1, 3].
Рядом авторов показана возможность длитель-
