CC BY
92
4. ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ
Е.В. Игнатьева, Н.А. Дмитричева, И.В. Ярцева,
Л.Г. Гатинская
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКТАСЕНСА В ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Октасенс - новый липофильный ФС ближнего инфракрасного диапазона, предназначенный для фото-динамической терапии злокачественных опухолей.
Для использования октасенса в качестве лекарственного средства, принимая во внимание его физикохимические свойства, в лаборатории разработки лекарственных форм была создана нестандартная нано-структурированная модель лекарственной формы, которая представляла собой водно-эмуксольную дисперсию октасенса. Однако при хранении эта лекарственная форма оказалась нестабильной. Поэтому в качестве модели была предложена лиофилизированная наноструктурированная ЛФ октасенса (НЛФО-лио).
Цель. Разработка методики количественного определения октасенса в предложенной модели ЛФ.
Материалы и методы. Образцы НЛФО-лио; УФ-спектроскопия.
Результаты и обсуждение. Для количественного определения использован метод спектрофотометрии в видимой области. В качестве растворителя использовали хлороформ. Известно, однако, что качество хлороформа оказывает существенное влияние на электронный спектр поглощения октасенса: если в хлороформе присутствуют следы соляной кислоты, наблюдается значительный батохромный сдвиг аналитического максимума и уменьшение его интенсивности. Для снятия этого нежелательного эффекта использовали хлороформ, предварительно обработанный поташом. Хлороформный раствор содержимого флакона стабилизируют добавлением 95 %-ного этилового спирта в соотношении 1: 1,5. Из 3 максимумов в электронном спектре поглощения окта-сенса (383±3 нм, 655±3 нм, 726 ± 3 нм) в качестве аналитического выбран максимум при 726±3 нм. Установлено, что хлороформно-спиртовой раствор октасенса подчиняется закону Бугера Ламберта Бера в необходимом диапазоне концентраций 0,003-0,012 мг/мл. Содержание октасенса определяли измерением оптической плотности 0,0006 %-ных растворов октасенса (оптимальная концентрация) в максимуме поглощения при X 726±3 нм.
Предлагаемая методика обладает хорошей воспроизводимостью и точностью. Относительная ошибка определения не превышает 2,0 %.
Работа поддержана Правительством г. Москвы.
И.В. Ярцева, Д. О. Ильин, Л.Г. Гатинская,
Н.А. Машалова, Е.В.Игнатьева КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕЦИТИНА В ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛФ ТИОСЕНСА РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Тиосенс - практически нерастворимое в воде комплексное соединение алюминия из класса тиофталоциа-нинов, полученное в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» и предназначенное для ФДТ опухолей. Для получения растворимой формы препарата и улучшения его фотодинамиче-ских и фармакокинетических свойств в лаборатории разработки лекарственных форм РОНЦ получена лиофилизи-рованная липосомальная ЛФ тиосенса (ЛЛФТ-лио), представляющая собой многокомпонентную композицию, основой которой является яичный лецитин ЕРС8 (Lipoid).
Цель работы - разработка методики количественного определения лецитина в ЛЛФТ-лио.
Результаты и обсуждение. Для количественного определения лецитина в ЛЛФТ-лио предложена спектрофотометрическая методика, основанная на способности фосфолипидов образовывать хорошо растворимые в хлороформе окрашенные комплексы с аммония ферротиоцианатом. Максимум поглощения комплекса, полученного с яичным лецитином
ЕРС8 (Lipoid), регистрируется при X 475 нм. Показано, что ингредиенты ЛЛФТ-лио, включая тиосенс, не оказывают существенного влияния на образование и спектральные характеристики комплекса лецитина с аммония ферротиоцианатом. Это позволяет для определения концентрации лецитина в ЛЛФТ-лио использовать калибровочный график, построенный посредством смешивания равных объемов водного раствора аммония ферротиоцианата и хлороформного раствора, содержащего увеличивающуюся концентрацию фосфолипида. В нашем случае калибровочный график включал 10 точек в диапазоне концентраций лецитина от 0,005 до 0,05 мг/мл. Получена линейная зависимость оптической плотности от концентрации лецитина в растворе. При более высоких концентрациях эта зависимость не подчиняется закону Бугера Ламберта Бера. Проанализированы липосомальные лекарственные формы тиосенса, содержащие 100; 300; 500 мг лецитина на единицу лекарственной формы. Определенная по калибровочному графику концентрация лецитина составила с1=0,0304мг/мл; с2=0,0396мг/мл; с3=0,0487мг/мл, а в пересчете на массу лецитина в единице лекарственной формы - m1=99 мг; т2=304мг; т3=487мг, соответственно.
Выводы. Разработанная методика обладает достаточной точностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка определения не превышает 2,0 %.
Работа поддержана Правительством Москвы.
Авторы благодарят Г.Н.Ворожцова, Е.А. Лукьян-ца и В.М. Деркачеву за сотрудничество и предоставленные для исследования образцы тиосенса.
Е.В. Игнатьева, Л.Г. Гатинская, С.Ф. Голубева,
Н.А. Дмитричева, И.В. Ярцева ОЦЕНКА КАЧЕСТВА
ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛФ ТИОСЕНСА
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
В РОНЦ проводятся исследования по разработке лио-филизированной липосомальной ЛФ тиосенса (ЛЛФТ-лио) - препарата для ФДТ опухолей.
Цель работы - химико-фармацевтическая стандартизация ЛЛФТ-лио.
Материалы и методы. Образцы ЛЛФТ-лио, в которых в качестве криопротектора использована сахароза; УФ-спектроскопия, лазерная спектрометрия, потенциометрия.
Результаты и обсуждение. В процессе разработки ЛЛФТ-лио был изменен состав ЛФ (вместо лактозы использована сахароза) и технология ее получения. Эти изменения вызвали необходимость доработки методик химико-фармацевтического анализа и внесения уточнений в критерии и параметры качества ЛЛФТ-лио. Оценка качества проводилась по следующим критериям: описание, подлинность, средняя масса содержимого флакона, размер липосомальных везикул, рН, количественное определение.
Содержание тиосенса во флаконе определяли методом прямой спектрофотометрии. Наиболее воспроизводимые результаты получены при работе с хлороформно-спиртовыми растворами. Установлено, что сахароза, как и другие вспомогательные вещества, входящие в состав ЛЛФТ-лио, не имеют в этой области собственного поглощения, но влияют на положение аналитического максимума в спектре основного вещества. Обычно наблюдается
К. В. Костин, Е. В. Игнатьева, Н. А. Оборотова ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОТЕРЬ ЛИЗОМУСТИНА В ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ДИСПЕРСИИ ПРИ ФИЛЬТРУЮЩЕЙ ЭКСТРУЗИИ
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Лизомустин - 2-хлорэтилнитрозоуреидопороиз-водное аминокислоты лизин относится к группе нитрозоалкилмочевин (НАМ) и представляет собой смесь двух изомеров (активного и малоактивного):
a-CH:-CH,-NH-C-N-CH,-CH:-CH:-CH:-CH-COOH II I ' ' " ' I
О NO NH:
а-CHj-CH,- N - С - NH -CH; -CH; - CH; - СН; - сн - соон ' ' I II ' ' ' ' I
N0 О NH:
Препарат синтезирован в ИОС УО РАН, в лаборатории разработки лекарственных форм в РОНЦ была предложена липосомальная лекарственная форма лизомустина.
Задачи. Определить количество действующего вещества остающегося на мембране фильтра экструдера.
Материалы и методы. Субстанция Лизомусти-на - смесь изомеров положения нитрозогруппы: 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-Ь-гомоцитруллин (I); 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо-Ь-гомоцитруллин (II). (ФСП 42-0494003, ООО «АКАДЕМФАРМА»). Ли-посомальная дисперсия Лизомустина, полученная в лаборатории разработки лекарственных форм. Субстанцию и липосомальную дисперсию Лизомустина экструдировали под давлением полуавтоматическим экструдером Lipex, последовательно пропуская их через фильтры 400 нм и 220 нм. Снимали спектры проэкструдированной и исходной частей.
Результаты и обсуждения. Оптические плотности исходной субстанции и проэкструдированно-го образца отличались в среднем на 0,005, а в случае липосомальной дисперсии на 0,025, что говорит о незначительных потерях действующего вещества при экструзии, которыми можно пренебречь.
Е.А. Котова, Н.А. Оборотова2, И.И. Краснюк1,
Т. В. Денисова1
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛП
1ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, Росздрав, Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Задачи исследования.
1. Изучить и детально проанализировать под-
его батохромный сдвиг (до 8 нм) относительно спектра субстанции. Определение проводили в максимуме поглощения при X 720±4 нм. Относительная ошибка определения не превышает 2,0 %. Также показано, что в представленной модели лекарственной формы изменились значения критериев качества «средняя масса содержимого флакона» и «рН». Основные показатели качества ЛЛФТ-лио приведены в таблице.
готовительные работы по проведению технологического процесса изготовления противоопухолевых лекарственных препаратов в асептическом блоке лаборатории разработки ЛФ РОНЦ.
2. Усовершенствовать технологический процесс изготовления и контроля качества ЛФ противоопухолевых препаратов в асептическом блоке с использованием модульного производства в соответствии с требованиями СМР.
Материалы и методы. С целью детального изучения организации технологического процесса и оценки их качества выбраны лекарственные формы оригинальных отечественных противоопухолевых субстанций из классов:
— Хлорэтиламины;
— Нитрозоалкилмочевины;
— комплексные производные металлов (платина, кобальт).
Для организации усовершенствованного изготовления провоопухолевых препаратов использован комплекс методов:
— физико-химические,
— биологические,
— микробиологические,
— математико-статистические.
Результаты. В РОНЦ исследованы подготовительные работы и организация технологического процесса изготовления отечественных противоопухолевых препаратов с использованием модульного производства в асептическом блоке. Изготовление осуществляют в чистых помещениях класса А в соответствии с требованиями Национального стандарта РФ ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств». Противоопухолевым веществам свойственны: термолабильность, гидролитическая неустойчивость, гигроскопичность. Для получения стабильных лекарственных препаратов из таких субстанций, рационально применять стерилизацию фильтрованием и последующее изготовление в виде лиофилизированных препаратов.
Данный процесс не требует поведения финишной стерилизации и в сухой массе не поддерживается рост микроорганизмов. С целью обеспечения всех требований ГОСТ Р и защиты персонала и производственной среды от токсичных субстанций хлорэтиламинов используют изоляторы (барьерные технологии).
Помимо упрощения технологического процесса и повышения качества изготавливаемых лекарственных препаратов, введение современного модульного производства позволяет сокращать эксплуатационные расходы.
Т аблица
Основные показатели качества ЛЛФТ-лио
Описание Подлинность Средняя масса, г рН Размер везикул, нм Содержание во флаконе, мг
Сухая пористая масса светло-зеленого цвета ЭСП должен иметь max поглощения при 342; 648; 720 нм 0,89-0,99 6,0-7,0 < 300 1,3—1,7
Работа поддержана Правительством г. Москвы
В.П. Краснов1, Н.А. Оборотова2, М.И. Кодесс1,
З.С. Шпрах2 Г.Л. Левит1, К.Костин2, М.А.Ежикова1, О.Н. Саквина2, А.Ю. Барышников2 АНАЛИЗ МЕТОДОМ 1Н-ЯМР СОСТАВА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ЛИЗОМУСТИНА :ИОС им. И.Я. Постовского УрО РАН, Екатеринбург 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Для отработки технологических процессов получения липосомальной лекарственной формы препарата лизомустин необходим метод анализа, позволяющий провести быструю оценку состава полученного продукта. Липосомальная форма препарата лизомустин включает лецитин (фосфатидилхолин), лактозу, холестерин и лизомустин (соотношение изомеров 1 и 2 около 75:25).
Целью настоящей работы была разработка метода количественной оценки перечисленных компонентов методом :Н-ЯМР спектроскопии.
Материалы и методы. В исследовании использовали липосомальную лекарственную форму лизому-стина, полученную в лаборатории разработки лекарственных форм РОНЦ. Спектры записывали на спектрометре ЯМР DRX400 “Bruker” (рабочая частота 400 МГ ц), в качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан (TMS).
Результаты. Показано, что для проведения анализа наиболее подходящим растворителем, в котором растворяются все компоненты лекарственной формы, является смесь дейтерированного ДМСО с CCl4.
Спектры отдельных компонентов ЛФ: лецитина, холестерина и лактозы, а также лизомустина - характеризуются значительным перекрыванием сигналов протонов однотипных групп, что усложняет интерпретацию. Однако нам удалось количественно оценить мольное соотношение компонентов лекарственной формы. Диагностическими сигналами являются сигналы метильной СН3-группы в 17 положении холестерина (5 0,65 м.д., триплет), сигнал метинового СН-протона фрагмента глицерина в лецитине ( 5,0 м.д., мультиплет) и сигналы мочевинных NH-протонов изомеров лизомустина ( 9,0-8,7 м.д., триплеты). Точность определения составляет около 1,5 %.
Выводы. Таким образом, показано, что на основании анализа 1Н ЯМР-спектров можно определить содержание холестерина, лецитина и изомеров лизому-стина в липосомальной ЛФ препарата.
Работа выполнена при финансовой поддержке Уральского отделения РАН (проекты 09-П-3-2001 и 09-И-3-2004) и Ведущих научных школ (НШ-65261.2010.3).
Михаевич Е.И., Полозкова А.П., Партолина С.А., Орлова О.Л., Смирнова Л.И.
РАЗРАБОТКА ЛФ ЦИФЕТРЕЛИНА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Цифетрелин - аналог гипоталамическо-го гормона соматостатина, отобран по результатам изучения гормональной, цитотоксической и противоопухолевой активности для доклинического изучения. К настоящему времени оптимизирован метод синтеза и наработано несколько серий Цифетрелина, на основе которых разработан проект ФСП на субстанцию.
Одним из главных элементов доставки лекарственного вещества является путь введения, определяющий многие стороны его взаимодействия с организмом. В предварительном экспериментальном изучении нерастворимой в воде субстанции наибольший, хорошо воспроизводимый противоопухолевый эффект был получен при внутрибрюшинном введении их водной суспензии.
Дальнейшее изучение препарата в опытах in vivo показало, что при пероральном введении противоопухолевый эффект был сравним с подкожным, внутрибрюшин-ным и внутривенным путях введения. Учитывая, что для больного наиболее удобен и безопасен прием препарата внутрь, целью работы являлась разработка ЛФ Цифетрелина для перорального введения.
Материалы и методы. Субстанция Цифетрелина синтезирована в лаборатории химического синтеза и соответствовала по критериям качества требованиям проекта ФСП. При изготовлении модельных смесей для таблетирования были использованы вспомогательные вещества, разрешенные для использования в лекарственных формах для приема внутрь и соответствующие нормативной документации. Для разработки пероральной лекарственной формы Цифетрелина использовали таблеточный пресс и приборы для определения технологических характеристик порошков фирмы «Erweka», Г ермания.
Результаты. Исследованы технологические характеристики субстанции Цифетрелина: фракционный состав, форма и соотношение параметров размера частиц, смачиваемость, насыпная масса, сыпучесть или подвижность, прессуемость. Исследуемая субстанция относится к группе не смачивающихся веществ, в связи с чем в рецептуру смеси для таблетирования были введены ингредиенты, ответственные за улучшение распа-даемости таблетки и снижение адгезии к прессующему инструменту. При исследовании текучести, угла естественного откоса оказалось, что субстанция Цифетре-лина в связи с рядом причин, в том числе сильной электризуемостью, плохо и нестабильно высыпается из вибрирующей воронки. Поэтому можно говорить лишь о приближенном значении коэффициента текучести (0,1 г/сек). С целью улучшения текучести порошков необходимо увеличение фракции укрупненных и утяжеленных частиц. Это достигалось гранулированием 2% крахмальным клейстером и созданием смеси, содержащей более крупные и тяжелые частицы.
Таким образом, разработан состав ЛФ Цифетрели-на в виде таблеток, удовлетворяющий требованиям ГФ XII по всем исследуемым разделам.
Н.А. Оборотова РАЗРАБОТКА
НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ЛФ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ
ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СУБСТАНЦИЙ
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Одним из направлений повышения эффективности лекарственной терапии ЗНО является совершенствование избирательности действия противоопухолевых препаратов с помощью современных фармацевтических технологий. Мы использовали коллоидные системы, позволяющие изменить фармакокинетику водорастворимых лекарственных веществ путем включения их во внутреннее пространство липосомы, либо солюбилизировать гидрофобные субстанции, включая их в липидную фракцию мицелл и липосом.
Целью исследования. Создание наноструктуриро-ванных ЛФ для внутривенного введения оригинальных отечественных противоопухолевых субстанций.
Результаты. Лизомустин как водорастворимое производное нитрозоалкилмочевины наряду с высокой противоопухолевой активностью обладает низким терапевтическим индексом. С целью увеличения избирательности его противоопухолевого действия нами разработаны стерически стабилизированные липосомы, позволившие расширить диапазон терапевтических доз и снизить токсичность цитостатика.
Интересные результаты получены инкапсулированием в липосомальную мембрану липофильных гормоноцитостатиков (кортифена, тестифенона и цитэстрол-ацетата) и гидрофобных производных хлорэтиламинов (цифелина и амирона). В этом случае удалось получить коллоидные системы, пригодные для всех способов введения, в том числе и для внутривенного применения, чем значительно расширяются терапевтические возможности испытуемых соединений.
Многие фотосенсибилизаторы, представляющие интерес для ФДТ и флуоресцентной диагностики с точки зрения высоких значений экстинции и квантового выхода синглетного кислорода, удобного спектрального диапазона и флуоресцентных свойств, нерастворимы в воде. Поэтому мицеллярные и липо-сомальные формы таких соединений использованы нами в самом начале их биологического изучения и скрининга, как возможные инъекционные лекарственные формы для ФДТ.
Выводы. Проведенные нами технологические и химико-фармацевтические исследования позволяют производить стандартные и воспроизводимые серии липосомальных препаратов для углубленного доклинического изучения.
Д.В. Соколова, Е.В. Тазина, М.А. Кортава,
О.В. Хугаева, А.П. Полозкова, П.К. Иванов,
А. С. Гриневич, И.В. Чинарева, Н.А. Оборотова,
А.Ю. Барышников АНТИ CD-20 И АНТИ-HLA-DR ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНЫЕ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА:
ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНОСТЬ IN VITRO РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Терапевтические подходы к совершенствованию химиотерапии онкологических заболеваний сфокусированы на разработке новых систем доставки лекарств непосредственно к злокачественной клетке. С этой целью широко изучаются иммунолипосомаль-ные конструкции, которые позволяют увеличить избирательность действия хорошо известных противоопухолевых соединений.
Цель исследования. Получение анти-СБ20 и анти-HLA-DR иммунолипосом, нагруженных док-сорубицином, для адресной доставки к опухолевым клеткам-мишеням.
Материалы и методы. Иммунолипосомы получали методом обращения фаз из лецитина, холестерина, пегилированного 1,2-дистеароил-Бп-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DSPE-PEG -2000), и pNp-PEG lipid в мольных соотношениях 7:4:0,15:0,05. Загрузку доксорубицина осуществляли против градиента сульфата аммония. Весовое соотношение препарат: липиды составило 0,16:1.
В качестве вектора использовали МКА IC0-180 и IC0-1, обладающие специфичностью к CD20 и HLA-DR антигенам соответственно. Очистку имму-нолипосомальной суспензии осуществляли методом гель-фильтрации с помощью хроматографической колонки, заполненной сефадексом G-50. Содержание препарата определяли спектрофотометрически. Калибровку иммунолипосом по размеру проводили c помощью ручного мини-экструдера. Размер везикул определяли на приборе Submicron Paryicle Sizer Nicomp-380 (США). Определение общего белка в препарате иммунолипосом проводили с бицинхони-новой кислотой и рассчитывали количество молекул МКА, приходящееся на липосому.
Оценку специфичности связывания иммунолипосом проводили на клеточной линии Raji (лимфома Беркитта) с помощью непрямого иммунофлюорес-центного метода.
Результаты. Включение доксорубицина в иммунолипосомы составило 89-95%; размер везикул
- 145±5 нм; количество молекул МКА, приходящееся на одну липосому - 90±3.
Специфичность связывания анти-СБ20 иммунолипосом с антигенположительными клетками-мишенями составила 98±2%, анти-HLA-DR иммунолипосом, 96±3%.
Выводы. Отработана технология получения ан-ra-CD20 и анти-HLA-DR иммунолипосомальных форм доксорубицина с высокой степенью включения препарата и выраженной антигенспецифично-стью in vitro.
Е.В. Тазина, А.П. Полозкова, Е.В. Игнатьева,
О.Л. Орлова, Н.А. Оборотова СТЕРИЛИЗУЮЩАЯ ФИЛЬТРАЦИЯ ТЕРМОЛИПОСОМАЛЬНОЙ ДИСПЕРСИИ С ДОКСОРУБИЦИНОМ рОнЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Важным моментом в разработке инъекционных липосомальных препаратов является выбор метода стерилизации. В связи с термолабильностью и гидролитической неустойчивостью противоопухолевых веществ, а также подверженностью липидов, образующих липосомальную мембрану, гидролизу и перекисному окислению, большинство существующих стерилизационных методов (термических) неприемлемо для производства лекарственных средств на основе липидных везикул. Наиболее часто стерилизацию липосом проводят с помощью фильтрации через ядерные мембранные фильтры с последовательным уменьшением величины пор от 1,2 мкм до 0,22 мкм.
Цель исследования. Разработка методики стерилизующей фильтрации термолипосомальной дисперсии с доксорубицином.
Материалы и методы. Термолипосомы (ТЛ) получали методом обращения фаз из липидов (DPPC и DSPC), холестерина, пегилированного липида в молярном соотношении 9:1:0,2:0,02. ТЛ экструдировали через нейлоновые мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм, а затем через поликарбонатные мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм. Доксорубицин (Докс) загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония. Весовое соотношение препарат : суммарные липиды составило 0,2 : 1, общее содержание липидов в дисперсии - 12,6 мг/мл. Для очистки Докс-ТЛ от не включившегося в ТЛ препарата использовали метод гель-фильтрации. Содержание Докс и эффективность включения Докс в ТЛ определяли спектрофотометрически при длине волны 252 нм на приборе Cary 100 (Varian, 1пс., Австралия). Диаметр везикул измеряли на наносайзере Nicomp-380 Submicron Particle Sizer (США). Фильтрующий материал для Докс-ТЛ выбирали с учетом физикохимических свойств веществ, входящих в состав лекарственной формы. Свежеприготовленную дисперсию Докс-ТЛ последовательно пропускали через нейлоновые мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм под давлением, используя установку LIPEX™ (Northern Lipids, Inc., Канада).
Результаты. Включение Докс в ТЛ и размеры частиц до и после стерилизующей фильтрации практически не изменились.
До фильтрации содержание Докс в ТЛ составило 2,12 мг/мл, после - 2,04 мг/мл. Следовательно, в процессе стерилизующей фильтрации термолипосомаль-ной дисперсии происходили потери около 3,8 % Докс.
Выводы. Стерилизацию дисперсии Докс-ТЛ можно проводить с помощью фильтрации под давлением через нейлоновые мембранные фильтры с последовательным уменьшением величины пор от 0,45 мкм до 0,22 мкм. Потери Докс при этом не превышают 4 %.
О.В. Хугаева., М.А. Кортава., Д.В. Соколова,
Е.В. Тазина, Е.В. Игнатьева, А.П. Полозкова А.Ю. Барышников, Н.А. Оборотова, И.И. Краснюк ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОГО КРИОПРОТЕКТОРА ДЛЯ ЛИОФИЛИЗАЦИИ ЛИПОСОМАЛЬНОГО МИТОКСАНТРОНА РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Главное препятствие при использовании липосом в практике - низкая стабильность. Изменения в процессе хранения связаны с изменением размеров везикул; разрушением липидного бислоя и внутреннего содержимого; вытеканием включенного лекарства; окислением, гидролитическим разрушением липидного состава или ЛП и т.п. Кроме физической и химической стабильности дисперсной липосомальной системы необходимо обеспечить ее стерильность в процессе хранения препарата. Сегодня широко используется сублимационная сушка при получении инъекционных ЛФ термолабильных и гидролитически неустойчивых лекарственных соединений ряда вакцин и других биопрепаратов.
Цель. Подобрать оптимальный криопротектор для лиофилизации липосом, нагруженных митоксантро-ном, для обеспечения стабильности препарата при дальнейшем его хранении.
Материалы и методы. Для получения липосо-мальной дисперсии для лиофильной сушки использовали лецитин, полиэтиленгликоль (mPEG-2000-DSPE) фирмы Lipoid; холестерин (Chol; Sigma); митоксантро-на гидрохлорид (Synbias Pharma Ltd); сахароза, глюкоза, лактоза (Химмед). Как криопротекторы при лиофиль-ной сушке использовали лактозу, сахарозу и глюкозу (все по 3-4-6 %) в определенных процентных содержаниях. Липосомальную дисперсию разливали по 2 мл во флаконы емкостью 20 мл и замораживали на полке сублимационной сушки до -45 °С в течение 3 ч. Далее проводили сублимацию на установке Minifast DO2 (Англия-Италия) в течение 24 ч.
Проводили оценку влияния температурного режима сушки на качество готового препарата: внешний вид (цвет, пористость, однородность), физико-химические характеристики (скорость растворения или ресуспендирования, размер везикул и т.п.).
Результаты. На основании проведенных исследований в качестве наиболее оптимального криопротектора для лиофилизции липосомального митоксантро-на выбрана 4 %-ная сахароза. Размер везикул до лио-филизации составил 146±2 нм, после - 157±5нм. Эффективность включения митоксантрона в липосомы после лиофильной сушки изменилась так же незначительно (от 93 до 84,2 %).
О.В. Хугаева, М.А. Кортава, Д.В. Соколова,
А.П. Полозкова, А.Ю. Барышников, Н.А. Оборотова, П.К. Иванов, А.С. Гриневич, И.В. Чинарева, И.И. Краснюк ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНОГО МИТОКСАНТРОНА
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Проблема создания новых противоопухолевых препаратов является одной из самых актуальных в
современной онкологии. Отсутствие достаточной избирательности действия известных цитостатиков обуславливает не только дальнейший поиск новых активных соединений, но и совершенствование их лекарственных форм. Как показали доклинические и клинические испытания, основным недостатком противоопухолевых препаратов является невысокая избирательность цитостатического действия на опухолевые клетки и отсюда значительная общая токсичность.
Поэтому остается актуальной проблема создания рациональных лекарственных форм, увеличивающих избирательность их противоопухолевого действия.
С этой целью в последние годы все чаще предпринимаются попытки разработки систем направленной доставки. Большой интерес представляют иммунолипо-сомы, позволяющие программировать время нахождения препарата в кровотоке и его накопление в опухоли.
Цель исследования. Разработать технологию получения иммунолипосомального митоксантрона, способствующего увеличению избирательности противоопухолевого действия препарата.
Материалы и методы. Для получения иммуноли-посомальной дисперсии использовали лецитин (PC), полиэтиленгликоль (mPEG-2000-DSPE и рМр-pEG-3000 lipid) фирмы Lipoid; холестерин (Chol) (Sigma); антигенспецифичные МКА (РОНЦ РАМН); миток-сантрона гидрохлорид (Synbias Pharma Ltd).
Иммунолипосомы с митоксантроном получали методом активной загрузки по градиенту сульфата аммония. Очистку иммунолипосомальной дисперсии от невключенного митоксантрона проводили методом колоночной хроматографии (гель-фильтрация). Контроль разделения фракций осуществляли с помощью проточного УФ-спектрометра UVis-920. Эффективность включения митоксантрона в иммунолипосомы оценивали спектрофотометрическим методом при длине волны X 242±2 нм. Размер иммунолипосом измеряли на приборе Submicron Particle Sizer Nicomp-380 (США). Проверяли способность иммунолипосом специфически связываться c антигенами, экспрессированными на клетках линии Raji (B-клеточная лим-фома человека) in vitro.
Результаты. Средний диаметр иммунолипосом составил 150±5 нм, включение митоксантрона в иммунолипосомы - 90%.
Эффективность связывания иммунолипосом с клетками линии Raji составила 97,4%.
Чан Тхи Хай Иен1, Е.В. Тазина2, В.М. Печенников1, А.П. Полозкова2, Н.А. Оборотова2 Г.В.Раменская1 ПРИМЕНЕНИЕ ТСХ
ДЛЯ КАЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛФ ФОТОДИТАЗИНА
1ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, Москва,
2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. В РОНЦ разработана новая липосо-мальная ЛФ фотодитазина. ТСХ, отличающаяся скоростью и простотой выполнения, часто применяется для качественного анализа лекарственных препаратов.
Цель исследования. Разделение и идентификация яичного фосфатидилхолина и фотодитазина в липо-сомальной ЛФ фотодитазина методом ТСХ.
Материалы и методы. Проводили ТСХ на хроматографических пластинках «Silica gel 60 F 254»Î0*20 см (подложка - стекло)(Мегск, Г ермания).
Использовали 3 системы растворителей
I. хлороформ : метанол : вода (65:25:4).
II. Н-бутанол: ледяная кислота: вода (12:3:5)
III. Хлороформ: метанол : ледяная уксусная кислота : вода (25 : 15 : 4) (60 : 50 : 1 : 4).
Содержимое флакона, содержащего лиофилизи-рованный липосомальный фотодитазин, растворет-ся в 1 мл 95 %-ного этилового спирта.
На хроматографическую пластинку наносят 5 мкл приготовленного раствора липосомального фотодитазина и стандартных образцов веществ-свидетелей.
Пластинку с нанесенными пробами выдерживают на воздухе в течение 5-10 мин, затем помещают в камеру, предварительно насыщенную вышеуказанной смесью растворителей, и хроматографируют восходящим способом.
При достижении фронтом растворителей расстояния 10 см, пластину вынимают из камеры и сушат на воздухе до полного удаления следов растворителей. Как детектор используют пары йода.
Пятна яичного фосфатидилхолина идентифицировали по желтой краске, а пятна фотодитазина -по зеленной окраске.
Результаты.
1. Система I. Наблюдали четкое разделение фосфатидилхолина (Ш = 0) и фотодитазина (М около 0,9).
2. Система II. Также наблюдали четкое разделение фосфатидилхолина (Ш около 0,4) и фотодитазина (М около 0,8).
3. Система III. Фосфатидилхолин и фотодита-зин не разделялись.
Таким образом, для разделения и идентификации фосфатидилхолина, фотодитазина в липосомальной ЛФ фотодитазина методом ТСХ рекомендованы системы I и II с использованием детектора пары йода.
Издание 2-е, переработанное и дополненное
ЭНЦИКЛОПЕДИЯ
КЛИНИЧЕСКОЙ
ОНКОЛОГИИ
Готовится к печати Издательская группа РОНЦ
