CC BY
176
УДК 606;614.446.3;621.398;602.44
Т. М. Зимина, канд. физ.-мат. наук,
Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ»
Лаборатории на чипе для телемедицины
Ключевые слова: лаборатории на чипе, телемедицина, портативные клинико-диагностические системы, PocT. Key words: laboratories-on-a-chip, telemedicine, portable diagnostic systems, PocT, point-of-care-testing.
Анализируется современное состояние и перспективы развития микро- и наноаналити-ческих систем и лабораторий на чипе как основы портативных периферических средств диагностики (Point-of-care-Testing — PocT) для телемедицины и их роль в решении современных проблем, таких как распространение инфекционных заболеваний и возрастание количества устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов. Приводятся данные по современному состоянию развития индустрии PocT, их месту на рынке средств анализа in vitro. Рассматриваются перспективы развития PocT в России для экспресс-диагностики инфекций, включая тестирование антибиотикорезистентности патогенных микроорганизмов. Систематически представлены функциональные компоненты микро- и наноаналитических систем, рассматриваются архитектура и принципы функционирования портативной диагностической системы класса PocT для экспресс-микробиологического анализа и оперативного выбора правильной антимикробной терапии.
Введение
В последние десятилетия в мире наметился существенный разрыв продолжительности жизни населения в технологически развитых индустриальных странах и в развивающихся государствах [1] (рис. 1). Основными причинами нетрудоспособности и смертности населения являются следующие [2]: 1) сердечно-сосудистые заболевания; 2) новообразования; 3) травматизм; 4) инфекционные заболевания [3, 4].
Инфекционные заболевания получили в последнее время опасное распространение вследствие социально-экономических, экологических и поведенческих факторов, а также интенсивных международных перевозок и миграции. Возросла проблема резистентности патогенных микроорганизмов. При этом во многих регионах возможности обследования и своевременной постановки диагноза для правильного выбора стратегии антибактериальной
терапии остаются неудовлетворительными по причинам централизации диагностических средств и, как следствие, их малой доступности при постановке диагноза медицинским персоналом. Решение вопроса антибиотикорезистентности (АБР) и правильности выбора стратегии лечения может быть достигнуто при обеспечении доступа к диагностическим средствам как больного, так и медицинского работника за счет новых технологий и модернизации возможностей ранней диагностики и оперативного оказания помощи, с использованием средств телемедицины и портативных клинико-диагностических систем.
Задача данной статьи — анализ возможности экспресс-диагностики инфекционных заболеваний и резистентности патогенных микроорганизмов на основе внедрения новых технологий, в частности микро- и наноаналитических систем или лабораторий на чипе, и созданных на их основе мобильных клинико-диагностических систем класса РосТ (Рот'Ъ-о^саге-Тев'Ь:!.^) для ранней диагностики и оперативного оказания помощи.
90
80
70
60
а
ч о
о §
50
40
■ ф ■
■ ■ ■ ■ 1 /
■
50 60 70 80
Продолжительность жизни мужчин, лет
90
Рис. 1
Средняя продолжительность жизни населения в 195 странах мира по данным статистики Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)
Биоэлектроника и биосенсорика
Телемедицина
В западных странах и, в меньшей степени, в России в последние годы получила развитие так называемая телемедицина [4,5]. Телемедицина определяется в ряде публикаций как использование обмена медицинской информацией с помощью телекоммуникационных и электронных информационных технологий для улучшения оказания медицинской помощи на расстоянии (рис. 2) [6]. В развитых странах телемедицине уделяется все возрастающее внимание. Так, в бюллетене «Федерал Реджистер» [7] (Federal Register) опубликовано предложение организации социального медицинского страхования США — CMS (Centers for Medicare & Medicaid Services) ввести новые правила и экономические привилегии для врачей и организаций, которые используют телемедицину. Эксперты считают, что внедрение информационных технологий и телемедицины позволит уже в короткие сроки повысить эффективность медицинской помощи.
Дополнительно к этому существенной частью телемедицины представляется подход, сочетающий ее информационные технологии и портативные периферические средства экспресс-анализа in vitro, такие как средства класса PocT на основе лабораторий на чипе для массового скрининга с целью ранней диагностики и коррекции патологий, что особенно важно для удаленных районов.
В странах с высокой продолжительностью жизни подобные диагностические системы развиваются быстрыми темпами. Рынок приборов PocT в этих странах вырос до 15 % всего объема приборов для in vitro диагностики, а к 2015 г., по данным Yole Développement [8], он составит 30 %. Основные области применения таких приборов в настоящее время включают: экстренное тестирование, врачебное обследование, децентрализованные больничные тесты, военную медицину.
Миниатюрные приборы для диагностики на месте обследования (PocT)
Примеры промышленной реализации систем PocT приведены в табл. 1. Они в настоящее время не многочисленны и реализуют в основном биохимический анализ (глюкоза, ферменты), определение газов крови (кислород, азот, углекислый газ, прочие газы), генетическую идентификацию инфекций. Здесь можно отметить, что в Центре микротехнологии и диагностики СПбГЭТУ в 2000 г. создан образец — концепция первого в мире портативного анализатора фракций крови класса PocT с помощью капиллярного чипа и доплеровского электрофоретического светорассеяния, а затем образцы портативных приборов для капиллярного электрофореза на чипе с лазерным флюоресцент-
Скорая помощь
Травма
РосТ
¿Я
О V j ' гЛ
Служба спасения Консилиум врачей
Умная одежда
Удаленная ветстанция
GPS / ^
у у Сервер
©
S ' V
GPRS
Дом ветеранов
GSM
Медицин-Пр°вайдер прикладных ский справоч услуг (ППу) ный центр
Конфиденциальная база данных +---,
Поликлиника
РосТ * .- Ч Ж _/ - W /
м A -Y s' W '
"у-
Школа
Рис. 2 | Телемедицинская система с периферийными приборами PocT (Point-of-care-Testing)
Таблица 1
| Портативные аналитические системы в формате PocT
Название, фирма-производитель
Техническое решение
Технические параметры
Вид изделия
«3M™ Integrated Cycler» (США), «Focus Diagnostics Inc.» (США)
Интегральная платформа для параллельного проведения микро-полимеразной цепной реакции. Полимерный диск с реагентами, микрофлюидика для смешивания и доставки
Габаритные размеры 31 х 21 х 31 см; масса — 8 кг. Скорость нагрева — более 5°/с, охлаждения —более 4 °/с. Диск на 96 ячеек объемом 10 мкл. Время анализа — 30-75 мин. Стоимость прибора — 75 000 долл. США, анализа — 50 долл. США на 1 диск
«Piccolo Express», Abaxis, Inc. (США)
Диск 0 8 см с капиллярами и емкостями. Содержит растворитель и сухие реагенты. Центробежные и капиллярные силы для смешивания. Одновременное наблюдение, девять длин волн, спектры
Габаритные размеры 15 х 20 х 33 см; масса — 6 кг. 26 образцов одновременно. Время анализа — 12 мин; 100 мкл крови. Стоимость прибора — 24 000 долл. США; 13-20 долл. США на анализ
«i-STAT® 1», Critical Blood Analyzer, Inc. (США)
Технология биосенсоров, электрохимическая регистрация. Микрофлюидика
Объем пробы — 10 мкл. Определяет газы крови, биохимию, свертываемость, кардиомаркеры. Время анализа — 1-5 мин. Объем крови: капля 4-20 USD на картридж
«In-Check»*, STMicroelec-tronics (Франция, Италия). Mobidiaq Ltd. (Финляндия)
Технология Lab-on-a-chip, микроПЦР, библиотеки генов резистентности
Определение резистентности бактерий, вызывающих сепсис, на основе ДНК-анализа. Время анализа — от 30 мин до 1 ч
«ABL90 FLEX», Radiometer Medical Aps (Дания)
Портативный автоматический анализатор крови. Электрохимический сенсор
Измерение рН, газов крови, электролитов, глюкозы, лактата, билирубина, оксиметрия цельной крови. Предназначен для диагностики на месте оказания помощи или в лаборатории**
«Afinion AS100»; Axis-Shield PoC AS (Норвегия)
Компактный мультипараме-трический анализатор для диагностики in vitro и тестирования в месте оказания помощи
Тестовые картриджи для определения гликозилгемоглобина и С-реак-тивного белка. Объем пробы — 3,5 мкл. Время анализа — 5,5 мин
«MAGPIX», Luminex Corp. (США)
Компактный мультипараметри-ческий анализатор для клинических и научных лабораторий. Содержит гибкую платформу для биоаналитических применений. Магнитные сферы***
Быстро, точно и воспроизводимо измеряет до 50 различных белков и нуклеиновых кислот одновременно в разнообразных биологических матрицах
«С04№эш™ BioChip and Analyzer», LabNow, Inc. (США)
ПЭТФ-ядерные мембраны, им-мунофлюоресцентный анализ, распознавание образов, микрофлюидика
Экспресс-диагностика ВИЧ/СПИД по С03/С04/С08. Объем крови — 10 мкл. Время анализа — 10 мин
http://www.st.com/stonline/products/promlit/pdf/brcheckin0609.pdf
http://www.canontradeshows.com/expo/awards/awards/index.php?catId=5&year=2010&view=View Для распознавания и позиционирования.
ным детектированием, спектрофлюоресцентного анализа капельных инфекций, ближнепольного спектр-анализа устойчивости суспензий и др.
В приведенных примерах (см. табл. 1) используются основные аналитические принципы, реализованные в миниатюрном варианте: электрохимический анализ, иммунофлюоресцентный анализ, ПЦР, фермент-субстратные реакции. К настоящему времени известен лишь один прибор класса PocT для анализа патогенных микроорганизмов и их антибиотикорезистентности (АБР), которая особенно важна в связи с распространением устойчивых форм патогенных микроорганизмов. Здесь следует отметить, что в области микробиологического анализа, включающего идентификацию и АБР, известны два основных подхода. Первый — это традиционная постановка бактериологического анализа (ручная, полуавтоматическая или автоматическая), включающая накопление микроорганизмов путем роста на специальных питательных средах с последующей идентификацией и постановкой АБР тестов. Второй подход — это анализ с помощью генотипирования, включающего идентификацию и выявление генов резистентности.
Именно второй подход реализован в портативном приборе In-Check, разработанном компанией «STMicroelectronics» совместно с «Mobidiag» для ранней диагностики заболевания на основе генетического анализа. Этот прибор содержит планшет для идентификации десяти вызывающих сепсис микроорганизмов, а также метициллин-устойчи-вые штаммы Staphylococcus aureus, выделенные из позитивных образцов крови. Диагностический планшет оптимизирован для выбора антибиотика с учетом данных окраски по Граму. Хотя производители утверждают, что анализ обладает высокой точностью, скоростью и позволит снизить риски неправильного назначения антибиотиков, все же при использовании не культурального (генетического) анализа АБР остается ряд нерешенных вопросов: 1) идентификация ограничена библиотекой выявленных ранее генов устойчивости; 2) невозможно определить степень экспрессии выявленных генов;
3) предполагается безвозвратное разрушение клеток образца, исключающее постановку АБР теста;
4) генотипирование остается, в принципе, не прямым, поскольку вносить вклад в резистентность могут мутации, которые не были ранее описаны и отсутствуют в библиотеках.
Все это позволяет утверждать, что генотипиро-вание при определении резистентности патогенных микроорганизмов уступает культуральным методам по точности, однозначности результатов, а также технической сложности. В связи с этим так актуальна разработка миниатюрных вариантов культу-рального метода анализа, выявляющего реальные филогенетические признаки микроорганизма, позволяющие выбрать правильную терапию в каждом конкретном клиническом случае.
Ограниченность видов in vitro анализов, реализованных в приборах PocT, связана с трудностями их конструирования, разработки новых физико-технологических принципов миниатюризации функциональных элементов и отсутствием компонентной базы. Для расширения видов мобильных приборов для in vitro диагностики в составе телемедицинских систем, в первую очередь, нужны технологии миниатюрных интегрированных аналитических платформ или лабораторий на чипе, которые позволяют резко повысить скорость анализа, вплоть до проведения его в реальном масштабе времени и решить проблему достоверности определения резистентности.
Лаборатории на чипе
Лаборатории на чипе (ЛНЧ) появились в результате развития интегрированных твердотельных технических систем, которое наряду с усовершенствованием классических электронных интегральных микросхем шло и в направлении гибридных микросхем, объединяющих возможности многих технологий. ЛНЧ, представляя собой миниатюрные устройства, изготовленные с помощью планарных и гибридных технологий микроэлектроники, интегрируют коммутируемые каналы переноса вещества (газа, жидкости), энергии (электричества, излучения), информации и обеспечивают базовые функции аналитико-технологической системы: ввод пробы, комплекс полностью автоматизированных аналитических процедур и вывод информации. ЛНЧ первого поколения представляли собой микрофлюидные устройства, в которых содержались главным образом интегрированные системы капилляров, выполняющие функции ввода пробы, сепарации (электрофорез, хроматография). Их созданию способствовала технологическая научно-техническая революция 1990-х годов, связанная с развитием мультидисциплинарного направления микро- и на-ноаналитических систем и лабораторий на чипе как результат интегрирования биоорганической и аналитической химии с нанотехнологиями и технологиями микроэлектроники и микросистемной техники. Современные лаборатории на чипе нового поколения характеризуются более высокой степенью интеграции, включая живые клетки, нативные белки и ферменты и сенсорно-актюаторные и структурные элементы микросистемной техники. Интегрирование аналитических и электронных твердотельных компонентов позволяет не только снизить материало- и энергоемкость клинико-диагностических систем и сделать массовый анализ надежным и доступным, но и повысить аналитические возможности: скорость и разрешение (рис. 3). Это делает развитие ЛНЧ крайне важной и актуальной научно-технической задачей, решение которой позволит создать портативные диагностические приборы для телемедицины.
Рис. 3
Колония Staphylococcus aureus, время роста — 1 ч, размер ~ 800 КОЕ (лаборатория бактериальных капельных инфекций НИИЭМ им. Пастера)
Тем не менее до настоящего времени нет достаточного многообразия промышленных миниатюрных аналитических средств с интегрированными твердотельными функциональными элементами и
сложными жидкостными схемами для решения широкого класса задач. Это связано как с фундаментальными особенностями ЛНЧ, так и с многообразием физических законов, которые необходимо учитывать при интегрировании и гибридизации сенсорно-актюаторных элементов.
В Санкт-Петербургском государственном электротехническом университете «ЛЭТИ» более десяти лет ведутся работы в направлении создания миниатюрных систем экспресс-анализа (PocT) на основе лабораторий на чипе. В них принимает активное участие НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, особенно в части постановки и детализации задач микробиологического анализа, валидации методов in vitro анализа. Основные подходы для решения многих задач конструирования лабораторий на чипе для комплектации портативных диагностических систем, развитые в СПбГЭТУ, представлены в табл. 2. Разработаны технологии и миниатюрные функциональные компоненты, необходимые для создания PocT.
Таблица 2
Принципы функционирования и конструкции базовых компонентов миниатюрных аналитических платформ
Операция, принцип работы
Конструктивно-технологическое решение и примеры реализации
1. Пробоподготовка
Загрузка пробы
Загрузка, отбор пробы. Эргономический профиль, игла для проб периферической крови. Отделение матрицы. Седиментация, флотация (сила тяжести, сила Архимеда, сила Сток-са): mg - mg' - / = тйи / йЬ, щ = ^г2(р3 - рг) / 9п; <х> = = Ь1 / 2(Д)! / 2; Б = кТ/6тщт
Воронка; входной резервуар большого диаметра; муфта; микрофильтр; бассейны (й = 1 ■ 5 мм), микрофильтры, йр = 0,2 мкм; обратно осмотическая система с мембраной; ловушка для се-димента и препятствие для отделения супернатанта, Н = /(Б).
Предочистка
Контролируемая сепарация клеток (например, лимфоцитов) на пористой мембране с прецизионным размером пор
Селективная сорбция
Магнитофорез c помощью селективно связанных магнитных частиц-носителей
Выращивание колоний микроорганизмов, их классификация и транспорт
Пористые пластины из анодного оксида алюминия (АОА) (совместно с ИФ АНБ, Минск), Дйр = 0,2 мкм. Моделирование потоков в пористой среде (совместно с ООО «Софт-Импакт», С.-Петербург)
Микрокартриджи с селективными сорбентами
Микрофлюидные системы со структурированной системой композитных магнитопроводов
*Микроструктурированная платформа из АОА; питательная среда (совместно с НИИЭМ им. Пастера, С.-Петербург)
Термообработка
Скоростное термоциклирование. Микронагревательные элементы, терморезистивные датчики на основе БЮ, ГО прозрачные материалы, оптимизация теплообмена
Объем реактора 0,5-10 нл; т = 0,1 ■ ■ 0,5 с; Скорость нагрева/охлаждения — 250 ■ 500 °С • мин-1. Водяное или воздушное синхронизованное охлаждение
.......... mi'...........
i \
\
$7 \Z 1<L
| № 1 (19J/2012
биотехносфера
4
Продолжение табл. 2
Операция, принцип работы
Конструктивно-технологическое решение и примеры реализации
Дозирование
Инжекционный крест; управляемый электроосмотический поток Электрическое поле 100-1000 В • см-1. Встроенные электроды: напыление — РЪ, Аи, Р< Ag/AgCl; печать — полимерно-углеродный композит, т = 10-3 с
Капельное дозирование Гидрофобная поверхность
2. Химическая обработка
Присоединение флюоресцентных меток к белкам, ферментам, фрагментам ДНК, нуклеотидам, цветные реакции. Микрофлюидные элементы; конвективные и диффузионные смесители; микрореакторы; инкубаторы
На рисунках обозначено: 1 — анодный оксид алюминия; 2 — пора; 3 — клетка; 4 — микрофлюидная система генного чипа; 5 — терморезистивный датчик температуры; 6 — нагревательный элемент; 7 — электрокинетическая система охлаждения; 8 — элемент Пельтье; 9 — входной порт для образца; 10 — микрофильтрационная ячейка; 11 — резервуар для реагента; mg, mg' — сила тяжести и сила Архимеда; — сила трения; и — скорость движения частицы; г — радиус частицы; рч, рж — плотность частицы и жидкости; П — вязкость жидкости; <х> — среднеквадратичное перемещение; í — время перемещения; О — коэффициент диффузии; к — постоянная Больцмана; Т — температура; т — постоянная времени.
3. Транспорт
Адресная доставка и перемещение фаз
Электроосмос; электрофорез Капилляр, 4 = 20 ■ 100 цм; фоновый электролит: с = 5 ■ 20 тМ; внешнее электрическое поле: Е = 100 ■ 1500 В • см-1
Механический импульс. Нестационарная микрогидравлика: Ие > 200 Клапанный, роторный, перистальтический, мембранный микромеханический насос (гибридный или интегральный)
Магнитофорез Полимерный чип с капилляром и композитными магнитопроводными ламелями
Поверхностно-акустические волны (ПАВ) Капилляры, сопряженные с поверхностью кристалла; управляемое поле высокой частоты; гидрофобная поверхность. Перемещение 2 мкм • с-1
На рисунках обозначено: 1 — капилляр; 2 — сепарационный канал; 3 — кристалл нитрида алюминия; 4 — встречно-штырьевые преобразователи; 4 — характерный размер капилляра; с — молярная концентрация (моль • л-1); Е — напряженность электрического поля; Ие — число Рейнольдса.
4. Смешивание
Пассивные смесители
Диффузионное смешивание: Ие < 2; г = п < х >2 / 4Б Угол атаки — любой. Ре = 30 ■ 100. Формирование ламелей
Конвективное смешивание: Ие > 4; Ре > 1000 Ламинарные вихри; сложение импульсов; геометрические препятствия
Активные смесители
Пьезоэлектрические актюаторы Композиты на полимерной основе; трафаретная печать
ПАВ; пьезоэлектрический кристалл, встречно-штырьевые преобразователи Система капилляров на поверхности кристалла; управляемое поле высокой частоты; гидрофобная поверхность f = 10 ■ 150 МГц; и = 30 ■ 50 мВ. Время перемешивания — 2-10 с
Продолжение табл. 2
Операция, принцип работы
Конструктивно-технологическое решение и примеры реализации
Титраторы
Каскадное разбавление проб. Регулирование потоков за счет микрогидравлического сопротивления: ~ Ь, ~ г-4
Расчет микрогидравлических схем. Закон Пуазейля (ф = пДрг4 / 8vL) и принцип эквивалентных электрических цепей
На рисунках обозначено: 1 — пассивный смеситель в виде плоской воронки; 2 — пьезоэлектрический композит (печать); 3 — кристалл нитрида алюминия; 4 — встречно-штырьевые преобразователи; Ие — число Рейнольдса; Ре — число Пекле; х — среднеквадратическое перемещение; г| — вязкость; í — время; f — частота; и — электрическое смещение; Ь — длина капилляра; г — радиус капилляра; ф — гидравлическое сопротивление; V — скорость потока.
5. Сепарация
Электрофорез
Разделение заряженных молекул и частиц. Электрическое поле (Е), капилляр свободный или заполненный инертной средой Капилляр круглый: d = 50 ■ 100 мкм; прямоугольный: a = 5 ■ 20 мкм; b = = 50 ■ 200 мкм; E = 10 ■ 150 В • мм-1, с < 10 мM
Хроматография
Разделение жидких и газообразных веществ. Межфазное распределение: относительное перемещение фаз Гибридный хроматографический микрочип; планарная колонка, упакована сферическим 8Ю2 (Диасфер), = 30 ^100 мВ; электроосмотический или гидравлический поток
Высокоэффективное разделение микропроб. Микроколонки: г = = 150 ■ 250 мкм; Ь = 5 ■ 15 см; = 5 мкм. Наноколонки: г = = 25 ■ 50 мкм; капилляры круглого или прямоугольного сечения; слои; = 1 ■ 3 мкм Упаковка суспензионным методом; гибридное сопряжение с детектором; объем детектора < 60 нл. Эффективность — до 140 000 теоретических тарелок на метр при гидравлическом транспорте, до 250 • 103 т.т. м-1 — при электроосмотическом транспорте
Разделение фрагментов ДНК. Интегральные наноколонки: рельеф, имитирующий гель Фотолиторгафия; оптимизированная гидравлика и массоперенос. Скоростная сепарация фрагментов ДНК (фоторезист 8И-8 1225)
Система капилляров для газовой хроматографии на кремниевой подложке Кремний, травление; капилляр Ь = 2 м; 4 = 100 мкм, чип: 18 х 20 мм. Термо-резистивные и термочувствительные элементы на базе структур Б1С.
peek/sio2
n^SO2/SO2nMMA/№/SiO2/nMMA
Зона ДНК
На рисунках обозначено: 1 — слой с рельефом топологии микрофлюидной системы; 2 — колонка; 3 —порт жидкостного доступа; 4 — киноформ; 5 — фотодиод; 6 — реактор; 7 — крышка-светофильтр, содержащая микрооптический элемент; 8 — тоководные ламели; 9 — светодиод; 10 — шаровая линза; 11 — база; 12 — оптоволокно; 13 —детекторный объем; d — диаметр капилляра; а, б — глубина и ширина капилляра; Е — напряженность электрического поля; c — концентрация фонового электролита; Z — дзета-потенциал; dp — диаметр частицы; r, L — радиус и длина колонки; PEEK — полиэфир эфир кетон; ПИ — полиимид; ПММА — полиметил метакрилат (акриловое стекло).
6. Сенсорика
Флюориметрия, ЛИФ
Детектирование в капилляре; объем пробы — менее 50 нл. Малоапер-турный источник первичного излучения; мощность — более 10 МВт, высокосветосильный фотоприемник; интегральная оптика Микроимпринтинг оптических элементов (линзы, киноформ) в термопластическом субстрате; полимерные световоды, формирование дифракционных решеток высокого разрешения; фотоэлемент большой площади
Флюориметрия частиц в капилляре и в потоке газа или жидкости Высокосветосильные схемы приема. Сферические голографические решетки. Многоканальный светочувствительный элемент
Рибофлавин
| № 1 (19)/2012
биотехносфера
Продолжение табл. 2
Операция, принцип работы
Конструктивно-технологическое решение и примеры реализации
Биораспознавание и светочувствительная матрица
Иммобилизация биомаркеров на ла-тексных микрочастицах (ёр = 1 мкм). Скорость реакции повышается в 10100 раз по сравнению с макровариантом, чувствительность — в 10 раз
Микроплатформа, размер ячеек 30-1000 мкм. Объем суспензии 20-200 нл, пробы — 100 нл. Инкубирование — 2 мин. Контактная регистрация на КМОП-сенсоре: К-контроль, положительная реакция — просветление поля
Химическая реакция, селективное детектирование
Сенсор белков, ферментов, токсинов. Химическая реакция с изменением оптического поглощения, цвета, выделением света
Иммобилизация ионов, реагентов. Система смесителей, реакторов. Оптический датчик. Хромофорные группы
Светорассеяние
Экспрессное определение размера и подвижности частиц. Динамическое рассеяние света. Корреляционная спектроскопия
Лазерный источник излучения, приемник сверхмалой апертуры, коррелятор. Планарный полимерный, стеклянный или гибридный чип
Поверхностные акустические волны
Регистрация летучих веществ. Обратный пьезоэлектрический эффект
Встречно-штырьевые преобразователи, 10 МГц - 10 ГГц; сопло для образца
Ионный детектор
Детектирование летучих веществ. Электронная эмиссия, ионный детектор
Гибридно-интегрированный нанотруб-чатый автоэмиссионный катод на основе анодного оксида алюминия, модифицированного N1
На рисунках обозначено: 1 — светодиод; 2 — крышка/светофильтр; 3 — фотодиод большой площади; 4 — интегральный киноформ; 5 — сечение капилляра; 6 — полимерный световод; 7 — база; 8 — микролинза; 9 — сопло для газообразного образца; 10 — ниобат лития; 11 — встречно-штырьевой преобразователь; 12 — анодный оксид алюминия; 13 — нанопора, модифицированная Ni; АСМ в электростатической моде с визуализацией потока электронов из поры.
К настоящему времени назрела необходимость создания стандартизованной компонентной базы для построения гибких миниатюрных аналитических систем. В основу такой компонентной базы могут быть положены научные разработки, представленные в табл. 2.
Аналитическая система содержит ряд типовых модулей:
1) модуль предочистки, пробоподготовки и ввода пробы;
2) модуль обработки пробы (например, модули: накопления микроорганизмов в микроростовой камере [9]; накопления генетического материала с помощью полимеразной цепной реакции в микро-термоциклере [10]; реактор);
3) аналитический модуль [11-13] (электрофорез, хроматография);
4) модуль сенсорики [14,15];
4) модуль микрофлюидики;
5) подсистемы коммуникаций [16].
Конкурентоспособность лабораторий на чипе
подразумевает их низкую стоимость при одноразо-
вом использовании и применение безопасных нетоксичных материалов. Более того, современные требования экологической безопасности требуют более широкого использования биодеградируемых материалов, таких как природные и синтетические полимеры, например сополимеры на основе поли-гидроксибутирата, полигидроксивалерата, а также коллаген, хитозан, альгинат и другие, которые используются в корпусах или подсистемах коммуникаций (например, в виде полимерно-углеродных композитов, разработанных в СПбГЭТУ) [16].
Лаборатории на чипе для культуральной экспресс-идентификации инфекций и тестирования их антибиотикорезистентности
Инфекционные болезни продолжают оставаться одной из основных причин смертности, при этом все увереннее говорят о связи с инфекциями мно-
гих форм рака, хронической патологии сердца и сосудов, ЦНС, репродуктивной системы [17]. В то же время постановка диагноза на этиологическом уровне затруднена трудоемкостью и недоступностью микробиологического исследования. Из-за отсутствия информации об этиологии инфекционного процесса в подавляющем большинстве случаев лечение проводится эмпирическим путем, без учета чувствительности возбудителя болезни к антибактериальным препаратам. Это приводит к формированию устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов, хронизации и носительству инфекций, инвалидности и даже гибели пациентов. Существующие методы in vitro диагностики инфекционных заболеваний централизованы, трудоемки и, что самое существенное, длительны, и поэтому недостаточны для решения данной проблемы.
Идентификация микроорганизмов и тестирование АБР, как отмечено выше, является, по крайней мере, двухстадийным исследованием, включающим стадию накопления популяций микроорганизмов
в пробе с последующим отбором патогенов по видовым признакам, а затем рост в присутствии наборов антибиотиков, например методом дисков Кирби—Бауэра (рис. 4).
В основу портативного прибора для реализации экспресс-метода заложен принцип оптимизированного традиционного высокодостоверного культураль-ного (т. е. основанного на росте культур микроорганизмов и приобретении ими видовых свойств) метода путем его миниатюризации, повышения степени интеграции ЛНЧ за счет использования технологий микросистемной техники и микрофлюидики. Базовый состав такого прибора представлен на рис. 5. Для важнейшей задачи реализации экспресс-варианта культурального микробиологического исследования необходимо интегрировать и топологически структурировать процесс роста живых микроорганизмов, чтобы получить выигрыш во времени за счет синергетических эффектов самоорганизации и роста колоний на ростовых площадках миниатюрных микробиологических платформ, созданных
а)
б)
в)
Л*
г)
Рис. 4
Классический микробиологический анализ методом дисков Кирби—Бауэра для, тестирования АБР: а — рост колоний микробных клеток на кровяном агаре; б — перенос патогена в виде суспензии в резервуар с дисками, импрегнированными антибиотиками; в — рост патогенных микроорганизмов на мясо-пептонном агаре Мюллера—Хинтона (СПбГЭТУ—НИИЭМ им. Пастера); г — автоматический метод Кирби—Бауэра: 1 — колония; 2 — диск с антибиотиком
a)
б)
Рис. 5
Портативный прибор для микробиологического анализа: а — базовый состав прибора; б — базовый состав одноразовой лаборатории на чипе:
1 — источник питания; 2 — модуль управления; 3 — модули беспроводной связи, памяти; 4 — компьютер; 5 — монитор; 6 — резервуар для пробы; 7 — инкубатор; 8 — сенсоры; 9 — КМОП-сенсор; 10 — порт для лаборатории на чипе; 11 — емкости для реагентов и слива; 12 — полупроводниковые источники излучения; 13 — микронасос; 14 — входной резервуар для пробы; 15 — емкость для предочистки образца; 16 — база; 17 — ростовая платформа; 18 — оптическое окно для КМОП в безлинзовом устройстве мониторинга роста; 19 — оптическое окно с линзой; 20 — оптическое окно с фильтром; 21 — электроды для измерения импеданса; 22 — канал для транспорта колоний; 23 — электроды для измерения жизнеспособности микроорганизмов; 24 — матрица лунок для тестирования АБР; 25 — емкость для слива и обеззараживания; 26 — безопасный слив
Таблица 3 I Сравнительные технические характеристики методов микробиологического анализа
Технико-эксплуатационная характеристика Автоматический прибор У1ТЕК® 2-компакт 60 Полуавтоматический метод Кирби—Бауэра Приборный комплекс с лабораторией на чипе
Состав Считывающий прибор; одноразовые карточки; персональный компьютер Чашки Петри; наборы дисков, импрегнированных антибиотиками; инкубатор; микроскоп Портативный ридер; одноразовые лаборатории на чипе; блок для обеззараживания
Назначение Идентификация вида бактерий и дрожжей в штамме. Тестирование чувствительности патогенов к антибиотикам Тестирование чувствительности патогенов к антибиотикам Идентификация вида бактериального патогена, тестирование чувствительности патогенов к антибиотикам
Метод считывания информации по идентификации Колориметрия Не проводится Распознавание образов, флюориметрия, импеданс
Метод считывания информации по АБР Турбидиметрия Визуальная оценка с помощью линейки Динамическая микротурби-диметрия, граница роста, импеданс
Габаритные размеры, см 59,0 х 71,5 х 67,25 433 х 516 х 618 (термостат) 15,0 х 20,0 х 30,0
Масса, кг 75 30 3
Мощность, Вт 1025 300 30
Количество модулей 2 (к одному ПК) 2 1
Уровень автоматизации Высокий Низкий Высокий
Производительность в сутки, образцов 60 штаммов 15 <40
Время одного анализа, ч 26-34 48-72 6
Количество антибиотиков 20 До 6 на одну чашку 20
Достоверность, % 90 95 91
Гибкость в переналадке Нет Да Да
Оценочная стоимость анализа, руб./анализ 2300 1000 600
Цена прибора, млн руб 4,0 (импорт в РФ) 0,03 0,06
на базе высокоаспектного микро-нанопористого анодного оксида алюминия совместно с Институтом физики Академии наук Белоруссии. Сравнительные характеристики известных приборов и предлагаемого технического решения представлены в табл. 3.
В экспоненциальной фазе роста бактерий время роста t можно определить из экспоненциального закона роста:
N = (1)
где N — число микроорганизмов (КОЕ) в колонии; N0 — начальное число колоний; ц — удельная скорость роста (ч-1), которая является основным лимитирующим фактором при реализации куль-турального микробиологического анализа, резко снижается. Это достигается работой в фазе экспоненциального роста и ограничением размера исследуемых колоний, т. е. работой с микроколониями (ювенильными колониями), содержащими не более 1000 КОЕ (см. рис. 3).
В соответствии с формулой (1) для получения колонии из 1000 микроорганизмов при экспоненциальном росте при удельной скорости роста 3 ч-1 из одной бактерии необходимо 2,3 ч.
Помимо культивирования и упорядоченного роста индивидуальных ювенильных моноколоний патогенных микроорганизмов необходимо обеспечить их автоматическое перемещение в смежные модули идентификации, сортировки и затем транспорта выделенных патогенов в ростовые модули для тестирования чувствительности к антибактериальным препаратам. Отделение микроколоний от зон роста подразумевает сохранение морфологии колонии, содержащей ее видовые признаки, полезные для идентификации. Эта процедура в микромасштабе осуществляется с помощью гидроудара, как показано на рис. 6, а—г. Идентификация юве-нильных колоний проводится в реальном масштабе времени с помощью регистрации сигналов сенсоров, включая: КМОП-сенсор, флюоресцентный спектроанализатор, акустический/импедансный сенсор. Для повышения достоверности используется алгоритм вычисления оценок сходства распознаваемого и эталонных объектов по системе ансамблей признаков (голосование) для выделения до четырех видов патогенных и условно патогенных микроорганизмов в одной пробе из всего видового многообразиия. Определение жизнеспособности
Биоэлектроника и биосенсорика
б)
а)
у \ Ф 1|1ЩШ^. % ШШ1, Ш.
ЛИ 1 нппп
МММ \
Б 2
5
¿Г
в)
Рис. 6
1 мкм
г)
• • •
• • о
_I 10 мкм
Р«
0
6
J 10 мкм
Сечение отверстия в ростовой пластине диаметром Б и ростовой нанопористой площадки с колонией микроорганизмов (а); момент отрыва колонии от ростовой площадки под действием гидроудара (б); поверхность и скол нанопористого оксида алюминия (в); пластина с ростовыми площадками и начало роста колоний (г):
1, 4 — анодный оксид алюминия; 2 — микропора заданного диаметра; 3 — нанопора; 5 — гидрофобное покрытие; 6 — микроорганизм, образующий колонию
а)
б)
в) А1А2А3А4А5А6
I I I I I I
Патоген
6
4
6
5
3
3
3
Рис. 7
Диффузионная граница антибиотик/патоген в мясо-пептонном агаре (а); пористый анодный оксид алюминия, йпор = 5,5 |лм (б); сечение модуля АБР на основе диффузионной границы в капилляре (в); сечение ростового модуля (г); сечение модуля АБР (д):
1 — ААО; 2 — поры; 3 — ростовая среда; 4 — микрооорганизмы; 5 — оптическое окно
Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение
микроколонии в модулях тестирования чувствительности к антибиотикам осуществляется с помощью линеИки до 20 антибиотиков методом многоканальной ближнепольноИ динамическоИ турби-диметрии, методом границы роста в капилляре, а также методом измерения импеданса.
Такая портативная диагностическая система должна легко перенастраиваться для работы с различным клиническим материалом и поиска воз-будителеИ различных групп инфекциИ:
• респираторных;
• желудочно-кишечного тракта;
• урогенитального тракта;
• внутрибольничных;
• факультативных.
Модули для роста культуры и тестирования АБР схематически представлены на рис. 7, а—д.
Заключение
Внедрение информационных технологий и телемедицины в сочетании с носимыми датчиками и приборами РосТ для ранней диагностики на месте оказания помощи, в том числе для диагностики инфекций, включая их антибиотикорезистентность, позволят уже в короткие сроки повысить эффективность медицинской помощи населению. Использование микробиологической ЛНЧ нового поколения на основе миниатюризации культурального, наиболее достоверного метода анализа, позволяет радикально сократить время диагностики, повысить точность и, благодаря портативности, сделать его децентрализованным и доступным для широкой врачебной практики.
Это внесет вклад в решение проблемы хрони-зации и носительства инфекций, сократит срок временной нетрудоспособности, инвалидизации и смертности населения из-за бактериальных инфекций благодаря оперативной постановке диагноза и эффективного использования антибиотиков.
| Литература |
1. United Nations Statistics Division. http://unstats.un.org/ unsd/demographic/products/socind/health.htm
2. http://www.who.int/countries/rus/en/
3. Инфекционная заболеваемость в РоссиИскоИ Федерации. 01.09.2010. http://www.rospotrebnadzor.ru/epidemiologic_ situation/40414/
4. Медведев О. С., Столяров И. Н. Перспективы телемедицины в России // Биология и медицинская наука. http://www. rfbr.ru/pics/28171ref/file.pdf
5. Сенкевич. Ю. И. Телемедицинские системы для диагностики состояния и лечебного воздеИствия на человека (Перспектива развития)// Биотехносфера. 2010. № 5—6 (11-12). С. 68-77.
6. Владзимирский А. В. Проблема формирования терминологии в телемедицине // Арх.клин.эксп.мед. 2001. Т. 10. № 1. С. 108-112.
7. Medicare and Medicaid Programs: Changes Affecting Hospital and Critical Access Hospital Conditions of Participation: Telemedicine Credentialing and Privileging // Federal Register. 2011. Vol. 76. No 87.
8. Point of Care Testing Applications of Microfluidics Technologies. Yole Développement. www.yole.fr.
9. Зимина Т. М., Соловьев А. В., Лучинин В. В. и др. Метод выращивания колониИ микробных клеток и способ для его осуществления, 2011.
10. Патент 2171467 РФ МПК7 G01N27/00. Микрореактор для химического и генетического тестирования / В. В. Лучинин, А. В. Корляков, Т. М. Зимина, И. В. Никитин. № 2000111917/28. Заявл. 05.04.2000. Опубл. 27.05.2004.
11. Зимина Т. М. Микро- и наноаналитические системы // На-нотехнология. Физика. Процессы. Диагностика. Приборы. М.: Физматлит, 2006. С. 517-551.
12. Зимина Т. М. Микро- и наноаналитические системы. Микро- и наносистемная техника. 2007. № 8. С. 27-49.
13. Зимина T. M. Миниатюрные аналитические системы биомедицинского назначения — лаборатории на чипе // Биотехносфера. 2009. № 1. С. 11-17.
14. Патент 2229699 РФ МПК7 G01N21/03. АналитическиИ капиллярныИ микрочип / Т. М. Зимина, М. Н. ПолянскиИ, В. В. Лучинин № 2000111917/28. Заявл. 05.04.2000. Опубл. 27.05.2004.
15. Патент 2280247 РФ, МПК7 G01N21/64, G01N21/03. Био-чип для флюоресцентного и люминесцентного анализа / Т. М. Зимина, В. В. Лучинин. № 2005120475/28; Заявл. 30.06.05. Опубл. 20.07.06. Бюл. № 20.
16. Патент 2229699 РФ МПК7 H 01 L 51/30. Электропроводя-щиИ композит для аналитического микрочипа / Т. М. Зимина, В. В. Лучинин, В. Л. Красиков. № 2004128373/28. Заявл. 23.09.2004. Опубл. 10.12.2005. Бюл. № 34.
17. Возианова Ж. И. Инфекционные болезни. Киев: Здоровье. 2000. Т. 1. 904 с.
