CC BY
82
2
Биоэлектроника и биосенсорика
УДК 621.315.592
Гвоздев Ю.А., инженер, соискатель,
Хафизов Р. А., инженер, магистрант,
Гаммадов Ш. М., магистрант,
Каблуков Д. Е., магистрант,
Соловьев А. В., канд. техн. наук, ст. науч. сотрудник,
Зимина Т. М., канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотрудник, доцент,
Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ», Центр микротехнологии и диагностики
Кузнецова Н. В., аспирант,
Technical University of Denmark1
Цветков Б. Н., научный сотрудник,
компания Corning1
Элементы микрогидравлической логики в лабораториях на чипе
Ключевые слова: булева логика, лаборатория на чипе, микрогидравлика, микросистемы, микрофлюидика. Keywords: boolean logic, lab-on-a-chip, microhydraulics, microsystems microfluidics.
В статье рассмотрены функциональные элементы микрофлюидной лаборатории на чипе для анализа биологических объектов с точки зрения формальной булевой логики. В частности, анализируется воплощение элемента «и», то есть смесителя, и элемента «или», то есть микрогидравлического ключа. Представлены примеры реализации данных элементов на основе принципов «гибкой электроники», с помощью толстопленочных технологий и их приложения в биомедицинском анализе.
Введение
Аналитические микросистемы, или лаборатории на чипе [1], — это интенсивно развивающееся муль-тидисциплинарное научно-техническое направление, связанное с миниатюризацией и интегрированием устройств и узлов инструментальной аналитической химии, а также диагностических систем, приборов на основе использования нанотехнологий, принципов и технологий микро- и наноэлектрони-ки и микросистемной техники. Достигнутые результаты показывают, что современная аналитическая химия, биология и медицина уже немыслимы без развития аналитических средств данного класса [2]. Представляя собой миниатюрные гибридные приборы, лаборатории на чипе содержат интегрированные структурные и функциональные элементы анализа, важнейшими из которых являются жидкостные и газовые транспортные каналы,
1 Работа выполнена в СПбГЭТУ.
элементы микрогидравлики (или микрофлюиди-ки) [3]. Преимущества интегрированных миниатюрных устройств для химического анализа заключаются в том, что благодаря масштабированию и проявляющимся при этом измененным соотношениям обобщенных массовых и поверхностных сил удается не только минимизировать энергозатраты и количество расходуемых реагентов для анализа, но и существенно повысить разрешение и скорость анализа [2]. Их схожесть с полупроводниковыми устройствами микроэлектронной индустрии позволяет широко использовать имеющиеся технологии, дающие значительные преимущества устройствам данного класса по сравнению с обычными настольными аналитическими приборами: низкую стоимость, компактность, мобильность, операционную простоту и надежность, возможность добавления параллельной архитектуры для решения большого количества различных аналитических задач.
Микрофлюидные системы лабораторий на чипе можно рассматривать как «жидкостные интегральные схемы» по аналогии с интегральными схемами твердотельной электроники. Однако микроаналитические системы развиваются не такими быстрыми темпами, как интегральные схемы твердотельной электроники. Направление миниатюризации и интегрирования системной логики реализуется на основе полупроводниковых твердотельных интегральных схем начиная с первых: германиевой, созданной Джеком Килби (Jack Kilby) в 1959, и кремниевой, созданной в том же году Робертом Нойсом (Robert Noyce). В России первые полупроводниковые интегральные микросхемы были разработаны в 1961 году (ТРТУ, Таганрог и НИИ-35, Москва). Через 20 лет после появления полупроводниковой
интегральной схемы С. Терри (Stephen C. Terry) с помощью жидкостной микролитографии создал первую модель интегрированного газового хроматографа на едином кремниевом чипе. Лишь в начале 1990-х годов предложена идея интегрирования капиллярной жидкостной логики А. Манцем (Andreas Мам): в 1991 году в Швейцарии создан первый образец планарного капиллярного аналитического чипа, выполненного методом микролитографии на стекле. Это положило начало направлению развития лабораторий на чипе.
Все упомянутые технические достижения решали эволюционные задачи снижения стоимости, материало- и энергоемкости изделий, а главное, повышения их производительности. Появление лабораторий на чипе было обусловлено также острой потребностью в увеличении скорости и качества анализа в связи с ожиданием новых открытий в исследовании генома, функций белков и пептидов и их применения в медицине. Имеющиеся классические аналитические средства не могли обеспечить требуемую производительность анализа, разработки, выполненные ранее с их помощью, создали фундамент для развития интегрированных аналитических систем [4].
И все же достижений оказалось недостаточно, чтобы удовлетворить аналитические потребности современной науки о живых системах. Возникла необходимость изменения основополагающих принципов, что привело к концепции микрофлюидных интегральных аналитических систем наподобие больших интегральных схем (БИС) в микроэлектронике [1, 5—8], которая позволила разрешить кризис аналитической химии, главным образом заключающийся в низкой производительности. В начале 90-х годов произошла информационная революция, когда скорость получения информации возросла на 3 порядка и более [2, 4].
В результате сделанных совместных усилий исследователей в различных областях, включая механику жидкости, термодинамику, прикладную физику, химию, материаловедение, технологию, биохимию, биотехнологию и медицину, исследованы многие аспекты проблемы создания интегрированных микрофлюидных систем, включая тепло- и мас-сообмен, химию, биологические взаимодействия. Появилось направление цифровой микрофлюидики. Как подраздел микрофлюидики, дискретная микро-флюидика включает устройства, которые производят микрокапли, обычно размером 10—100 мкм, или двухфазные системы на основе несмешивающихся жидкостей. Пример устройства с двумя последовательными инжекционными крестами для формирования монодисперсных капель микронного размера, содержащих клетки, представлен на рис. 1. Сопла для производства микрокапель имеют производительность до 10 кГц. Монодисперсные эмульсии «вода в масле» позволяют генерировать практически униразмерные (с отклонением от среднего раз-
Рис. 1
Формирование капель с клетками дрожжей с использованием гиперполиглицерола — полиэтиленгликоле-вого микрогеля (hPG-PEG)
мера 1—5 %) системы с объемами реакторов фемто-, пико- и нанолитр, причем в каждом таком микрореакторе с заданным химическим составом заключен груз — клетки, биомолекулы [10]. Тем не менее в настоящее время различают капельную микро-флюидику и цифровую микрофлюидику. В капельной микрофлюидике рассматривают капли, переносимые в непрерывной среде с помощью перепада давления. Цифровая микрофлюидика использует иные механизмы транспорта, такие как системы электродов, магнитопроводы и др., для перемещения, смешивания, проведения реакций, анализа или разделения капель с помощью, например, электросмачивания на диэлектрической подложке [11]. На рис. 2 представлен пример создания интегральной жидкостной системы, предназначенной для высокопроизводительной пробоподготовки клеток.
Запаздывание реализации [14] интегрированной микрофлюидной логики связано как с различием в подвижности основных носителей информации: потоков электронов в полупроводниках и металлах (10-1 м2 • В-1 • с-1) и потоков ионов в электролите (10-8 ■ 10-6 м2 • В-1 •с -1), так и с многообразием физических законов, важных при миниатюризации жидкостных систем. В этом направлении активную работу ведут многие исследовательские группы [15, 16].
В качестве устройств микрофлюидной логики можно рассматривать не только непосредственно
Рис. 2
Микрочип с жидкостной логикой для автоматической пробоподготовки единичных клеток [13]
биотехносфера
| № 6(30)/2013
жидкостные ключи [17], или жидкостные триггеры на основе пузырьковой логики (bubble logic [18]), но и смесители, в качестве «элементов сложения» — капилляры, регулирующие линейную скорость, или «таймеры», делители потока, титраторы и др.
Для того чтобы описать потенциальные возможности жидкостных логических элементов, в частности возможности их интегрирования, увеличения числа элементов и применения для автоматизации процессов жидкостной пробоподготовки на чипе, рассмотрим основы формальной логики на примере булевой логики [19].
Булева логика и микрофлюидные аналитические системы
Для выполнения анализа множества объектов необходимы их сортировка, адресная доставка и ряд других операций. Для их реализации, помимо исполнительных элементов, требуется применение принципов логики, например булевой логики [19, 20], основанной на законе исключения третьего, согласно которому логические переменные, в отличие от переменных обычной алгебры, могут принимать только два значения («да», «нет», «истинно», «ложно» и т. д.).
Булева логика явилась основным математическим инструментом для создания алгоритмов работы компьютеров, так как она легко преобразуется в логику битов (0 — ложно, 1 — истинно). На этой основе определяется ряд логических операций: сложения, умножения и др. [20].
Фундаментальным понятием булевой логики является таблица истинности, которая включает все возможные наборы значений аргументов логической функции и значения функции, соответствующие этим аргументам. В общем случае таблица истинности для функции от п переменных должна иметь 2п строк.
Основные логические операции, которые могут быть применены в микрофлюидной логике, включают: логическое перемножение (конъюнкцию) «И», логическое сложение (дизъюнкцию) («ИЛИ»), штрих
Таблица 1 Таблица истинности для описания параллельного течения двух жидкостей в двухкомпонентных микросмесителях с использованием логической функции «И»
Входная переменная (нормированное давление) Выходная функция переменная (сигнал на входные клапаны)
Р1 Р2 f
1 0 0
0 1 0
0 0 0
1 1 1
Рис. 3
Реализация параллельного течения двух жидкостей в двухкомпонентных микросмесителях
Шеффера («И-НЕ») и др. [21]. Используя основные логические операции, можно реализовать актюацию потоков как в микросмесителе, так и в сепараторе. Поставим задачу для двухкомпонентного микросмесителя.
Для реализации параллельного течения двух потоков необходимо прецизионное управление величинами давления Р1 и Р2 на входах в каналы 1 и 2 (рис. 3). Таблица истинности для этого случая представлена в табл. 1, где Р1 и Р2 — переменные (или операнды, или аргументы), которые могут принимать значения из множества {0,1}, а / — функция «И», или логическое умножение, которая также принимает значения из множества {0,1}.
В таком элементе давление в каналах 1 и 2 (рис. 3) контролируется микрофлюидными или микромеханическими клапанами с чувствительными датчиками давления, которые будут реагировать на изменение давления (~100 Па) прецизионно либо с помощью внешних насосов. При достижении заданных величин давления в обоих каналах отпираются микрофлюидные клапаны, и жидкости поступят в смесительный узел, продолжая движение по каналу 3, не перемешиваясь друг с другом как две раздельные фазы (рис. 3).
Такая конфигурация может быть применена для сепарационных систем с межфазным массообме-ном, например систем очистки крови или других биологических жидкостей, микроэкстракции компонентов из сырья и многих других.
Для решения задач анализа в микрофлюидных системах часто, напротив, необходимо эффективное смешивание двух потоков (рис. 4). В этом случае таблица истинности будет выглядеть так же, как табл. 1. Для достижения эффективного перемешивания двух потоков потребуется соблюсти условия перехода к хаосу: повышение линейной скорости потоков, формирование хаотропных компонентов, например геометрических препятствий, или варьирование скоростей потоков для дестабилизации
1
3
1 \
\
а)
б)
Рис. 4
Реализация корректного смешения двух жидкостей в двухкомпонентных микросмесителях
и т. п. Смесители с перемешиванием потоков могут использоваться в лабораториях на чипе в модулях пробоподготовки или в модулях селективного детектирования компонентов с помощью специфических химических реакций.
Известны аналитические задачи, связанные с сепарацией и адресной доставкой микро- и наноча-стиц. Такие задачи есть в системах для сортировки клеток [22], в микробиологическом анализе для выделения патогена [23]. Последняя задача, в частности, ставится при выделении бактериального патогена из суспензии клеток в микробиологической пробе в целях идентификации и тестирования, например, на предмет оценки антибиотикорезистент-ности. В данном случае реализация актюации потока осуществляется иным способом: требуется упорядочение расположения частиц в потоке в виде колонны, друг за другом, для чего топология такого модуля может содержать узел формирования футлярного потока. Топологии таких конструкций могут быть достаточно разнообразными. На рис. 5, а показан модуль сортировки частиц с одним актю-ирующим соплом 3, приемными резервуарами 1 и 2 и узлом формирования футлярного потока 7 для позиционирования струи с частицами по центру канала 5. На рис. 5, б показан в увеличенном масштабе узел сепарации 3 данного модуля, содержащий актюирующее сопло, формирующее по внешнему сигналу поток, имеющий скорость Уа, отклоняющий выбранную системой распознавания частицу в емкость для накопления фракции частиц заданного типа. На рис. 5, в показан узел создания футлярного потока с помощью двух симметричных сопел (элемент 6 на рис. 5, а). Описанный модуль предназначен для выделения одного вида частиц из смеси (или одной группы частиц).
На рис. 6 показан модуль сепарации частиц с двумя соплами, который применим для разделения частиц на две фракции.
в)
Рис. 5 Топология модуля сортировки частиц с одним управляющим актюатором (а) и увеличенное изображение узла сортировки (б) и узла фокусирования потока (в):
1 — емкость для приема частиц; 2 — емкость для слива; 3 — узел сортировки; 4 — вход для потока жидкости в сопле; 5 — канал для транспорта образца; 6 — обводной канал для создания футлярного потока с входным фильтром; 7 — резервуар для загрузки суспензии; 8 — база; V — скорость потока в сопле микрофлюидного актюатора;
^ф — скорость футлярного потока
Конструкция сепараторов отличается от конструкции микросмесителей, поэтому будет другой и булева логика. Рассмотрим подробнее систему с одним управляющим актюатором, показанную на рис. 5, а. Суспензия загружается во входной резервуар 7, от которого отходят дуговые каналы 6 с входными фильтрами для задержки частиц, ко-
а)
3
/
° д Л
4 в- О г--4 о |Го
о О "о
о < 1э
б)
Рис. 6
Топология сепарационного модуля с двумя управляющими актюаторами (а), увеличенное изображение узла сепарации (б):
1, 4 — вход для жидкой среды и сопла; 2, 3 — емкости для приема частиц данного вида; 5 — узел сортировки (показан в масштабе на рис. 4, б); 6 — канал для транспорта частиц; 7 — вход для суспензии частиц; 8 — база; Уа1 , Уа4 — скорость потока в соплах микрофлюидного ключа
2
6
7
8
1
2
4
биотехносфера
I № Б(30)/200
торые обеспечивают футлярный поток, выстраивающий частицы в один ряд при входе в основной канал системы. Непосредственно перед сепараци-онным узлом 3 располагается модуль распознавания, например видеосенсор, регистрирующий и идентифицирующий частицу и передающий сигнал в управляющую систему (логический элемент). Логический элемент, в свою очередь, сопряжен с узлом сепарации (или микрофлюидным ключем) или клапаном, расположенным в канале перед резервуаром 1. Видеосенсор считывает информацию о частице и посылает сигнал 0 или 1 на управляющий клапан. Таким образом, одни частицы пойдут прямо, без отклонения от заданной траектории, другие же будут смещены в соседний резервуар путем подачи дополнительного импульса из сопла, соединенного с резервуаром 3. Таблица истинности такой системы для сепарации частиц двух видов представлена в табл. 2. В данном случае подразумевается, что микрофлюидный клапан будет отпираться тогда и только тогда, когда фотодиод сможет распознавать лишь один вид частиц из двух. В противном случае, если частиц в канале нет или они неразличимы между собой, клапан остается закрытым.
В случае с двумя логическими элементами (см. рис. 6) перед сепарационным узлом также располагается видеосенсор, но логическая схема управления микрофлюидными клапанами и таблица истинности будут иметь другой вид. В случае прохождения одного вида частиц по основному каналу видеосенсор будет подавать сигнал срабатывания / = 1 на актюатор 4 (рис. 6), а в случае прохождения частиц второго вида видеосенсор будет выдавать сигнал срабатывания /2 = 0 и отправлять его на актюатор 1. Корректировка движения частиц с помощью актюаторов будет проходить крест-накрест. Таблица истинности для такой системы представлена в табл. 3, где а и Ь — переменные, связанные с распознаванием частиц 1-го или 2-го вида соответственно, а /1 и /2 — логические функции управления микрофлюидными актюаторами 4 и 7 (рис. 6), причем срабатыванию актюаторов соответствует /1 = 1 и /2 = 0.
Таблица 3 Таблица истинности для сепарационного модуля с двумя микрофлюидными актюаторами, сортирующего два вида частиц
Входная переменная (тип частицы) Выходная функция (сигнал на микрофлюидный клапан)
а Ь /1 /2
1 0 1 1
0 0 0 1
0 1 0 0
Таким образом, на приведенных простейших примерах показано, как булева логика может найти практическое применение в микрофлюидных системах и, в частности, в биомедицинских приложениях. С усовершенствованием диагностических средств для сепарации или, наоборот, смешивания потоков логика управления будет лишь дополняться элементами микропроцессорной техники и способами их комбинирования для более совершенной актюации потоков и адресной доставки образцов в заданные области более сложных микрофлюидных чипов.
Для реализации булевой логики необходимо выполнение ряда условий: реализация достаточно высокого быстродействия, определение входных переменных и их сопоставление с физическими измеряемыми параметрами. Далее будут рассмотрены варианты реализации некоторых элементов микрофлюидных систем, которые могут служить в качестве логических элементов.
Элементы для осуществления слияния потоков, или элементы «И»
Капиллярные устройства для слияния потоков в лабораториях на чипе можно назвать элементами конъюнкции, или элементами «И». Эффективное смешивание потоков жидкости в таких устройствах — это важный этап осуществления пробопод-готовки и анализа и функционирования сложных интегральных жидкостных систем. Микросмесители могут быть реализованы как на основе диффузии (рис. 7, а), так и на основе конвекции (рис. 7, б) [24]. Но реализация смесителей как первого, так и второго типа затруднена, с одной стороны, зависимостью от коэффициентов диффузии компонентов, а с другой — низкими числами Рейнольдса, характерными для течения в капиллярах, при которых малый импульс жидкости не допускает образование устойчивых вихрей.
Для смесителей первого типа скорость и качество смешивания в микроканалах зависят от диффузионного транспорта вещества. Задачу диффузионного перемешивания решали теоретически в ряде работ, включая аналитический подход и численное
Таблица 2 Таблица истинности для реализации сепарации частиц двух видов с одним микрофлюидным актюатором (или клапаном)
Входная переменная (тип частицы) Выходная переменная (сигнал на микрофлюидный клапан)
а Ь /
1 0 1
0 1 1
0 0 0
1 1 0
а)
б)
Рис. 7
А + В
А + В
Элементы перемешивания потоков, или элементы «И»: а — диффузионное перемешивание параллельных потоков; б — конвективное перемешивание. Стрелками показано направление входящих потоков компонентов А и В
Таблица 4 Среднеквадратичное перемещение <х2>1/2 за время 10 с для частиц различных размеров
Вещество Стоксов радиус частицы г, нм Коэффициент диффузии Б, м2 с-1 Время среднеквадратичного диффузионного перемещения частицы <х2>1/2, мкм
Небольшой белок (лизоцим) 3 7,15 • 10-11 37,8
Частица латекса 500 4,29 • 10-13 2,93
Аминокислота (триптофан) 0,5 4,29 • 10-10 92,6
Нуклеотид 0,5 4,29 • 10-10 92,6
моделирование при варьировании коэффициентов диффузии, ширины и длины канала [25].
В большинстве проблем на макроуровне коэффициент диффузии жидкостей определяется из закона Фика:
Ф = - Б
йе йх 9
(1)
где Ф — поток компонентов; с — концентрация; Б — коэффициент диффузии.
Коэффициент диффузии в соответствии с формулой Эйнштейна равен
Б = ИТ / 6рцг,
(2)
где к — константа Больцмана; Т — абсолютная температура; ц — коэффициент вязкости; г — Сток-сов радиус частицы.
Для двумерной модели планарного микромиксера с двумя входящими потоками [26] двумерное уравнение транспорта в координатах х, у формулируется как
Б
§2е + 82е 8х2 8у2
= V
Ъе 8* ,
(3)
где V — линейная скорость потока; * — время.
Подобные задачи обычно превращают в безразмерные через число Пекле Ре:
Ре = vW / Б,
(4)
где V — линейная скорость потока; W — ширина канала.
Согласующиеся решения уравнения (3) для распределения концентрации получены в работе [27]. Из них следует, что короткие смесительные каналы требуют условий малых чисел Пекле, которые соответствуют малым скоростям, малой ширине канала или высокому коэффициенту диффузии. Вместе с тем при простоте организации миксера в микроаналитической системе диффузионное смешивание, как было сказано выше, имеет серьезные недостат-
ки — зависимость скорости перемешивания от коэффициентов диффузии и необходимость достаточно длинного и узкого капилляра для надежного смешивания.
Можно оценить время среднеквадратичного диффузионного перемещения частицы <х2>1/2 следующим образом:
<х2 >1/2 = (ИТ/3рцг )1/2 уП .
(5)
В табл. 4 приведены рассчитанные по формуле (5) данные для перемещения частиц с различными коэффициентами диффузии, которые позволят определить характерные размеры смесителя, в котором можно ожидать диффузионного перемешивания за 10 с.
На рис. 8 представлен график зависимости <х2>1/2 от времени для частицы радиусом 1 мкм. Видно, что перемещение на расстояние 7 мкм потребует 100 с. Это время слишком велико для реализации экспресс-анализа с применением микрофлюидной системы и принципов булевой логики.
С целью снижения величины Ре можно создавать в архитектуре микрофлюидного устройства узкие
8
7 6
I 5 «г 4 #3 2 1 0
10 20 30 40
50 с
60 70 80 90 100
Рис. 8
Зависимость среднеквадратичного диффузионного перемещения частицы <х2>1/2 диаметром 1 мкм от времени *
биотехносфера
| № 6(303/2013
каналы, своего рода резистивные элементы [28]. Такая конструкция позволяет быстро произвести перемешивание в течение заданного времени. На примере перемешивания воды и фенола показано, что время диффузии можно снизить с 35 до 4 с, уменьшив ширину канала с 300 до 100 мкм.
Диффузионные миксеры легко реализуются и могут представлять разнообразную архитектуру, например Т-типа [29], Ъ-типа [30], в виде змеевика [31] или с делением потока [32]. Имеются данные, что изменение угла в устройстве Т-типа существенно не влияет на качество смешивания. В каналах Ъ-формы изгиб вызывает появление центрированных вихрей, которые помогают процессу вращения и улучшают перемешивание (см. рис. 5, б). При достаточно низких числах Рейнольдса вихри быстро затухают и не успевают эффективно закрутить жидкость. Для повышения эффективности таких вихрей нужно использовать много поворотов на плоскости или вне плоскости, расщеплять потоки и объединять их с образованием тонких ламелей, что существенно снизит время перемешивания по сравнению с простой диффузией благодаря делению каждого потока на п струй, что дает в п2 раз
б)
г)
Рис. 9
Примеры капиллярной системы исследованных миксеров с различными углами атаки потоков
Рис. 10
Установка для исследования смесителей:
1 — выход; 2 — смесительная камера; 3 — вход компонента 1; 4 — вход компонента 2
более быстрое перемешивание. Однако, как показывает практика, эти устройства пока недостаточно эффективны и требуют использования высоких технологий.
Проведено экспериментальное исследование ряда смесителей Т-типа с целью определить влияние линейной скорости и угла потока на перемешивание в полимерном устройстве с высокой шероховатостью поверхности. Образцы изготовлены с помощью толстопленочной технологии на полимерных подложках из полиметилметакрилата (ПММА) с рельефом, выполненным в полихлорвиниловой пленке с помощью лазерной абляции (рис. 9), подложки герметизированы крышками из ПММА с отверстиями.
Конструкция собрана путем спекания при температуре 110 °С при давлении 300 г/см2. Ширина каналов подачи — 200 мкм, стока — 400 мкм. Для наблюдения смешивания использовали водный раствор 0,01 моль • л-1 МаОИ (1) и раствор флюо-ресцеина 10-4 моль • л-1 в 0,01 моль • л-1 МаОИ (2) (рис. 10).
Оценим диапазон чисел Рейнольдса Яв, характеризующих поток в таких смесителях, то есть отношение сил инерции, действующих в потоке, к силам вязкости, определяемых соотношением:
Re = pvl / h,
(6)
жидкости: а — 270°; б — 180° г — смеситель в сборке
90°
где р — плотность среды; I — характерный размер; "Л — динамическая вязкость среды.
Плотность и вязкость среды можно считать 106 г • м-3 и 1 • 10-3 н.с.м-2 соответственно, так как концентрации щелочи и флюорофора малы, то их влиянием в водном растворе можно пренебречь. Характерный размер (эквивалентный радиус) канала
4
3
2
1
в
Таблица 5 I Число Пекле для различных смесителей
Номер образца Линейная скорость v, м • с-1 Коэффициент диффузии D, м2 • с-1 Число Пекле Pe
Радиус частиц R = 250 мкм Радиус частиц R = 50 мкм
1 10-2 7,15- 1011 35 000 —
2 10-2 4,29 • 1010 5830 —
3 10-4 7,15 • 1011 — 70
4 10-4 4,29 • 10-10 — 11
250 • 10-6 м и скорость 8,8 • 10-2 м • с-1. Получаем максимальное значение Remax = 2,2.
Оценки величин числа Пекле для рассматриваемых смесителей, полученные с помощью определения (4), представлены в табл. 5. Из оценок следует, что для эффективного перемешивания необходимо получить числа Пекле порядка 10-50. Исследовали ряд смесителей, выполненных с помощью толстопленочных технологий с использованием программы AutoCAD, лазерной резки («МультиТех», Санкт-Петербург) и спекания (рис. 11). В смесителях подача растворов осуществлялась через капилляры 1 и 2 от шприцевого насоса с заданной объемной скоростью через схему с T-образным раз-ветвителем. Диапазон объемных скоростей обеспечил линейные скорости подачи в каналах от 0,1 до 8,8 мм • с-1. Микрофотографии картин слияния потоков представлены на рис. 11.
а)
б)
Проведенные эксперименты показали, что в смесителях четырех типов при углах потоков 60°, 90°, 180° и 270° конвективное смешивание не происходит во всем диапазоне исследованных скоростей (0,1-8,8 мм • с-1) и фазы сохраняют четкую границу раздела. Варьирование соотношения скоростей во входных каналах не приводит к разрушению линий тока, а смещает границу параллельно оси симметрии смесителя (рис. 11, в). Это явление позволяет контролировать заданные пропорции раствора и относительные скорости потоков. Числа Рейнольдса находятся в диапазоне 0,1-2,2. При таких условиях импульс потока недостаточен для образования вихря, а встречное направление течения приводит к потере энергии.
Для повышения эффективности перемешивания изготовлен смеситель типа плоской воронки, конструкция которого представлена на рис. 12. В данной системе удалось наблюдать образование вихрей, но не удалось получить хаотического переме-
Рис. 11
Течение жидкостей в Т-образных смесителях с различными углами атаки потоков: а, б — 270°; в — 180°; г — 90°; д — 60°. Линейная скорость входящих потоков — 5 мм/с
Рис. 12
Конструкция четырехслойной сэндвич-структуры смесителя типа плоской воронки (а) и фотографии смесительной камеры (б) и общего вида (в)
| №
биотехносфера
6(30)/2013
б)
а)
б)
Рис. 13
Потоки в смесителе типа плоской воронки: а — сечение камеры смесителя, где стрелками показано направление потоков; б — фотография перемешивающихся потоков 1 и 2:
1 — 0,01 моль/л ЫаОИ; 2 — 10-4 моль/л флюоресцеина в растворе 1
а)
б)
А—А
Рис. 14 Микромиксер типа плоской воронки, герметизированный методом стяжки на винтах на стальной базе: а — общий вид; б — ход движения жидкости в микросмесителе типа плоской воронки в продольном разрезе А—А
шивания образца во всем объеме. Числа Рейнольдса в воронке можно оценить как Яв = 4,4 (рис. 13, б).
Таким образом, поскольку диффузионное пассивное смешивание в канале имеет и временные, и пространственные ограничения, его использование в лабораториях на чипе рационально только для низкомолекулярных веществ, если будут достаточно узкие каналы. Некоторая хаотизация потока в смесителе с помощью сложения импульсов в плоской воронке позволяет облегчить диффузионное перемешивание, так как создает тонкие ламели, которые существуют некоторое время и при этом сокращают расстояния между потоками фаз. Дополнительное
Рис. 15
Чертежи трех слоев микросмесителя: а — верхний слой; б — средний слой; в — нижний слой
Рис. 16 Смесители с различными формами входного капилляра: а — длинный конфузор; б — короткий конфузор у входа в плоскую воронку
активное перемешивание позволяет сократить длину диффузионного смесителя и время перемешивания более чем на порядок, а это принципиально важно для создания систем экспресс-анализа.
Проведена оптимизация смесителя типа плоской воронки. Микромиксер был герметизирован путем стягиванием пленочной многослойной структуры на базе с позиционирующими штырями (рис. 14). Данная технология позволила исследовать целый ряд слоев с рисунком различной геометрии и изучить влияние геометрии входных каналов, их ширину, соотношение диаметра воронки и стока.
Рисунок основных слоев микросмесителя, как и в предыдущем описанном случае, выполнен с помощью программы AutoCAD и сформирован с помощью лазерной резки («МультиТех», Санкт-Петербург). Верхний слой трехслойной конструкции (рис. 15, а) содержит смесительную камеру и сопряженные с ней входные капилляры для жидкости заданной ширины, расположенные под углом 180° относительно друг друга, выходного капилляра шириной 440 мкм, двух входных и одного выходного резервуаров. Центральный слой (рис. 15, б) имеет два отверстия заданного диаметра, которые совпадают с капилляром нижнего слоя (рис. 15, в).
Изготовлена линейка, состоящая из четырех образцов, имеющих смесительную камеру с разными внешними диаметрами: 1,4; 2,0; 3,0; 4,0 мм. Входные капилляры представляют собой коническое сопло большего размера у входных резервуаров и сужающиеся к смесительной камере (рис. 16, а) либо каналы с параллельными краями (рис. 16, б).
Важным этапом сборки является прецизионное соединение всех деталей. Конструкция имеет две направляющие, которые позволяют сопоставить детали с достаточной точностью (рис. 17).
Значительное влияние на качество смешивания оказывают конфигурация смеси-
а)
б)
а)
б)
Рис. 17
Смеситель плоская воронка (а) и общий вид устройства смесительной камеры с присоединенными капиллярами (б)
теля, его геометрические размеры и физико-химические параметры растворов. На рис. 18 показано влияние аспектного отношения R/r = 2,3; 6,6 воронки (R — внешний радиус воронки; r — радиус стока) для двух образцов на скорость перемешивания, визуализированную с помощью цветной реакции фенолфталеина и слабого раствора соляной кислоты. На рис. 18, в видно, что более высокая величина аспектного отношения дает лучший результат перемешивания при равном времени.
а) б)
Рис. 19 Образование фуксинового цвета фенолфталеина при взаимодействии с гидроксидом калия при варьировании скорости подачи одного из растворов: а — равные скорости; б — скорость потока гидроксида калия выше; в — скорость фенолфталеина выше
Периодическое варьирование одной из скоростей во входных соплах, одной из подаваемых жидкостей, увеличивает вероятность перемешивания. Нелинейная скорость обеспечивает пульсации, доставляет жидкость порциями в смесительную камеру, нарушая, таким образом, равновесие и увеличивая площадь взаимодействия потоков (рис. 19).
Для приведенных на рис. 20 конфигураций смесительной камеры диаметром 3 мм смешивание
0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3,0 3,3 Линейная скорость, мм/с
Рис. 18
Влияние аспектного отношения воронки на скорость перемешивания: а — R/r = 2,3; б — R/r = 6,6; в — график зависимости степени перемешивания от линейной скорости для исследуемых смесительных камер:
1-4 — аспектные отношения: 1 — 2,3; 2 — 3,3; 3 — 5,0; 4 — 6,6 %; 5 — Т-образный капилляр
Таблица 6 Измеренные граничные скорости для смесителя с входными капиллярами, выполненными в виде конфузоров
Граничная объемная скорость, мкл • с-1 Диаметр стока, мкм
600 220
Без изменения плотности жидкости 1,62 25,93
Для жидкостей различной плотности Перемешивается при любых скоростях 25,93
биотехносфера
| № B(30J/2QQ
12
Биоэлектроника и биосенсорика
происходит при скорости потока на входе в воронку 1,72 мм • с-1. Для воронки диаметром 2,00 мм установлено, что диаметр стока 600 мкм (рис. 20, а) и 220 мкм (рис. 20, б) обеспечивает повышение скорости перемешивания. Кроме того, установлено, что при входных капиллярах в виде конфузо-ра скорость перемешивания также повышается. Результаты измерения граничных скоростей представлены в табл. 6.
При возникновении какого-либо препятствия в смесительной камере поток закручивается более эффективно, и при такой топологии вероятность получения ламинарных вихрей и ламелей возрастает.
Многоступенчатые микрофлюидные элементы
Принципы перемешивания учитываются при создании более сложных микрофлюидных элементов, например скоростных титраторов, применяемых в биомедицинском анализе для определения исходной концентрации целевого компонента. На рис. 21 показан трехступенчатый титратор 2N(N = 3), в котором имеется два входа: один — для анализируемого раствора, второй — для растворителя, и три смесителя. Объемная подача компонентов в каждом каскаде задается величиной площади сечения входного капилляра, определяющей его гидравлическое сопротивление. Логическая схема такого смесителя, работающего как непрерывная проточная система, построенная на основе элементов «И», представлена на рис. 21, в, а таблица истинности, имеющая достаточно очевидный вид, не приводится.
В отличие от титратора, микрофлюидный каскадный анализатор с тремя элементами смешивания (рис. 22, а) имеет более сложную логику благодаря
а)
в)
х0 & х1 & х2 & /
\
А В С
Рис. 21
Смеситель 2х, где х = 3: а — топология; б — чип на базе полиметилметакрилатной подложки (й = 1 мм) и рисунка, сформированного с помощью фоторезистивной защитной пленки на эпоксидной основе, герметизированного лавсановой пленкой; в — логическая схема смесителя
б)
Рис. 22
Микрофлюдный анализатор с тремя элементами смешивания (а) и его логическая схема на основе элементов «И-НЕ» (б)
наличию двух дополнительных независимых элементов. Анализатор имеет вход Х» для пробы, а также входы А, В и С для реагентов, дающих цветную реакцию (см. рис. 19) на присутствие искомого компонента. Результат анализа считывается в смесительных камерах. Для построения логической схемы в данном случае используются функции «И-НЕ» (рис. 22, б).
Таблица истинности для обнаружения трех компонентов в пробе с использованием трех реагентов цветных реакций представлена в табл. 7. Видно, что проточный микрофлюидный анализатор для определения трех неизвестных компонентов в пробе по их цветным реакциям, содержащий три смесителя и сопряженные с ними оптические датчики цвета, может быть описан логической функцией «И-НЕ». Такая схема позволяет определить, какой из трех предполагаемых компонентов присутствует в пробе, по остановке процесса после реализации соответствующего каскада.
Известны аналитические задачи, когда необходимо идентифицировать дискретный компонент пробы, например клеточный кластер. В этом случае
Таблица 7 Таблица истинности для реализации системы трехступенчатого разбавления
х„ А В С Х0А (Х>А)В (((Х0А)В)С)
1 0 0 0 1 1 1
1 0 0 1 1 1 0
1 0 1 0 1 0 1
1 0 1 1 1 0 1
1 1 0 0 0 1 1
1 1 0 1 0 1 0
1 1 1 0 0 1 1
1 1 1 1 0 1 0
а)
б)
а)
В В
81 (0,1)
82 (0,1)
83 1 (0,1)
Хп
81 А,В ДМ-У /1
82 >2 У /2
83
Рис. 23 Система классификации бактериальных кластеров на две фракции с использованием мажоритарного логического голосования сигналов трех датчиков и логического «И» с жидкостными ключами А и В: 81, 82, 83 — датчики; ДМ-У — демультиплексор
необходимо использовать системы идентификации с повышенной надежностью, например мажоритарные системы (логика голосования «2 из 3»). Мажоритарный элемент имеет несколько входов, а выходная переменная элемента принимает единичное значение, если большая часть ее входных параметров равна единице. Так, переменная У на выходе трехвходового мажоритарного элемента (рис. 23) принимает единичное значение, если два или три его входа имеют единичное значение (табл. 8).
С другой стороны, микрофлюидную классификацию бактериальных кластеров можно реализовать на основе многокаскадной системы ключей (рис. 24, а), где представлена система фракционирования, содержащая пять одинарных микрофлюидных ключей
б)
Л-
Х0-
ДМ1
Х,
В, Е
Х2
Хя
ДМ3
ДМ2 - Х4
Х5
&
/1 ■/2
■/3
Б
Х6
ДМ4
/4 /5
Рис. 24 Многокаскадный элемент сепарации клеточных кластеров, содержащий три демультиплексора:
ДМ1, ДМ3 и ДМ4 — 1: 2 и один ДМ2 — 2: 4, осуществляющий выделение диагностически важных клеточных кластеров четырех видов /1, /2, /4, /5 и фракцию неинформативных клеточных кластеров /3
(см. рис. 5, б). Такая система может быть описана с помощью логических элементов демультиплексо-ров (рис. 24, б). Система работает следующим образом. На вход элемента ДМ1 подают поток исходной суспензии клеток Хд, который сепарируется на две
С
Таблица 8
Таблица истинности для системы сортировки клеточных кластеров до вида с применением голосования по трем датчикам 51, 52, Sз
Входная переменная
X,
Сигнал датчика 1 81
Сигнал датчика 2 82
Сигнал датчика 3 83
Переменная на выходе трехвходового мажоритарного элемента У
Сигнал на
актюатор Л
Сигнал на
актюатор В
Значение выходной функции /1
Значение выходной функции /2
0
I № Б(30)/2013
биотехносфера
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
1
1
0
0
1
1
0
1
0
1
1
0
0
1
1
0
0
1
0
1
0
1
1
0
1
0
1
0
0
1
1
0
0
1
1
0
1
1
1
0
0
1
1
1
0
1
1
0
14
Биоэлектроника и биосенсорика
Таблица 9 Таблица истинности для многокаскадного элемента сепарации клеточных кластеров
Х0 A B С D E ^2 Х3 Х4 Х5 Х6 f1 f2 f3 f4 f5
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0
1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1
1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0
1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0
1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0
1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0
фракции, например, грам (+) и грам (-), обозначенные в виде квадратов и кругов соответственно (рис. 24, а). Фракции Хц и Х2 поступают в элемент ДМ2, в котором интегрированы два каскада, каждый из которых отделяет с помощью датчиков этиологически не значимые клетки Х4 и Х5 (обозначены серым цветом на рис. 24, а) и патогенные клетки Х3 и Х6 (обозначенные черным и белым цветами соответственно). Фракции Х4 и Х5 поступают на элемент «И» и затем в слив /3. Фракции Х3 и Х6 проходят еще один каскад идентификации и сепарации в элементах ДМ3 и ДМ4 с выходом индивидуальных видов клеток /\, /2, /4 и /5. Таблица истинности для элемента (рис. 24, б) представлена в табл. 9.
Заключение
Рассмотрены некоторые базовые элементы, которые могут быть включены в большие микрофлюидные системы. К таким системам в настоящее время направлено внимание многих исследовательских групп. При этом наибольший интерес вызывают капельные, или дискретные, технологии, воплощаемые как в потоке непрерывных жидких носителей, так и в формате актюации капель с помощью различных физических сил.
Исследованы простейшие элементы микрофлюидной логики (например, см. рис. 9), которые являются и самыми важными, наподобие обычных транзисторов, на основе которых создаются современные высокопроизводительные большие интергральные системы. Хотя скорость операций жидкостной логики существенно ниже скорости работы транзисторной логики, она открывает дорогу системам, которые в 100 раз быстрее выполняют аналитические функции по сравнению с обычным оборудованием. И наконец, очевидно, что миниатюризация элементов ведет к снижению объема пробы и уменьшению размеров системы в целом, а также к повышению разрешения и скорости анализа [4].
Разработка сложных микрофлюидных систем с логическими элементами ведется разными группа-
ми [33], при этом все большее внимание привлекают системы гибкой электроники, которые обладают высокой технологичностью и низкой стоимостью при достаточном пространственном разрешении капиллярной системы для организации управляемого транспорта жидкости. Представляется крайне актуальным и интересным направление по разработке таких систем для анализа инфекций, устойчивости патогенов к антибиотикам, генетического анализа, анализа биомаркеров заболеваний и многих других.
Литература
1. Manz A., Graber N., Widmer H. M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sensors and Actuators B. 1990. Vol. 1. P. 244-248.
2. Зимина Т. М. Микро- и наноаналитические системы. На-нотехнология. Физика. Процессы. Диагностика. Приборы / Под ред. В. В. Лучинина и Ю. М. Таирова. М.: Физмат-лит, 2006. С. 517-551.
3. Bruus H. Theoretical microfluidics. New York: Oxford University Press, 2007. 346 p.
4. Зимина Т. М., Лучинин В. В. От сенсоров к микроаналитическим системам // Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. М.: Техносфера, 2005. 366 с.
5. Chou H. P., Spence C., Scherer A. et al. A microfabricated device for sizing and sorting DNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96, N 1. P. 11-13.
6. Unger M. A., Chou H. P., Thorsen T. et al. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography // Science. 2000. Vol. 288, N 5463. P. 113-116.
7. Thorsen T., Maerkl S. J., Quake S. R. Microfluidic large-scale integration // Science. 2002. Vol. 298, N 5593. P. 580-584.
8. Liu J., Hansen C., Quake S. R. Solving the 'world-to-chip' interface problem with a microfluidic matrix // Analytical Chemistry. 2003. Vol. 75, N 18. P. 4718-4723.
9. Яблонский С. В. Введение в дискретную математику. М.: Наука, 1986. 384 с.
10. Choi K, Kim J. Y., Ahn J. H. et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application // Lab Chip. 2012. Vol. 12. P. 1533-1539.
11. Fair R. B. Digital microfluidics: is a true lab-on-a-chip possible? // Microfluidics Nanofluidics. 2007. Vol. 3. P. 245-281.
12. Rossow T., Heyman J. A., Ehrlicher A. J. et al. Controlled synthesis of cell-laden microgels by radical-free gelation in droplet microfluidics // J. Am. Chem. Soc. 2012. Vol. 134. P. 4983-4989.
13. Fluidigm Corporation. Products. Chips and Kits: [Проспект фирмы Fluidigm Corporation. USA]. 2013. URL: http:// www.fluidigm.com/chips-kits.html.
14. Gomez-Sjoberg R., Leyrat A. A., Pirone D. M. et al. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system // Anal. Chem. 2007. Vol. 79. P. 8557-8563.
15. Зимина Т. М., Лучинин В. В. Миниатюрные аналитические платформы: ожидания, реальность, перспективы // Наноиндустрия. 2010. Т. 5. C. 80-88.
16. Melin J., Quake S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2007. Vol. 36. P. 213-231.
17. Cartas-Ayala M. A., Raafat M., Karnik R. Self-Sorting of Deformable Particles in an Asynchronous Logic Microfluidic Circuit // Small. 2013. Vol. 9, Iss. 3. P. 375-381.
18. Prakash M., Gershenfeid N. Microfluidic Bubble Logic // Science. 2007. Vol. 315. P. 832-835.
19. Boole G. An Investigation of the Laws of Thought on Which 27. are Founded the Mathematical Theories of Logic and Probabilities // Project Gutenberg. URL: http://www.gutenberg. org/files/15114/15114-pdf. 28.
20. Игошин В. И. Математическая логика и теория алгоритмов. 2-е изд., стер. М.: Изд. центр «Академия», 2008. 448 с.
21. Угрюмов Е. П. Цифровая схемотехника. СПб.: БХВ-Санкт-Петербург, 2001. 723 с. 29.
22 Kokaji A. I., Holland S., Fairhurst M. A. et al. /A simple one-step method for isolating highly purified plas-macytoid dendritic cells from human peripheral blood // 30. The Journal of Immunology. 2009. Vol. 182. P. 33-78.
23. Wiesinger-Mayr H., Vierlinger K., Pichler R. et al. Identification of human pathogens isolated from blood using micro-array hybridisation and signal pattern recognition // BMC 31. Microbiology. 2007. Vol. 7. P. 78. URL: http://www.biomed-central.com/1471-2180/7/78.
24. Зимина Т. М. Микро- и наноаналитические системы // 32. Микро- и наносистемная техника. 2007. № 8. С. 27-49.
25. Wu Z., Nguyen N.-T., Huang X. Nonlinear diffusive mixing
in microchannels: theory and experiments // J. Micromech. 33. Microeng. 2004. Vol. 14. P. 604-611.
26. Cussler E. L. Diffusion: Mass Transfer in Fluid Systems. New York: Cambridge University Press, 1984. 626 p.
Holden M. A., Kumar S., Castellana E. T. et al. Generating fixed concentration arrays in a microfluidic device // Sensors Actuators B. 2003. Vol. 92. P. 199-207. Veenstra T. T., Lammerink T. S. J., Elwenspoek M. C. et al. Characterization method for a new diffusion mixer applicable in micro flow injection analysis systems // J. Micromech. Microeng. 1999. Vol. 9. P. 199-202.
Gobby D., Angeli P., Gavriilidis A. Mixing characteristics of T-type microfluidic mixers // J. Micromech. Microeng. 2001. Vol. 11. P. 126-132.
Mingqiang Yi., Bau H. H. The kinematics of bend-induced stirring in micro-conduits // Proc. ASME Intl. Mechanical Engineering Congress and Exposition, MEMS. 2000. Vol. 2. P. 489-496.
Liu R. H., Stremler M. A., Sharp K. V. et al. Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel // J. MEMS. 2000. Vol. 9. P. 190-197.
Bessoth F. G., deMello A. J., Manz A. Microstructure, for efficient continuous flow mixing // Anal. Commun. 1999. Vol. 36. P. 213-215.
Blow N. Microfluidics: the great divide // Nature Methods. 2009. Vol. 6. P. 683-686. URL: http://www.nature.com/ nmeth/journal/v6/n9/full/nmeth0909-683.html.
г
Как оформить подписку?
• В любом отделении связи по каталогам «Роспечать» (по России) — индекс № 45886, через агентства «Урал-Пресс», «Гал», «Интер-почта 2003», «Информнаука».
• Через редакцию (с любого номера текущего года), отправив по факсу (812) 312-57-68 или электронной почте [email protected] заполненный запрос счета на подписку
Запрос счета для редакционной подписки на журнал «Биотехносфера»
Полное название организации_
Юридический адрес_
Банковские реквизиты_
Адрес доставки_
Срок подписки_Кол-во экз._
Тел._Факс_e-mail_
Ф.И.О. исполнителя_
Стоимость одного номера журнала при подписке через редакцию — 550 руб. с добавлением стоимости доставки (простой бандеролью). К каждому номеру журнала будут приложены накладная и счет-фактура. Журнал выходит 6 раз в год. Отдельные номера можно заказать с получением наложенным платежом.
Информация о журнале — www.polytechnics.ru.
Журнал «Биотехносфера» распространяется только по подписке в России и странах СНГ.
V л
биотехносфера
I № Б(30)/2013
