CC BY
806
УДК 543.07+53.087+621.389
Т. М. Зимина, Ю. А. Гвоздев, Т. В. Ширинян
Лаборатории-на-чипе: современное состояние
Ключевые слова: лаборатории-на-чипе, биосенсоры, портативные диагностические приборы, органы-на-чипе, клеточные технологии.
Keywords: laboratory-on-a-chip, biosensor, portable diagnostic devices, organs on-a-chip, cell technologies.
Приеодится аналитический обзор научных публикаций по теме «Лаборатории-на-чипе» за период 2011-2014 гг., еключающий их классификацию по типу решаемых задач и по странам, где были опубликоеаны предстаеляющие интерес материалы.
Введение
Лаборатории-на-чипе (ЛНЧ) [1] — это интенсивно развивающееся мультидисциплинарное направление, связанное с миниатюризацией и интегрированием устройств и узлов инструментальной аналитической химии, а также диагностических систем и приборов на основе принципов и технологий микро- и наноэлектроники и микросистемной техники. Являясь миниатюрными гибридными приборами, ЛНЧ содержат интегрированные структурные и функциональные элементы анализа, важнейшими из которых являются жидкостные и газовые транспортные каналы, элементы микрогидравлики (или микрофлюидики).
ЛНЧ развиваются с 1990-х гг., причем интенсивность исследований и разработок постоянно возрастает. В то же время промышленная реализация изделий до сих пор не достигла ожидаемого уровня.
Первое десятилетие развития ЛНЧ было посвящено разработке техники управления жидкой средой в системе капилляров. Появилась даже новая дисциплина — «микрофлюидика». В 2001—2010 гг. на первый план вышли задачи создания функциональных элементов ЛНЧ и их интегрирования в сложные гибридные приборы. Последняя тенденция сохраняется и в период 2011—2014 гг., рассмотренный в данной статье. На рис. 1 представлена круговая диаграмма распределения количества публикаций по ЛНЧ в разных странах. Она построена на основе материалов библиографических баз данных SciVerse Scopus [2] и РИНЦ [3], отобранных по
Германия 5 %
Корея 6 %
Англия 4 %
Япония 4 %
Тайвань 3 %
Рис. 1
Распределение количества научных публикаций по ЛНЧ за 2011—2014 гг. по странам на основе данных SciVerse Scopus [2] и РИНЦ [3]
запросам «1аЬ-оп-а-сЫр» и «лаборатории-на-чипе» за 2011-2014 гг.1
Из рис. 1 видно, что по количеству публикаций лидируют США (25,6 %). В России опубликовано 20 % статей.
В тематическом плане следует отметить, что в Англии [5], США [6] и Канаде [7] особое внимание уделяется исследованиям биосенсорных устройств для выявления раковых клеток. В Нидерландах и Германии разрабатываются оптофлюидные ЛНЧ [8, 9]. В Австралии и Новой Зеландии создают микро-цитометры [10] и биосенсоры [11]. В России основные направления работ связаны с созданием на базе ЛНЧ портативных устройств [12, 13] и биосенсоров для генетического анализа.
1 Так, в создании микрофлюидного биосенсора для обнаружения St. aureus [4] приняли участие специалисты из США (три организации), Китая (одна организация) и Канады (одна организация), поэтому авторство статьи было распределено между этими странами в отношении 3/1/1.
| №
биотехносфера
Б(3Б)/2014
42
Междисциплинарная платформа «Биотехносфера»
35 30 25 20
о?
«Г 15
н
¡3 10
Г
5
Год
/2014 2013 2012 2011
Рис. 2 Частотная гистограмма по тематике публикаций за 2011 - 2014 гг.:
1 — биосенсоры, оптика, детекторы; 2 — микрофлюидные ЛНЧ; 3 — функциональные элементы ЛНЧ; 4 — клеточные технологии ЛНЧ; 5 — технологии изготовления ЛНЧ; 6 — ЛНЧ на основе сепарационного принципа; 7 — миниатюрные биохимические и морфологические модели органов и тканей — «органы-на-чипе»; 8 — портативные приборы на основе ЛНЧ
На рис. 2 приведена частотная гистограмма распределения публикаций по категориям, выбранным авторами. Учитывая мультидисциплинарный характер обсуждаемого направления, сложно составить идеальную классификацию работ, поэтому при определения категории статьи авторы руководствовались отражением наиболее значимого результата.
Из рис. 2 видно, что количество работ по микро-флюидике и технологиям изготовления ЛНЧ снижается, а по применению ЛНЧ в анализе клеток возрастает. Возрастает и количество публикаций по интегрированию функциональных компонентов. Появились новые тенденции и даже направления, например «органы-на-чипе».
Рассмотрим наиболее интересные достижения по категориям, приведенным на рис. 2, в порядке убывания количества публикаций по данным на 2011 г. (т. е. на начало рассматриваемого периода).
а)
б)
Сенсоры, биосенсоры и детекторы, интегрируемые в ЛНЧ
Детекторы и сенсоры — важные функциональные элементы ЛНЧ. Уже многие годы сохраняется интенсивность публикаций по электрохимическому детектированию на чипе, а в последнее время исследуются возможности более высокого уровня интегрирования таких детекторов в ЛНЧ.
В работе [14] представлен электрохимический сенсор для инверсионной вольтамперометрии тяжелых металлов, выполненный на основе планарных висмутовых электродов (рис. 3). Разработанная ЛНЧ продемонстрировала стабильность висмутовых электродов при измерениях методом инверсионной вольтамперометрии (в частности — для электроотрицательных металлов, таких как марганец). Сенсор перспективен в портативных приборах для экологического и медицинского мониторинга.
Развивается направление многоканального параллельного анализа. Так, в работе [15] сообщается о многоканальном электрохимическом сенсоре, в котором реализована матрица электродов 32 х 32 на единой стеклянной подложке (рис. 4). Ряды и колонки электродов присоединены к линейке встречно-штырьевых преобразователей (ВШП) с образованием 1024 адресных сенсорных площадок в устройстве. Электрохимические сигналы накапливаются в течение 1 мин с использованием окислительно-восстановительного циклирования на каждом индивидуальном ВШП, что позволяет применять данное устройство в современном высокопроизводительном электрохимическом детектировании для протокола анализа белков (ELISA), в генетическом анализе репортеров, в генной экспрессии и в ДНК-анализе.
Другой пример электрохимической линейки сенсоров для одновременного амперометрического детектирования оксида азота (NO) и пероксини-трита (ONOO-) приведен в работе [16]. Устройство представляет собой наборы золотых ультрамикро-электродов (УМЭ) диаметром 50 мкм, электродов в)
Рп.г Я
Микрофлюидная система с электрохимическим сенсором для инверсионной вольтамперометрии [14]: а — общий вид; б — микрофлюидный чип; в — электрохимический сенсор; АЕ — вспомогательный золотой электрод; ИЕ — Ае/Аеа электрод сравнения; WE — рабочий висмутовый электрод [14]
а)
К колонкам электродов
Разделит. слой Изолир. слой
SU-8 Электрод колонок SU-8
tS
а)
К рядам электродов
б)
/ш / ш /
в)
б)
Чу
-50 пА
Рис. 4
Многоканальный электрохимический сенсор: а — стадии формирования ВШП; б — общий вид модуля в сборке; в — сенсор 32 х 32; г, д — ячейка сенсора (вид сверху и в ЗБ-проекции)
[4]
Рис. 5
«Большой» интегральный сенсор (БИС): а — вид в сборке; б — визуализация раствора глюкозы [17]
сравнения (ЭС) из Ag/AgCl и золотого вспомогательного электрода (ВЭ). Все электроды разделены на две группы, каждая из которых содержит ЭС, ВЭ и 110 УМЭ, разработанных для детектирования специфических аналитов. Сенсор проявляет селективность даже при участии в анализе мешающих биологически релевантных компонентов.
Опубликованы результаты разработки амперо-метрического сенсора высокой степени интеграции «Bio-LSI» (LSI — large scale integration), имеющего 400 площадок для измерения [17]. Этот сенсор предназначен для биовизуализации и многоканальной биосенсорики и состоит из КМОП-сенсора размером 10,4 х 10,4 мм с матрицей измерительных ячеек 20 х 20. В нем реализованы динамический диапазон измерения ±1 пА...±100 нА, пространственное разрешение 250 мкм и временное разрешение 18...125 мс/400 точек. С помощью такого сенсора удалось визуализировать биологические микрообъекты.
На рис. 5 показан сенсор для определения глюкозы с помощью окислительно-восстановительной реакции с участием глюкозооксидазы и кофактора флавинадениндинуклеотида. Платформа перспективна для интегрирования в ЛНЧ, предназначенные для медицинской диагностики, а также для экологического и медицинского мониторинга.
Импедиметрические сенсоры конструктивно близки к электрохимическим сенсорам. В последние годы они активно применяются для анализа биологических жидкостей, тканей и клеток. В работе [18] описан метод изготовления электродов для импедансного детектирования (ИД) с исполь-
зованием гетерогенной пассивации ВШП, который позволил вдвое повысить чувствительность сенсорной системы ЛНЧ по сравнению с гомогенным покрытием.
В работе [19] описан ИД-биосенсор с золотыми электродами для определения альбумина в крови. Золотые электроды хорошо интегрируются в гетерогенную аналитическую систему для диагностики состояния печени. Стеклянная поверхность между электродами силанизирована для повышения биосовместимости и присоединения антитела (в частности, к альбумину). Предел обнаружения составляет 2-10-4 г-л-1.
Субкатегорией импедиметрических сенсоров являются емкостные биосенсоры, в которых измеряются изменения емкости при воздействии переходных токов (т. е. изменения емкости измеряются опосредованно) [20] (рис. 6).
Импедиметрические сенсоры с золотыми электродами диаметрами 25, 50, 75, 100 и 250 мкм оптимизированы для детектирования клеток МСГ-7 рака груди с разрешением до одной клетки (рис. 7) [21]. В связи со специфичностью регистрации поверхность электродов покрыта антителами ап^-ЕрСАМ. Максимальная чувствительность регистрации достигается при соизмеримости электродов и клетки-мишени. Например, для клеток МСГ-7 со средним диаметром 18 ± 2 мкм оптимален электрод размером 25 мкм. Изменение импеданса при захвате клетки составило около 2,2-107 Ом. Такой сенсор может быть интегрирован в ЛНЧ для определения МСГ-7 с разрешением вплоть до одной клетки.
Междисциплинарная платформа «Биотехносфера»
б)
Электрод (Аи)
д)
2,0
К «
3 к м й И
о р
§
р о
К
1,6
1,4
1,2
1,0
-2
4 6 Время, часы
10 12
е)
Электроды,
покрытые слоем
клеток
Рис. 6
Микрофлюидная ЛНЧ с импедиметрическим емкостным сенсором для анализа миграции клеток [20]: а — содержащее два чипа устройство в сборке; б — схема электродных линеек; в — сечение чипа сенсора; г — увеличенное изображение по в; д — измерение подвижности клеток линии СаБЫ, показывающее их миграцию в реальном времени; е, ж — флуоресцентное изображение сенсора, показывающее жизнеспособность клеток [20]
0
2
8
ж)
Оптические методы (фотометрия, флюориме-трия, двумерная визуализация) остаются основными методами регистрации аналитов. Но зачастую традиционные решения не подходят для микросистем. Поэтому в последние годы, наряду с оптимизацией традиционных оптических методов, боль-
шое внимание уделяется новым методам, таким как оптофлюидные [22]. Прямым путем упрощения и миниатюризации является создание микроскопа для интегрирования в ЛНЧ [22]. Флуоресцентный оптофлюидный микроскоп (ЕОЕМ) (рис. 8) способен формировать изображения образцов малого раз-
Междисциплинарная платформа «Биотехносфера»
а)
б)
Рис. 7
а)
Импедиметрический сенсор ЛНЧ для анализа клеток [21]: а — конструкция сенсора с золотыми электродами и капиллярами для доставки клеток электродов сенсора при детектировании клеток рака груди ЫС¥-7; б — увеличенное изображение конструкции измерительной ячейки с системой электродов
линейка линз Френеля микрофлюидный канал слой светофильтра КМОПР-сенсор
б)
—У^ / / '—У^./ /
Щ: ^^ 7 74 г
Рис 8
Флуоресцентный оптофлюидный микроскоп: а — оптическая схема получения изображения; б — топология расположения линз Френеля в канале; в — микрофотография линзы Френеля; г — общий вид оптофлюидных микроскопов [22]
мера в жидких средах. В сенсоре создают массив плоских линз Френеля, которые формируют соответствующий массив сфокусированных световых пятен первичного излучения в микрофлюидных каналах. Образец мигрирует в канале и при пересечении областей сфокусированных световых пуч-
ков генерирует вторичное флуоресцентное излучение, которое попадает на покрытый светофильтром КМОП-датчик, служащий дном каналов. Собранные данные обрабатываются для визуализации изображения. Авторам работы [22] удалось реализовать разрешение около 1,0 мкм, что позволило по-
Междисциплинарная платформа «Биотехносфера»
Флуоресценция при тех же частотах модуляции, что и у возбуждающего излучения лазера
|в3
Рис. 9
Микрофлюидный чип для анализа белковых маркеров в крови [23]
Рис. 10
Принцип параллельной оптической обработки в оптофлюидной ЛНЧ [24]
лучить изображение клеточных ядер, окрашенных Акридином оранжевым, и цитоплазмы с меткой Qtracker.
Другой метод обязан своим появлением дешевым и эффективным светодиодам нового поколения, которые сделали возможным создание компактной, недорогой и практичной системы детектирования на основе флуоресценции для ЛНЧ [23]. Такая система состоит из 1пОаМ-светодиода (X ~ 501 нм) (источник излучения), органического или кремниевого фотодиода (детектор), поглощающих цветных светофильтров и линейных отражающих поляризаторов (рис. 9). Микрофлюидный чип из экструзионного полистирола используется как платформа для флуоресцентного иммуноанализа сердечных маркеров — миоглобина и КФК-МВ. Оптический предел обнаружения составил 3 нМ эквивалентной концентрации флуоресцеина. Оптический предел обнаружения для иммуноанализа человеческой плазмы оценивается в 1,5 нг-мл-1 для миоглобина и КФК-МВ.
На новом интересном принципе построен метод параллельной оптической обработки в оптофлюид-ной ЛНЧ [24]. В ходе электрофоретического разделения ультранизкий предел обнаружения достигается с помощью тонкой настройки и позволяет записывать флуоресценцию от ковалентно меченых молекул ДНК (рис. 10). Происхождение различных меченых фрагментов ДНК прослеживается в кодировке длины волны с помощью частотно-лазерного возбуждения и регистрации флуоресценции одним сверхчувствительным фотоэлектронным умножителем с последующим декодированием с помощью Фурье-анализа.
Интересна работа, авторы которой рассматривают возможность использования фотоники ближнего поля для улавливания, транспортировки и обработки нанообъектов [25]. В миниатюрных системах традиционные оптические методы малоприменимы из-за особенностей масштабирования оптиче-
ских явлений. Поэтому большое значение имеют исследования нелинейных эффектов (затухающие поля, окружающие фотонные структуры, фотонные волноводы, оптические резонаторы и плазмонные наночастицы), позволяющих значительно повысить светосилу оптической микросистемы в ЛНЧ.
В последнее время возрос интерес к оптическим пинцетам. В работе [26] описана возможность использования голографического оптического пинцета для захвата и одновременного отслеживания большого количества нанообъектов. Это стало возможным благодаря современным полупроводниковым источникам света и высокопроизводительным компактным микроконтроллерам. Метод полностью совместим с другими оптическими методами (в частности, с традиционной микроскопией) и удобен при интегрировании в ЛНЧ для актюации и зондирования.
В работе [27] сообщается о создании портативного безлинзового микроскопа с разрешающей способностью 1 мкм в поле зрения 24 мм2 без использования какого-либо механического сканирования. Этот компактный микроскоп можно установить прямо на чип (его масса около 95 г), и в нем используется метод цифровой частично когерентной осевой голографии. Система состоит из нескольких волоконно-оптических волноводов, светодиодов и управляющего микроконтроллера. Светодиоды последовательно освещают образец, а голограммы записываются с помощью массива цифровых датчиков. Их можно быстро обрабатывать по специальному алгоритму обработки отдельных пикселей для создания голо-графических образов (фаза и амплитуда) с гораздо более высоким разрешением. Этот метод перспективен для решения глобальных проблем здравоохранения (таких, как диагностика инфекционных заболеваний). Авторам удалось получить изображение возбудителей малярии.
В работе [28] описан высокочувствительный метод флуоресцентной кросс-корреляционной спектро-
Фильтр 513ВР17 I Объектив
ВЛазеры 633 нм и 488, сопряженные с одномодовым оптоволокном
Рис. 11
Флуоресцентный лазерный оптофлюидный микроскоп [28]
скопии (FCCS), который имеет очевидные преимущества применения во многих биоаналитических системах при исследовании взаимодействия и связи нескольких компонентов (рис. 11). Использование в этом методе нескольких пучков требует точной оптической настройки (в том числе деликатной и сложной процедуры позиционирования). Это первая реализация двухцветной FCCS на плоском интегрированном оптофлюидном чипе на основе волноводов с жидким ядром, которые могут пропускать жидкость и свет одновременно. В этой конфигурации возбуждающие пучки направляются в заранее определенные места и автоматически выравниваются в пределах волноводов. Метод применим для обнаружения и выделения одно- и двуцветных флуоресцентноме-ченых наночастиц и в сочетании с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET) используется для определения процесса денатурации двух-цепочечной ДНК в наномолярных концентрациях.
Микрофлюидные ЛНЧ
Микрофлюидика (наряду с технологией формирования каналов) была первым и основным направлением развития ЛНЧ. Однако в последние
годы это направление стало считаться достаточно разработанным, и внимание исследователей переключилось на проблемы гетерогенного интегрирования. Тем не менее в микрофлюидике есть не только интересные научные достижения, но и новые концепции, например концепция цифровой ми-крофлюидики. Она основана на явлении электросмачивания, изученном в 1936 г. А. Фрумкиным [29], который и ввел данный (ныне общепринятый) термин. Известно, что с 1984 г. вопросами электросмачивания и цифровой микрофлюидики занимались специалисты из США (Университет штата Мэриленд и фирма «Цито флюидикс»). В настоящее время известны коммерческие образцы цифровой микрофлюидики, в частности, цифровой вариант двухфазной системы для генетического анализа, выпущенной на рынок фирмой «Bio-Rad» (США) в виде компактного прибора для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР) — QX200 Droplet Digital PCR, ddPCR™ [30]. Говоря о дальнейшем развитии цифровой микрофлюидики для ЛНЧ, обычно цитируют оригинальные статьи [31 и 32].
В настоящее время цифровая микрофлюидика стала одним из самых интересных, завораживающе красивых и перспективных направлений создания микрофлюидных систем высокой степени интеграции. Метод основан на электрической актюации пико- и нанообъемных капель жидкости на гидрофобной поверхности, содержащей систему электродов, с помощью программируемого приложения к электродам электрических потенциалов, изменяющих угол смачивания капель, что позволяет манипулировать ими на поверхности (рис. 12) [33].
В данной работе описаны результаты разработки цифровой микрофлюидной системы для анализа последовательности ДНК в образцах объемом в несколько пиколитров с использованием принципа электросмачивания. Использовался протокол пи-росеквенирования с последующей хемилюминес-центной реакцией люциферазы светлячков. Образцы ДНК иммобилизовывали с помощью магнитов.
б)
Водяная капля
Масло
SU-8
Электрод, Cr
Покрытие фторполимером CYTOP
Кремний
Рис. 12
Реализация принципа электросмачивания (а) и топология камер и электродов цифровой микрофлюидной системы (б) [33]
Рис. 13
Топология входных портов в системе цифровой микрофлюидики для анализа сухой капли крови [34]
Недавно описана система нового типа [34] для анализа сухой капли крови методом мультиплексной экстракции и цифровой микрофлюидики на
открытой линейке электродов (рис. 13). Протокол применяется для определения фармакологических препаратов в крови. В данном случае система использовалась для микроэкстракции целевых компонентов в целях дальнейшей масс-спектрометрии.
Известна платформа и более высокой степени интеграции, в которой цифровые технологии ми-крофлюидики объединены с элементами оптоэлек-тросмачивания и оптоэлектронного пинцета [35]. Все это позволило разработчикам манипулировать не только водяными каплями (с помощью электросмачивания), но и индивидуальными частицами внутри этих капель (с помощью диэлектрофореза). Были достигнуты скорости миграции нагруженных капель до 0,008 м-с-1 (рис. 14).
В работе [36] описана новая система — «интерфейс между окружающим миром и цифровой микрофлюидной системой». Она осуществляет экс-
а)
Пятно засветки
Пятно засветки
I .............т
Концентрирование частиц Деление капель
Повтор
Пятно засветки
Пятно засветки
© © О
Селекция частиц в)
Капсулирование
б)
Электрическое поле
Оксид индия-I олова/стекло
^^ Тефлон
Силиконовое масло /
Тефлон А12О3
Пятно засветки
Рис. 14
Унифицированная платформа для цифровой микрофлюидики с использованием принципа оптоэлектросмачивания: а — топология платформы; б — механизм актюации; в — слияние капель; г — расщепление капли [35]
тракцию из цельной крови и очистку РНК. Главным успехом исследователей является создание техники манипулирования неочищенным образцом и его подготовка к генетическому анализу.
Оригинальная концепция применения принципов цифровой микрофлюидики в микробиологии приведена в работе [37], где сообщается о создании 3Б-многоклеточного сфероида, обладающего аналитическими преимуществами по сравнению с планарной культурой клеток. В капли с альги-натной массой заключали не только клетки, но и магнитные наночастицы. Полученные частицы размером 170-190 мкм формировали в масляной фазе с помощью структуры, показанной на рис. 15.
В работе [38] описано использование заряженных частиц для тонкого манипулирования малыми объемами жидкости в цифровой микрофлюидике. Исходные частицы сначала поляризуют, а затем каждую частицу делят на две дочерние частицы с противоположными зарядами в Т-микроканале. Система имеет хорошие перспективы использования в ЛНЧ.
Реализация цифровой микрофлюидики требует надежного метода создания эмульсий. В работе [39] описан метод высокопроизводительной генерации капель в двухфазной системе, позволяющий параллельно функционировать нескольким каналам. Проблему создания чередующихся гидрофобных и
г)
J) Q 6)
Рис. 15
Реализация принципов цифровой микрофлюидики в микробиологии при создании микрокультуры в виде сфероида: а — схема сепарации капель; б — схема узла формирования капель; в — увеличенное изображение узла для выделения капель с магнитными частицами; г — фотография капиллярной системы для формирования капель; д — фотография капель при сепарации в магнитном поле [37]
а)
б)
в)
Рис. 16
Микрофлюидная платформа для высокопроизводительной генерации капель в двухфазной системе, способной к параллельному функционированию по нескольким каналам: а — планарное сопло для генерирования водяных капель в масле; б — увеличенное изображение крестообразного соединения по а; в — загрузка магнитных наночастиц в капли; г — сепарация капель; д — суспензия «вода в масле»; е — увеличенное изображение узла сепарации капель [39]
гидрофильных поверхностей малого размера (около 1 мкм) разработчики преодолели благодаря использованию непланарного микрофлюидного устройства с градиентом толщины (рис. 16). Это позволило более надежно генерировать капли, а также определить оптимальные динамические и геометрические параметры их формирования.
Говоря о современном состоянии микрофлюидных элементов ЛНЧ, нельзя не упомянуть такие направления, как «Акустофлюдика» [40] и «Маг-нитофлюидика», однако их детальное рассмотрение выходит за рамки данного обзора.
Функциональные элементы ЛНЧ, связанные с манипулированием потоком и пробой
К функциональным элементам ЛНЧ относятся входные порты, модули пробоподготовки, реакторы, актюаторы потока и перемещения (клапаны, мембраны и пр.). Наиболее интенсивные разработки актюаторных элементов микрофлюидных ЛНЧ велись в 1990-е и 2000-е гг. Этот период характе-
ризовался многообразием конструктивных решений клапанов и насосов. К настоящему времени количество публикаций в этой области снизилось, а новизна работ заключается в использовании новых материалов. Так, в работе [41] описана конструкция пневматического микроклапана на основе мембран из материала Viton®, который химически «пришивается» к профилированным подложкам из полиметилметакрилата (ПММА) или цикло-олефинового сополимера (ЦОС). Клапан обеспечивает давление 400 кПа (ПММА/Viton®) и 310 кПа (ЦОС/Viton®). Он может применяться в ЛНЧ для исследования агрессивных и опасных жидкостей и, таким образом, расширяет возможности их использования. Клапан подобной конструкции [42] изготовлен из эластомера и интегрирован в аналитическую платформу на CD для управления жидкостью на диске (рис. 17).
Авторы работы [43] сконструировали «магнито-капиллярный» клапан для стационарной микро-флюидики. Известен клапан кантилеверного типа [44], изготовленный методом фотолитографии из фоторезиста SU-8 и работающий при давлении жидкости до 300 кПа.
а) Внешняя камера
о
О д
Внутренняя
камера
б)
Закрыто (ю < юс)
Открыто (ю > Юс)
>
Ч О
)| и •
^ о
Верхний слой
Верхний слой
О
/
\
Нижний слой
Мембрана из эластомера
Рис. 17
Рис. 18
Аналитическая платформа на СБ с интегрированными клапанами из эластомера для управления жидкостью: а — фрагмент платформы на диске; б — схема работы клапана [42]
Для создания ЛНЧ важны структуры пробо-подготовки и загрузки образца. Например, в работе [48] описан пироэлектрический адаптивный нанодиспенсер (наноробот) для адресной доставки жидкости (РУИАКА). Система манипулирует полимерными сферами для инкапсулирования лекарств и способна разгружать их в заданных точках платформы. Этот электрогидродинамический подход позволяет бесконтактно манипулировать диэлектрическими объектами. На рис. 18 показан момент захвата капли.
Основой нового самодвижущегося наноустрой-ства для осуществления перемещений, доставки грузов и распознавания мишеней (рис. 19) [49] является мезопористый материал, асимметрично функционализированный присоединением одноце-почечной ДНК, причем на противоположной стороне иммобилизирована каталаза. Ферментативное окисление перекиси водорода каталазой дает движущую силу всей системе.
В работе [50] описаны картриджи управляемой подачи реагентов для портативных аналитических устройств (интеграторы реагентов). Такой интегратор использует устройство типа струйного принтера и два канала с растворителями (рис. 20). Кон-
Пироэлектрический адаптивный нанодиспенсер (наноробот) для адресной доставки жидкости (РУИВАМА). Показан момент захвата капли [48]
Описано несколько интегрируемых микронасосов: насос на основе пористого полидиметилсилок-сана [45], жидкокристаллический микронасос [46], микронасос с жидкими электромагнитными клапанами [47]. По этим публикациям видно стремление к поиску новых «насосных принципов» нового уровня интегрируемости и новых материалов.
а)
б)
г = 0 с
г = 8 с
г = 17 с
г = 22 с
г = 29 с
Рис. 19
Самодвижущееся наноустройство для перемещений, доставки грузов и распознавания мишеней в микросистеме: а — принцип работы; б — движение в 5%-ном растворе перекиси водорода; в — сборка нескольких карго-частиц [49]
Сухой
г = 0
Заполненный и загружающий дозу реагентов í > 0
Промытый
г = г„
э-
Рис. 20
Интегратор реагентов струйного типа в трех состояниях: сухой, заполненный и загружающий дозу реагентов и промытый [50]
троль концентрации осуществляют по принципам гидравлических резистивных модулей, задающих скорость потока.
Другой вариант модуля пробоподготовки описан в работе [51], где, как и в работе [50], исследователи используют сухие реагенты — монокло-
Микрофлюидный
Вращающиеся магниты
Рис. 21
Система целевого захвата, эффективного смешивания с реагентами и управляемого адресного высвобождения мишени в микрофлюидном канале при помощи линейки вращающихся магнитов [52]
нальные антитела, конъюгированные с флюоро-хромом.
Явление магнетизма по-прежнему остается в сфере интересов специалистов, работающих в данной области, причем потенциал нереализованных инженерных решений и фундаментальных принципов создания новых функциональных элементов ЛНЧ очень велик. В работе [52] описана система манипулирования анализируемой мишенью, включая ее целевой захват, эффективное смешивание с реагентами и управляемое адресное высвобождение в микрофлюидном канале при помощи линейки вращающихся магнитов (рис. 21).
Таким образом, видна тенденция миниатюризации функциональных элементов ЛНЧ: переход на наноуровень, использование молекулярных мишеней, якорей, движителей и т. д.
ЛНЧ для анализа клеток
В последнее время интерес к миниатюрным системам для анализа клеток заметно вырос (см. рис. 2). Ведутся разработки функциональных элементов таких систем: ростовых камер; микрофлюидных систем сортировки; сенсоров температуры, концентрации кислорода и двуокиси углерода; устройств пробоподготовки, визуализации и т. п. Проводятся как экспериментальные исследования, так и численное моделирование.
При культивировании многих видов живых клеток важно обеспечить уровень кислорода для их дыхания. В работе [53] описаны численная модель регистрации уровня кислорода в ЛНЧ для культивирования клеток и результаты экспериментального исследования в системах, изготовленных из ПДМСО, ЦОС и полиметилпентена (ПМП), при диффузии кислорода через полимерное устройство или доставке его с питательной средой. На примере клеток двух видов — гепатоцитов и эндотелиоци-тов — показано, что наиболее проницаемым для кислорода является ПДМСО (рис. 22).
Разрабатываются ЛНЧ для исследования свойств клеток, например, хемотаксиса нейтрофилов [54] — основных иммунных клеток в системе кровообращения. Такие клетки защищают организм от инфекций, перемещаясь в ткани, согласно иерархии хемотаксических сигналов, направляющих их к ране. Для исследования механизма хемотаксиче-ской сигнализации нейтрофилов создана платформа, обеспечивающая 48 комбинаций градиентов хемоаттрактантов и позволяющая наблюдать ответ нейтрофила при одновременном воздействии хемо-аттрактантов противоположного действия (рис. 23). Наблюдалось [54] преобладание ответа на воздействие £МЪР относительно ЪТВ4, а также ускорение ответа в присутствии определенных комбинаций хемоаттрактантов. Полученные данные углубляют понимание сложного механизма хемотаксиса. Раз-
Междисциплинарная платформа «Биотехносфера»
а)
й ч о а о ч о К К И
к а й а н к ф
а к о К
20
18
16 I
14
12
10
8
6
4
2
0
20
40
60
80
100 120
Время, мин
б)
V,
5? 20
<|18
а 16 § 14
§ 12 ия 10
а
й
р
а
н
о К
^ ° □ п '
2 '^□□□□□□□□□□□□□□а
20
40 60 80
Время, мин
100 120
Рис. 22
Уровень кислорода в ЛНЧ для культивирования клеток: а — эндотелиалъные клетки; б — гепатоциты.
Сравнение полученных результатов с данными численного моделирования показало хорошее совпадение. ЛНЧ изготовлены из ряда материалов: 1, 6 — ПДМСО (полидиметилсилоксан); 2, 5 — ПМП (полиметилпентен); 3, 4 — ЦОС (сополимер циклического олефина) [53]
а)
б)
Рис. 23
ЛНЧ для исследования механизма хемотаксической сигнализации нейтрофилов: а — элементарная сенсорная ячейка для регистрации хемотаксиса нейтрофилов; б — индивидуальные нейтрофилы в системе хемоаттрактантов, регистрируемые флуоресцентным микроскопом [54]
работанное устройство можно классифицировать и как мультисенсор, и как микроприбор нового класса для исследования механизмов функционирования клеток и органов («органы-на-чипе»). Устройство изготовлено из ПДМСО с использованием форм из Яи-8. Наблюдение проводили с помощью микроскопа с подвижной прецизионной системой позиционирования и камерой.
Развивается область анализа нанотоксичности с помощью ЛНЧ для единичных клеток [55]. Описана ЛНЧ, содержащая микроемкости и систему диэлектрофоретической иммобилизации клеток. Состояние клеток определялось измерением импеданса. Чип изготавливали на основе кварца.
Другой пример современной одноразовой ЛНЧ для анализа клеток рака [56] содержит описание картриджей, выполненных методом литья под давлением из оптически прозрачного поли-метилметакрилата. Система с микрофлюидным 2Б-фокусированием потока обеспечивает регистрацию до шести параметров, включая оптическую регистрацию при 473 нм (10 мВт) и 640 нм (20 мВт)
с использованием системы х-у-позиционирования. В статье показана конкурентоспособность метода микропроточной цитометрии (цЕСМ) в сравнении с обычным (ЕСМ).
Развиваются методы транспорта и выделения клеток с помощью магнитных наночастиц. Так, впервые интегрированы на одном чипе возможности линейки магнитных ловушек и цифровой ми-крофлюидики (рис. 24) [57]. Хорошо определенные локусы иммобилизации и сброса объектов с помощью линейки ловушек и ее способность активно манипулировать клетками даже против потока свидетельствуют об уникальных особенностях данного устройства для сепарации магнитно меченых клеток и их дальнейшего капсулирования в капли с реагентами.
Жизнеспособность инкапсулированных клеток, выявленная с помощью флуориметрического детектирования, демонстрирует потенциал дальнейшего интегрирования устройства со схемами анализа в потоке. Авторы работы [58] считают данную схему ключевым подходом к одноклеточному анализу буду-
а)
е)
PI флуоресценция I
Ф ^ »100 мкм
Рис. 24
ЛНЧ для выделения клеток с линейкой магнитных ловушек и элементами цифровой микрофлюидики. Магнитная сепарация, инкапсулирование, выделение капель и анализ: a — t = 0 с, клетка BT-474 и две красные кровяные клетки входят в верхнюю левую ветвь чипа со скоростью Qi; б — t = 53,3 с, направление движения трех клеток отмечено линиями; в—д — при t = 57,2; 57,4 и 57,6 с последовательность процесса инкапсулирования меченой клетки BT-474 при смешивании с реагентом из потока Q3; е — вывод капель в канал сброса, меченые клетки показаны рамками; ж — капли по рис. е, размещенные между покровным стеклом и стеклянной подложкой для детектирования флуоресцентного сигнала [57]
щего, учитывая низкую стоимость, возможности использования магнитных сил и их биосовместимость.
Новым направлением является интегрирование ЛНЧ с ростовыми камерами для культивирования клеток [59]. В работе [60] описана ЛНЧ (Envirostat), создающая управляемые условия микроокружения для исследования физиологии клетки в естественных условиях (рис. 25). Принцип действия устройства основан на смачивании клетки, бесконтактной изоляции и фиксации методом отрицательного ди-электрофореза (negative dielectrophoresis — nDEP). В отличие от аналогов, в которых иммобилизация
клеток осуществляется механическим воздействием, разработанное устройство благодаря бесконтактной манипуляции исключает взаимодействие клетки с другими объектами и изменение ее фенотипа. Более того, обеспечивается мгновенное удаление потенциально ингибирующих метаболитов, при этом поступление питательных компонентов и кислорода ничем не ограничено. Транспорт метаболитов позволяет также анализировать процессы жизнедеятельности клетки.
Рост количества публикаций указывает на то, что развитие клеточных технологий находится на
Рис. 25
ЛНЧ для исследования клеток «ЕтЬговгаг»: а — вид сверху чипа в сборке с электрическими контактами и отверстиями для поступления жидкости; б — увеличенное изображение микроканалов и микроэлектродов; в — бесконтактная фиксация клетки с помощью пБЕР в контролируемой среде [59]
подъеме и будет интенсивно развиваться в ближайшие годы. Это связано с нуждами медицины в областях клонирования, создания штаммов и исследования клеток как для восстановления поврежденных органов, так и для диагностики бактериальных заболеваний.
Технологии изготовления ЛНЧ
Направление исследований в области технологий изготовления аналитических микросистем и ЛНЧ в последнее время существенно изменилось.
Много публикаций посвящено ЭБ-печати. Так, в работе [61] описан микрочип в гидрогеле, созданный с помощью проекционной ЭБ-печати. Чип представлял собой разветвленную сотовую структуру, которая должна была имитировать морфологию кровеносного сосуда при исследовании различия в поведении раковых клеток линии НеЪа и нераковых клеток линии 10Т1/2. Структура содержит каналы с различной шириной (25, 45 и 120 мкм), которые соответствуют разнообразным диаметрам сосудов. Использование таких структур позволило выявить различия в развитии и подвижности клеток НеЪа и 10Т1/2, связанные с размером модели капилляра.
Описана технология прототипирования ЛНЧ из ПДМСО на стеклянной подложке с использованием ЭБ-печати [62] (рис. 26). Полученные формы обеспечивали разрешение 50—10 мкм и имели толщи-
ны от 50 мкм до нескольких миллиметров. Все это позволило упростить интегрирование капиллярных трубок и создать многоуровневую микрофлюидику. Время изготовления прототипов составило 20 мин, а их стоимость — 0,48 долл. США.
Другое направление в области быстрого про-тотипирования демонстрируют чипы-на-фольге (рис. 27) для экспресс-диагностики патогенов на месте. Авторы статьи [6Э] разработали серебряные электроды, получаемые методом струйной печати на полимерной фольге в качестве одноразовой платформы для молекулярного анализа ДНК. Для изготовления чипов чернила с серебряными нано-частицами наносили на полипропиленовую пленку. Из-за низкой термостабильности фольги использовали «щадящие» технологии спекания, такие как низкотемпературное спекание, плазменное спекание в аргоне низкого давления. При температурах 100 °С и ниже получали достаточную электропроводность напечатанных структур. Работоспособность чипов проверяли при анализе ДНК.
ЛНЧ на основе сепарационного принципа
Капиллярный электрофорез на чипе по-прежнему остается в зоне внимания исследователей, но его реализация стала более разнообразной, а функции расширились.
Решена задача отбора проб при их сепарации методом изоэлектрофокусирования [64]. Пробы
Рис. 26
ЛНЧ различной топологии, изготовленные из ПДМСО с помощью форм, полученных SD-печатью: а — форма для, диффузионного и хаотропного миксеров (столбики являются направляющими для дальнейшего интегрирования силиконовых трубок); б — микрофлюидные каналы глубиной 100 и 500 мкм; в — микрофлюидное устройство в сборке; г — фрагменты каналов [62]
Рис. 27
Чип-на-фольге: а — фотография напечатанного чипа для ДНК-анализа; б — увеличенное изображение чипов, напечатанных на «Иапта ЫРБ^» на полипропиленовой фольге [63]
а)
Анолит
б)
в)
Ш Яь.
Анод Низкое рН
Катод Анод
Высокое рН Низкое рН
Катод
Высокое рН Низкое рН
Высокое рН %
Рис. 28
Схема ИЭФ сепарации на чипе: а — загрузка образца; б — ИЭФ; в — сбор сепарированных образцов; г — общий вид устройства [64]
Рис. 29
Процесс формирования матрицы электродов: а — депозиция металла; б — депозиция оксида кремния, химическая и механическая полировка и травление каналов; в — депозиция вольфрама в канавки; г — общий вид матрицы; д — фрагмент матрицы; е — БЕЫ-фотография вольфрамового электрода [66]
Рис. 30
ЛНЧ для ситовой сепарации частиц: а — схема (сечение и вид сверху) микрофлюидного чипа с интегрированным массивом нанощелей (ЫаповШ-СЫр); б — ЯЕЫ-фотографии области массива нанощелей при различном увеличении [6]
.........
ш \т1 ®..........
рЛ Доля серого Эритроциты Э : „ <•■ м Плазма Щ П __
Хемилюминисценция (ЕЪШЛ) Г ■ 1 V Гематокрит (Э) Щ Длина
Рис. 31 \ Схема сепарации в потоке и анализа крови в едином канале ЛНЧ [68]
| №
биотехносфера
Б(3Б)/2014
формируются в виде капелек благодаря специальной зигзагообразной топологии сепарационного канала и последовательности расположения емкостей по обе стороны канала, в которые капельки скатываются после разделения (рис. 28). Полученные фракции можно анализировать на чипе или переносить во внешние устройства.
Другой пример — это ЛНЧ для генетического анализа патогенных клеток за 30 мин с интегрированными пассивным микромиксером, магнитной сепарацией и капиллярным электрофорезом [65].
Многочисленные публикации посвящены методу диэлектрофореза, который используется как для иммобилизации объектов при их детектировании и визуализации, так и для их сепарации на компоненты.
Например, в работе [66] описана матрица (более 100 тысяч цилиндрических электродов, сформированных в кремниевой подложке), которая разработана для диэлектрофоретического манипулирования наночастицами и молекулами в жидкой среде (рис. 29). Она сформирована по стандартной КМОП-технологии. Авторы статьи продемонстрировали диэлектрофоретическую иммобилизацию биомолекул из раствора.
В другом методе сепарации используется принцип сита [67]. Метод основан на применении интегрированной в микрофлюидный чип системы нанощелей, которые удерживают и концентрируют микро- и наночастицы заданного размера (рис. 30).
Известен и метод сепарации на основе гидродинамических сил в капилляре [68]. Система разработана для анализа образцов цельной крови малого объема, включая выделение сыворотки крови, оценку гематокрита и количественное определение белков. Гематокрит оценивали анализом цифровых образов клеток в канале. Белки определяли хе-милюминесцентным иммуноанализом на площадках с высоким отношением площади поверхности к объему (рис. 31).
Органы-на-чипе
Органы-на-чипе (ОНЧ) — это новое направление развития ЛНЧ, связанное с необходимостью разработки биохимических и морфологических моделей органов и тканей человека и животных для изучения биохимии заболеваний, токсичности лекарств и других внешних факторов, свойств клеток и клеточных структур органов и т. п. Это направление бурно развивается в последние годы благодаря достижениям в области технологий ЛНЧ.
В работе [69] описана модель гематоэнцефаличе-ского барьера (ГЭБ), сохраняющего гомеостаз мозга и предотвращающего поступление токсических веществ в мозг. Однако при ряде нейродегенератив-ных заболеваний функция ГЭБ нарушается, а механизмы этого нарушения не всегда ясны. Модель
сформирована на чипе с помощью клеток эндотелия человеческого мозга. В ОНЧ интегрированы электроды для измерения трансэндотелиального электрического сопротивления.
В работе [70] представлена модель «сердца-на-чипе», для изготовления которой применены полуавтоматические технологии формирования субмиллиметровых тонкопленочных кантилеверов из мягких эластомеров. Анизотропные микроткани сердца, повторяющие слоистую структуру желудочка сердца, изготовлены именно из таких кан-тилеверов. Их отклонение при сокращении позволяет оценить диастолическое и систолическое давление, создаваемое искусственными тканями. Создана конструкция многоразового одноканально-го микрофлюидного микроустройства, позволяющего контролировать параметры модели (например, температуру), наблюдать отклонение кантилеве-ров за счет оптического доступа и работу электродов для стимулирования ткани (рис. 32). Модель позволяет тестировать ткани, сформированные из редких источников живых клеток, и интегрируется с другими моделями органов.
В статье [71] описано реконструирование фрагмента печени-на-чипе. Модель сантиметрового размера создана из гетерогенных гепатоцитов и эндотелиальных клеток с помощью диэлектрофо-ретической иммобилизации. Для формирования структуры, имитирующей долю печени, созданы пространственные электроды специальной формы (рис. 33).
Портативные приборы на основе ЛНЧ
Направление, относящееся к разработке устройств для комплексной диагностики образцов «на месте» (point-of-care testing — POCT), развивается волнообразно. В 2011—2013 гг. количество публикаций уменьшалось, но в 2014 г. произошел всплеск активности. Создание многофункциональных приборов, объединяющих различные элементы технологий ЛНЧ, требует вложения значительных материальных средств и коллективных интеллектуальных усилий не только для разработки сложных функциональных элементов ЛНЧ, но и для решения проблем их гетерогенного интегрирования. Этим занимаются лаборатории многих ведущих вузов мира (Harvard Medical School, UCLA, University of Tokyo, Institute for Bioengeneering of Catalonia), а также научные центры различных компаний («Samsung» [72], «Autodesk» [73], STM).
В компании «Samsung» разработан прибор для полного иммунологического и биохимического анализа крови (рис. 34). Принцип его действия основан на использовании CD диаметром 12 см, помещаемого в ридер с параметрами 25 х 35 х 25 см. Процессы пробоподготовки (отделение плазмы, инкубация, смешивание), измерений, промывки и
Puc. 32
Moдeль «cepдцà-нà-чune»: а — cxemü. npoцeccа фopмupoвàнuя MTП-чunа; б — гomoвыe MTП-чunы; в — мoдyлu ^^mpy^uu; г — ycmpoйcmвo cepö^-^^une в cбopкe; ПИПААм — noлu(N-uзonponuлàкpuлàмuд); MTП — мышeчныe moнкue nлeнкu [70]
Puc. 33
Гemepoгeннoe uнmeгpupoвàнue на 4une клemoк neчeнu HepG2 u эндomeлuàлъныx клemoк HUVEC: а — monoлoгuя элeкmpoдoв cneцuàлънoй фopмы; б — элeкmpoды u cycneнз^ œuebix клemoк; в—г — pocm клemoчныx cmpywmyp на pàзныx cmàдuяx [71]
t
Модуль детектирования
Модуль иммунологического анализа
Диаметр 12 см
Рис. 34
Система иммунологического анализа крови на CD «Samsung Blood Analyzer» (изображение диска и топология модулей иммунного анализа [72])
регистрации полностью автоматизированы, а для анализа необходимо только 350 мкл крови.
Иммунологический анализ проводится с помощью многоволновой (10 длин волн) спектрофото-метрии. В совокупности с упрощенным вариантом общего биохимического анализа крови, который сейчас проводится лишь в специализированных лабораториях, данный прибор является мощной мобильной диагностической системой.
Активно развиваются направления миниатюризации колориметров и цитометров. Создан карманный колориметр с возможностью интегрирования анализатора мочи (в коммерческой версии) [74]. С его помощью возможны анализ до 10 параметров (содержание глюкозы, белка, билирубина и
пр.) и передача данных на смартфон. Инновационным представляется преобразование результатов в карту цветов и использование аппроксимации для количественного анализа данных. На рис. 35 представлен процесс получения цифровых сигналов: светодиоды последовательно и с заданным интервалом генерируют красный, зеленый и синий сигналы, а 12 кремниевых фотодиодов считывают их.
Разработчики рассматривают возможность применения прибора в развивающихся регионах, где не хватает квалифицированных специалистов (с этим устройством может работать даже неквалифицированный персонал, так как предусмотрена передача данных эксперту через смартфон).
Источники (3 хроматических светодиода)
Сенсоры (12 фотодиодов)
R G В
О
пП-П
G 8 N Р С
12 ФД
Q
д.
б 8 N р С
12 ФД
О
ПпЕ
G В N Р С
12 ФД
R
Вычисления и отображение
t
t
t
t
1
2
3
4
Рис. 35 I Принцип и алгоритм анализа на CD «Samsung Blood Analyzer» [74]
Держатели механизма
Ланцет Колпачок
А,
Прокалывающий механизм
Защитная пластина
Диагностический картридж
Рис. 36 \ Схематическое изображение «ЬаЬ-1п-а-реп» [75]
Одна из новейших разработок — устройство «1аЬ-т-а-реп» (лаборатория-в-ручке) (рис. 36) для обнаружения двух различных антигенов гепатита В [75]. Прибор состоит в основном из бумаги и пластика и потому дешев при массовом производстве.
Обыкновенный ланцет интегрирован в корпус и используется для забора крови из пальца. Держатели по бокам ланцета контролируют его перемещение. Механизм прокалывания кожи активируется нажатием кнопки с обратной стороны ручки. Защитная пластина отделяет прокалывающий механизм от картриджа с образцом, что уменьшает вероятность повреждения мембраны, на которой исследуется образец, в процессе забора крови. Кроме того, это обеспечивает быструю замену картриджа или механизма (при необходимости).
По сравнению с аналогами, изобретенное устройство имеет преимущества: возможность одновременного тестирования нескольких образцов и закрытость процесса анализа, что снижает вероятность ошибки. Время анализа составляет 10 минут. В случае применения известных методов анализа необходимы 150 мкл венозной крови, центрифуга для отделения плазмы и система транспортировки до тестовой полоски. На рис. 37 показан тест центрифугированной свиной плазмы на коммерческом устройстве для экспресс-анализа (верхнее изобра-
Метод «1аЬ-т-а-реп»
1111
М1- Г Г 11 ГК 1 К 1
и J Ь Л
НВвАЬ НВеАд НВэАд
Рис. 37 \ Сравнение метода «ЬаЬ-т-а-реп» с другими методами анализа антигенов [75]
в)
Нуклеотиды
Промывка
4
Магнит 1
Слив
Магнит 2
Смешивание ферментов
Рис. 38
Портативный прибор для секвенирования ДНК: а — собранный картридж; б — вид прибора; в — схема картриджа, показывающая положение ячеек для образца и реагента и другие особенности [76]
жение) и тест цельной свиной крови с помощью «lab-in-a-pen» (нижнее изображение). Тестовые области обозначены штриховой линией и буквой «Т», а контрольные области — серой штриховой линией и буквой «С». Оба устройства успешно выявляют антигены, что видно по результатам реакции в контрольной области.
В работе [76] описана ЛНЧ-система для генетического анализа, содержащая картридж и ми-ни-ридер. Анализ проводится методом цифровой микрофлюидики на основе электросмачивания. На картридже создана система электродов для манипулирования каплями (рис. 38).
Интересны разработки приборов, позволяющих перенести всю работу по очистке образца внутрь системы, сохранив при этом на достаточно высоком уровне достоверность сложных биохимических тестов и не потеряв автономность устройства. Именно таким устройством разработчики видят платформу SIMBAS (Self-powered Integrated Microfluidic Blood Analysis System) — автономную микрофлюидную систему анализа крови [77]. Для проведения ана-
лиза необходимо поместить 5 мкл цельной крови в соответствующую ячейку. Микрофлюидный чип сам отделит лейкоциты и эритроциты, проведет необходимые анализы (в зависимости от установленных сенсоров) и удалит отходы (рис. 39). В текущей версии прибор выделяет плазму и обнаруживает в ней биотин (витамин В7). Он делает все это менее чем за десять минут с точностью около 99 % на пяти образцах одновременно.
Отделение плазмы
Втягивающие элементы
Рис. 39
Модель и внешний вид разработанной платформы [77]
в)
2000
1500
Ен
"Ö
-Ö I
1000
500
75
80 85
Температура, °C
90
Рис. 40
Тест на чувствительность к ЗППП в мазке с Herpes simplex virus (HSV): а — капиллярный уровень; б — снимок с ПЗС-матрицы 35-го цикла ПЦР; в — HSV2 профиль для разбавленного образца [78]
Принцип работы устройства основан на физике низкоразмерных систем и позволяет ускорить многие процессы, занимающие в макромире дни и недели. Под каждым капилляром находится канавка, в которую седиментируются тяжелые эритроциты и лейкоциты, а кровь движется вперед по капилляру под действием «вакуумного потока». Вся система капилляров предварительно герметизируется в вакууме. При загрузке пробы происходит разгерметизация и созданная разность давлений прокачивает кровь в микрофлюидные каналы. Чувствительность прибора, по экспериментальным данным, составляет 10-9. «Это соизмеримо с обнаружением песчинки в песочнице массой 6,5 тонн», — считает Иван Димов, сотрудник Калифорнийского университета. Чип планируется доработать до скоростного детектора различных патогенов, в первую очередь — раковых клеток.
Другой прибор для ПЦР создан в Университете Альберты [78]. Его основой является капиллярная гелевая кассета, в которой происходит реакция. Образец попадает в нее под действием капиллярных сил. Амплификация ДНК вынесена в отдельный сегмент устройства. Продукты обнаруживаются по анализу характеристики плавления (melt curve analysis, MCA, рис. 40). Результаты тестов могут быть получены в течение 50 мин. Система высокопроизводительна и работает с сырыми образцами.
Такие кассеты могут использоваться в микробиологическом анализе при идентификации патогенов.
Как показывает анализ публикаций по портативным диагностическим системам на основе ЛНЧ, исследования в данной области продолжают развиваться, но темп их роста пока не высок. Это можно объяснить сложностью решаемых задач и отсутствием необходимых технологий.
Заключение
Анализ публикаций по теме ЛНЧ за 2011 — 2014 гг. выявил целый ряд новых тематических направлений, которые активно развиваются. Это, прежде всего, «цифровая» микрофлюидика на основе эффекта электросмачивания, которая уверенно вытесняет «сплошную» микрофлюидику. Заметен рост публикаций по применению в ЛНЧ оптофлю-идики, акустофлюидики, пульс-диэлектрофореза и пр. Все эти явления используются, прежде всего, для бесконтактного манипулирования нанообъек-тами в ЛНЧ. По-прежнему значительна доля публикаций по электрофорезу и диэлектрофорезу. [Электрофорез применяется для сепарации белков и фрагментов ДНК, а диэлектрофорез — для иммобилизации частиц и молекул (в частности, антител.)] Быстро растет количество публикаций
в области клеточных технологий. В них описаны всевозможные технические решения по миниатюризации устройств для микробиологического анализа, сортировки клеток, культивирования клеток и т. п. В то же время количество публикаций по портативным диагностическим приборам (особенно для телемедицины) невелико. Это можно объяснить сложностью технических задач или соображениями коммерческой тайны.
Появление новой ветви ЛНЧ — органы-на-чипе — связано с модернизацией медицинских исследований и развитием биофизических подходов к лечению патологий, а следовательно, с необходимостью исследования характеристик органов и тканей. Одной из технологических предпосылок ОНЧ является широкое внедрение ЭБ-печати.
Появились отдельные публикации, описывающие действия нанороботов для доставки веществ и манипулирования жидкостью в ЛНЧ. Эта тенденция, безусловно, сохранится, так как потенциал ее огромен.
Интересны работы по повышению степени интеграции ЛНЧ и созданию «больших ЛНЧ», т. е. интегральных систем пробоподготовки и сенсорики. Стремление к повышению степени интеграции ЛНЧ в последние годы было впервые воплощено в реальных устройствах.
В целом тематика ЛНЧ имеет следующие тенденции развития:
• поиск новых физических явлений, открывающих возможности манипулирования веществом в микро- и наномасштабе;
• гетерогенное интегрирование живой ткани и МЕМС-систем, особенно в связи с применением ЭБ-печати как платформ, так и фрагментов органов;
• повышение степени интеграции систем.
Литература
1. Manz A., Graber N., Widmer H. M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sensors and Actuators B1. 1990. Vol. 1. P. 244248.
2. SciVerse Scopus. URL: www.scopus.com
3. Российский индекс научного цитирования. URL: eli-brary. ru/project_risc.asp
4. Lu X., Samuelson D. R., Xu Y. [et al.] Detecting and tracking nosocomial methicillin-resistant Staphylococcus aureus using a microfluidic SERS biosensor // Anal. Chem. 2013. Vol. 85. P. 2320-2327.
5. Mulhall H. J., Labeed F. H., Kazmi B. [et al.] Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis // Anal. and Bioanal. Chem. 2011. Vol. 401. P. 2455-2463.
6. Hoshino K., Huang Y.-Y., Lane N. [et al.] Microchip-based immunomagnetic detection of circulating tumor cells // Lab on a Chip. 2011. Vol. 11. P. 3449-3457.
7. Alazzam A., Stiharu I., Bhat R. [et al.] Interdigitated comblike electrodes for continuous separation of malignant cells from blood using dielec-trophoresis // Electrophoresis. 2011. Vol. 32. P. 1327-1336.
8. Dongre C., Van Weerd J., Besselink G.A.J. [et al.] Modulation-frequency encoded multi-color fluorescent DNA analysis in an optofluidic chip // Lab on a Chip. 2011. Vol. 11. P. 679-683.
9. Seiffert S., Dubbert J., Richtering W. [et al.] Reduced UV light scattering in PDMS microfluidic devices // Lab on a Chip. 2011. Vol. 11. P. 966-968.
10. Skommer J., Akagi J., Takeda K. [et al.] Multiparameter Lab-on-a-Chip flow cytometry of the cell cycle // Biosensors and Bioelectronics. 2013. Vol. 42. P. 586-591.
11. Зимина T. M. Лаборатории-на-чипе для телемедицины // Биотехносфера. 2012. № 1(19). С. 29-40.
12. Зимина T. M., Лучинин В. В. «Лаборатория-на-чипе». Микробиологическая экспресс-диагностика патогенных бактерий // Наноиндустрия. 2013. № 7(45). С. 38-44.
14. Jothimuthu P., Wilson R. A., Herren J. [et al.] Lab-on-a-chip sensor for detection of highly electronegative heavy metals by anodic stripping voltammetry // Biomedical Microdevices. 2011. Vol. 13 (4). P. 695-703.
15. Ino K., Saito W., Koide M. [et al.] Addressable electrode array device with IDA electrodes for high-throughput detection // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (3). P. 385-388.
16. Quinton D., Girard A., Thi Kim L. T. [et al.] On-chip multi-electrochemical sensor array platform for simultaneous screening of nitric oxide and peroxynitrite // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (7). P. 1342-1350.
17. Inoue K.Y., Matsudaira M., Kubo R. [et al.] LSI-based amperometric sensor for bio-imaging and multi-point bio-sensing // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2012. Vol. 12 (18). P. 3481-3490.
18. Jungreuthmayer C., Birnbaumer G. M., Zanghellini J. [et al.] 3D numerical simulation of a lab-on-a-chip-increasing measurement sensitivity of interdigitated capacitors by passivation optimization. // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (7). P. 1318-1325.
19. Tsouti V., Boutopoulos C., Zergioti I. [et al.] Capacitive microsystems for biological sensing // Biosensors and Bio-electronics. 2011. Vol. 27. P. 1-11.
20. Arya S. K., Lee K. C., DahAlan D. B. [et al.] Breast tumor cell detection at single cell resolution using an electrochemical impedance technique // Lab on a Chip — Miniaturization for Chemistry and Biology. 2012. Vol. 12 (13). P. 23622368.
21. Pang L., Chen H. M., Freeman L. M. [et al.] Optofluidic devices and appl: cations in photonics, sensing and imaging // Lab Chip. 2012. Vol. 12(19). P. 3543-3551.
22. Pang S., Han C., Lee L. M. [et al.] Fluorescence microscopy imaging with a Fresnel zone plate array based optofluidic microscope // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (21). P. 3698-3702.
23. Ryu G., Huang J., Hofmann O. [et al.] Highly sensitive fluorescence detection system for microfluidic lab-on-a-chip // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (9). P. 1664-1670.
24. Dongre C., Van Weerd, J., Besselink G. A. J. [et al.] Modulation-frequency encoded multi-color fluorescent DNA analysis in an optofluidic chip // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (4). P. 679-683.
25. Erickson D., Serey X., Chen Y.-F. [et al.] Nanomanipulation using near field photonics // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (6). P. 995-1009.
26. Padgett M., Di Leonardo R. Holographic optical tweezers and their relevance to lab on chip devices // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (7). P. 1196-1205.
27. Bishara W., Sikora U., Mudanyali O. [et al.] Holographic pixel super-resolution in portable lensless on-chip microscopy
using a fiber-optic array // Lab on a Chip — Miniaturisation 46. for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (7). P. 1276-1279.
28. Chen A., Eberle M. M., Lunt E. J. [et al.] Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy on a planar opto- 47. fluidic chip // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry
and Biology. 2011. Vol. 11 (8). P. 1502-1506.
29. Фрумкин A. Об явлениях смачивания и прилипания пузырьков // Журнал физической химии. 1938. Т. 12. 48. С. 337-345.
30. Bio-Rad. URL: http://www.bio-rad.com/
31. Lee J., Kim C.-J. Liquid Micromotor Driven by Continuous Electrowetting // Proc. IEEE Micro Electro Mechanical 49. Systems Workshop. Heidelberg, Germany. Jan. 1998.
P. 538-543.
32. Pollack M. G., Fair R. B., Shenderov A. D. Electrowetting-based actuation of fluid droplets for microfluidic applica- 50. tions // Applied Physics Letters. 2000. Vol. 77 (11).
33. Erin R. Ferguson Welch, Yan-You Lin, Andrew Madison [et al.] Picoliter DNA sequencing chemistry on an electrowetting-based digital microfluidic platform//Biotechnol. J. 2011. 51. Vol. 6. P. 165-176.
34. Lafrenière N. M., Shih S. C. C., Abu-Rabie P. [et al.] Multiplexed extraction and quantitative analysis of pharmaceuticals from
DBS samples using digital microfluidics. 2014. Bioanalysis. 52. Vol. 6 (3). P. 307-318.
35. Valley J. K., Ningpei S., Jamshidi A. [et al.] A unified platform for optoelectrowetting and optoelectronic tweezers 53. // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (7). P. 1292-1297.
36. Jebrail M. J., Sinha A., Vellucci S. [et al.] World-to-Digital-Microfluidic Interface Enabling Extraction and Purification 54. of RNA from Human Whole Blood // Analytical Chemistry. 2014. Vol. 86(8). P. 3856-3862.
37. Yoon S., Kim J. A., Lee S. H. [et al.] Droplet-based microfluidic system to form and separate multicellular spheroids using 55. magnetic nanoparticles // Lab on a Chip — Miniaturisation
for Chemistry and Biology. 2013. Vol. 13 (8). P. 1522-1528.
38. Zhou H., Yao S. Electrostatic charging and control of droplets 56. in microfluidic devices // Lab on a Chip — Miniaturisation
for Chemistry and Biology. 2013. Vol. 13 (5). P. 962-969.
39. Rotem A., Abate A. R., Utada A. S. [et al.] Drop formation 57. in non-planar microfluidic devices // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2012. Vol. 12
(21). P. 4263-4268. 58.
40. Travagliati M., Shilton R. J., Pagliazzi M. [et al.] Acousto-fluidics and Whole-Blood Manipulation in Surface Acoustic Wave Counterflow Devices // Anal. Chem. 2014, 86 (21).
P. 10633-10638. 59.
41. Ogilvie I. R. G., Sieben V. J., Cortese B. [et al.] Chemically resistant microfluidic valves from Viton® membranes bonded to COC and PMMA // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (14). P. 2455-2459.
42. Hwang H., Kim H.-H., Cho Y.-K. Elastomeric membrane 60. valves in a disc // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (8). P. 1434-1436.
43. Den Dulk R. C., Schmidt K. A., Sabatté G. [et al.] Magneto- 61. capillary valve for integrated purification and enrichment of nucleic acids and proteins // Lab on a Chip — Miniaturisation
for Chemistry and Biology. 2013. Vol. 13 (1). P. 106- 62. 118.
44. Ezkerra A., Fernandez L. J., Mayora K. [et al.] SU8 diaphragm micropump with monolithically integrated cantilever check valves // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry 63. and Biology. 2011. Vol. 11 (19). P. 3320-3325.
45. Cha K. J., Kim D. S. A portable pressure pump for microfluidic lab-on-a-chip systems using a porous polydimethylsiloxane 64. (PDMS) sponge // Biomedical Microdevices. 2011. Vol. 13
(5). P. 877-883.
Ren H., Xu S., Wu S.-T. Liquid crystal pump // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2013. Vol. 13 (1). P. 100-105.
Malouin B. A., Vogel M. J., Olles J. D. [et al.] Electromagnetic liquid pistons for capillarity-based pumping // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (3). P. 393-397.
Vespini V., Coppola S., Grilli S. [et al.] Pyroelectric Adaptive Nanodispenser (PYRANA) microrobot for liquid delivery on a target // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (18). P. 3148-3152. Simmchen J., Baeza A., Ruiz D. [et al.] Asymmetric hybrid silica nanomotors for capture and cargo transport: Towards a novel motion-based DNA sensor // Small. 2012. Vol. 8 (13). P. 2053-2059.
Hitzbleck M., Gervais L., Delamarche E. Controlled release of reagents in capillary-driven microfluidics using reagent integrators // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (16). P. 2680-2685. Beck M., Brockhuis S., Van Der Velde N. [et al.] On-chip sample preparation by controlled release of antibodies for simple CD4 counting // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2012. Vol. 12 (1). P. 167-173. Verbarg J., Kamgar-Parsi K., Shields A. R. [et al.] Spinning magnetic trap for automated microfluidic assay systems // Lab Chip. 2012. Vol. 12(10). P. 1793-1799. Ochs C. J., Kasuya J., Pavesi A. [et al.] Oxygen levels in thermoplastic microfluidic devices during cell culture // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2014. Vol. 14 (3). P. 459-462.
Cho H., Hamza B., Wong E. A. [et al.] On-demand, competing gradient arrays for neutrophil chemotaxis // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2014. Vol. 14 (5). P. 972-978.
Shah P., Zhu X., Chen C. [et al.] Lab-on-chip device for single cell trapping and analysis // Biomedical Microdevices. 2014. Vol. 16 (1). P. 35-41.
Skommer J., Akagi J., Takeda K. [et al.] Multiparameter. Lab-on-a-Chip flow cytometry of the cell cycle // Biosensors and Bioelectronics. 2013. Vol. 42 (1). P. 586-591. Henighan T., Chen A., Vieira G. [et al.] Manipulation of magnetically labeled and unlabeled cells with mobile magnetic traps // Biophys. J. 2010. Vol. 98(3). P. 412-417. Chen A., Byvank T., Chang W.-J. [et al.] On-chip magnetic separation and encapsulation of cells in droplets // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2013. Vol. 13 (6). P. 1172-1181.
Fritzsch F. S. O., Rosenthal K., Kampert A. [et al.] Picoliter nDEP traps enable time-resolved contactless single bacterial cell analysis in controlled microenvironments // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2013. Vol. 13 (3). P. 397-408.
Kortmann H., Chasanis P., Blank L. M. [et al.] The Enviro-stat — a new bioreactor concept // Lab Chip. 2009. Vol. 9. P. 576-585.
Huang T. Q., Qu X., Liu J. [et al.] 3D printing of biomimetic microstructures for cancer cell migration // Biomedical Microdevices. 2014. Vol. 16 (1). P. 127-132. Comina G., Suska A., Filippini D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2014. Vol. 14 (2). P. 424-430.
Wünscher S., Seise B., Pretzel D. [et al.] Chip-on-foil devices for DNA analysis based on inkjet-printed silver electrodes // Lab Chip. 2014. Vol. 14. P. 392-401.
Zhao Y., Pereira F., Demello A. J. [et al.] Droplet-based in situ compartmentalization of chemically separated components after isoelectric focusing in a Slipchip // Lab on a Chip —
Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2014. Vol. 14 71. (3). P. 555-561.
65. Jung J. H., Kim G.-Y., Seo T. S. An integrated passive micromixer-magnetic separation-capillary electrophoresis microdevice for rapid and multiplex pathogen detection at 72. the single-cell level // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (20). P. 3465-3470.
66. Otto S., Kaletta U., Bier F. F. [et al.] Dielectrophoretic immobilisation of antibodies on microelectrode arrays // Lab 73. on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2014. Vol. 14 (5). P. 998-1004.
67. Koh Y., Kang H., Lee S. H. [et al.] Nanoslit membrane-integrated fluidic chip for protein detection based on size- 74. dependent particle trapping // Lab on a Chip — Miniaturisation
for Chemistry and Biology. 2014. Vol. 14 (1). P. 237-243.
68. Browne A. W., Ramasamy L., Cripe T. P. [et al.] A lab-on-a-chip 75. for rapid blood separation and quantification of hematocrit
and serum analytes // Lab on a Chip — Miniaturisation
for Chemistry and Biology. 2011. Vol. 11 (14). P. 2440- 76.
2446.
69. Griep L. M., Wolbers F., De Wagenaar B. [et al.] BBB on CHIP:
Microfluidic platform to mechanically and biochemically 77. modulate blood-brain barrier function // Biomedical Microdevices. 2013. Vol. 15 (1). P. 145-150.
70. Agarwal A., Goss J. A., Cho A. [et al.] Microfluidic heart
on a chip for higher throughput pharmacological studies // 78. Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2013. Vol. 13 (18). P. 3599-3608.
Ho C.-T., Lin R.-Z., Chen R.-J. [et al.] Liver-cell patterning Lab Chip: Mimicking the morphology of liver lobule tissue // Lab on a Chip — Miniaturisation for Chemistry and Biology. 2013. Vol. 13 (18). P. 3578-3587.
Lee B. S., Lee Y. U., Kim H.-S. [et al.] Fully integrated lab-on-a-disc for simultaneous analysis of biochemistry and immunoassay from whole blood // Lab on a Chip. 2011. Vol. 11. P. 70-78.
Wang S., Zhao X., Khimji I. [et al.] Integration of cell phone imaging with microchip ELISA to detect ovarian cancer HE4 biomarker in urine at the point-of-care // Lab on a Chip. 2011. Vol. 11. P. 3411-3418.
Lee D.-S., Jeon B. G., Ihm C. [et al.] A simple and smart telemedicine device for developing regions: A pocket-sized colorimetric reader // Lab on a Chip. 2011. Vol. 11. P. 120-126. Gong M. M., Macdonald B. D., Nguyen T. V. [et al.] Lab-in-a-pen: A diagnostics format familiar to patients for low-resource settings // Lab on a Chip. 2014. Vol. 14. P. 957-963. Boles D. J., Benton J. L., Siew G. J. [et al.] Droplet-Based Pyrosequencing Using Digital Microfluidics / / Analytical Chemistry. 2011. Vol. 83. P. 8439-8447. Dimov I. K., Basabe-Desmonts L., Garcia-Cordero J. L. [et al.] Stand-alone self-powered integrated microfluidic blood analysis system (SIMBAS) // Lab on a Chip. 2011. Vol. 11. P. 845-850.
Manage D. P., Lauzon J., Pilarski L. M. Storing self-contained gel capillary cassettes for POC medical diagnostics // Lab on a Chip. 2013. Vol. 13. P. 4087-4095.
Серия
«Физика и технология микро- и наносившем»
В. А. Карасев В. В. Лучинин А. И. Соколов
БИО- И КВАНТОВО-ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В НАНОЭЛЕКТРОНИКЕ
В. А. Карасев, В. В. Лучинин, А. И. Соколов БИО- И КВАНТОВО-ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В НАНОЭЛЕКТРОНИКЕ
Рассматриваются проблемы создания и применения наносистем в рамках бионического и квантово-информационного подходов. Фактически материал учебного пособия можно рассматривать как методический базис для реализации основных положений программы развития критических технологий Российской Федерации «Нано-, био-, информационные и когнитивные технологии». Особое внимание уделено материаловедческому аспекту и принципам работы устройств био- и квантово-информацион-ной электроники.
