Квантово-химический анализ структуры циклоферона и уровень экспрессии CD-маркеров Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Кабденова А.Т.1, Сатыбалдиева Ж.А.2

!Кан. фарм. наук, 2д. мед. наук, профессор; Национальный центр экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники МЗ РК

КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ЦИКЛОФЕРОНА И УРОВЕНЬ

ЭКСПРЕССИИ CD-МАРКЕРОВ

Цель: изучить квантовую химию и уровень экспрессии CD-маркеров иммуномодулятора циклоферона

Материалы и методы: метод Хартри-Фока в полуэмпирическом приближении РМ3 (Parametrization Method 3).

В данной статье представлено исследование влияния квантово-химических характеристик известного иммуностимулятора циклоферона на проявление экспрессии CD.

1.Материалы и методы

1.1 Подготовка крови - забор производили в контейнер со стерильным 6% раствором ЭДТА в соотношении 20/1. Кровь перемешивали с полиглюкином (1:1), инкубировали при комнатной температуре в течение 1-1,5 ч, взвесь клеток без эритроцитов декантировали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Удаляли надосадочную жидкость, осадок разбивали и добавляли 1 мл среды RPMI-1640.

1.2 Фракционирование мононуклеаров - в центрифужную пробирку вносили 1 мл изопака (Sigma, США) с плотностью 1,076 г/мл, осторожно наслаивали 1 мл клеточной суспензии. Осаждали на центрифуге при 3000 об/мин в течение 20 мин (температура ротора 8оС). Интерфазное кольцо клеток собирали в контейнер, добавляли 20 мл среды RPMI-1640 и отмывали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант удаляли, встряхивали клеточный осадок постукиванием по дну контейнера и добавляли к нему 1 мл полной культуральной среды RPMI-1640, с 10% ФТС, 4 мМ L-глутамина, 100 мг/мл стрептомицина и 100 МЕ/мл пенициллина.

1.3 Культивирование клеток - суспензию полученных клеток доводили до 106 кл./мл полной культуральной средой и вносили по 200 мкл в 96-луночный планшет. Клетки культивировали при 37оС, 5% СО2 и 95% влажности в течение 48 ч. В опытные ячейки вносили тестируемую пробу.

1.4 Приготовление рабочих разведений препаратов - циклоферон растворяли, получая конечную концентрацию препарата 50 мкг/мл.

1.5 Проточная цитофлуориметрия клеток - после окончания культивирования из каждых 10 ячеек, содержащих мононуклеарные клетки контроля (без препарата) или опыта, после мягкого ресуспендирования отбирали культуральную среду и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем супернатант удаляли, встряхивали клеточный осадок постукиванием по дну контейнера и добавляли к осадку 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора для определения содержания клеток, несущих маркеры иммунокомпетентных клеток (CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, DR). К 100 мкл исследуемого образца добавляли 20 мкл моноклональных антител, меченных фикоэритрином (PE) или флуоресцеинизо-тиоцианатом (FITC). Перемешивали и инкубировали в течение 15-30 мин при комнатной температуре в затемненном месте, центрифугировали в течение 5 мин при 300 g. После этого удаляли супернатант и повторно центрифугировали в течение 5 мин при 200 g с фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0,1% азид натрия. Удаляли супернатант и добавляли фиксирующий раствор, содержащий формальдегид. Процентное содержание меченых клеток в образце определяли с помощью проточного цитофлуориметра FACS Calibur.

1.7 Компьютерный химический анализ - изучена молекулярная механика и реакционная способность циклоферона с применением метода Хартри-Фока в полуэмпирическом приближении РМ3 (Parametrization Method 3) [1, 2].

1.8 Статистический анализ - данные обрабатывали методами математичес-кой статистики, используя прикладную программу Microsoft Excel.

2. Результаты исследования

Полученные результаты свидетельствуют о незначительно выраженной экспрессии CD3 и CD4 -маркерв (р >0,05, рисунки 1 и 2). То есть циклоферон в наших исследованиях практически не способствовал экспрессии Т-клеток, активации кластеров дифференциации Т-хелперов, субпопуляций моноцитов, кортикальных тимоцитов._

70 60 50 40 30 20 10 0

Циклофер Контроль

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Циклоф

Контроль

Рис. 1 - Влияние циклоферона на экспрессию CD3-маркера мононуклеарными клетками периферической крови человека

Рис. 2 - Влияние циклоферона на экспрессию CD4-маркера мононуклеарными клетками периферической крови человека

25

20

15

10

Циклоф

Контроль

25

20

15

10

Циклоф Контроль

Рис. 3 - Влияние циклоферона на экспрессию CD8-маркера мононуклеарными клетками периферической крови человека

Рис. 4 - Влияние циклоферона на экспрессию CD19-маркера мононуклеарными клетками периферической крови человека

5

5

0

0

30 25 20 15 10

Циклоф Контроль

40 35 30 25 20 15 10 5 0

Циклофер

Контроль

Рис. 5 - Влияние циклоферона на экспрессию CD16-маркера мононуклеарными клетками периферической крови человека

Рис. 6 - Влияние циклоферона на экспрессию DR-маркера мононуклеарными клетками периферической крови человека

5

0

Данные, представленные на рисунках 4 и 5 показывают, что циклоферон достоверно стимулирует экспрессию CD8, CD19 и CD^-маркеров, то есть стимулирует противоопухолевый и противовирусный иммунитет за счет экспрессии EBV трансформированных В-клеток (т.е. корецептора MHC II класса, рецептор для ВИЧ), Т-цитотоксических субпопуляций NK-клеток, NK-клеток, гранулоцитов, макрофагов, (Fcg RIII)., В-клеток и их предшественников. При этом циклоферон практически не влиял на распознавание чужеродных антигенов и межклеточные взаимодействия В-лимфоцитов и макрофагов с Т-хелперами (рисунок 6).

Квантово-химические характеристики циклоферона представлены в таблицах 1, 2, 3, 4. Для анализа нами отобраны: теплота образования (AHf, ккал/мол), полная энергия (Etot ), потенциал ионизации (IP), полная электронная энергия (Eei), энергия отталкивания ядер (Enn).

Теплота образования (энтальпия образования, ДН) - тепловой эффект реакции образования химических соединений из простых веществ в стандартном состоянии. Она дает количественную оценку энергии, необходимой для разрушения молекулы химического вещества.

Полная энергия (Etot) - сумма кинетической и потенциальной энергий, т.е. общий энергетический потенциал молекулы. Она характеризует стабильность соединения и позволяет оценить возможности гидролиза вещества в организме и продолжительность его действия.

Потенциал ионизации (IP) - это величина, определяемая отношением наименьшей энергии, необходимой для однократной ионизации атома (или молекулы), находящегося в основном состоянии, к заряду электрона Он равен работе вырывания электрона из атома или молекулы и характеризует прочность связи электрона в атоме или молекуле, растворимость соединения в различных средах и его реакционную способность. Чем выше значение IP, тем лучше растворимость и способность вступать в различные реакции. То есть IP - один их основных показателей, характеризующих способность вещества вступать во взаимодействие с теми или иными молекулами.

Полная электронная энергия (Ee) характеризует величину энергии, необходимую для передачи электронов из одной системы (в данном случае молекулы) в другую квантовую

систему. Чем ближе к 0 или положительному значению Eel, тем менее стабильна локализация электронов на внешней оболочке молекулы или атома.

Дипольный момент (Dip) - векторная величина, характеризующая асимметрию распределения положительных и отрицательных зарядов в электрически нейтральной системе. Dip важен для исследования внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий, так как он характеризует распределение электронного заряда относительно зарядов и ядер и конформацию исследуемой молекулы или комплекса, возможности изменения этих конформаций под воздействием внешних электрических полей. Dip обусловлен смещением электронного облака в сторону одного из АТОМОВ. Dip позволяет судить о РАСПРЕДЕЛЕНИИ ЭЛЕКТРОННОЙ ПЛОТНОСТИ В МОЛЕКУЛАХ и зависимости её от характера отдельных заместителей.

Е(ВЗМО) эВ - энергия верхней занятой молекулярной орбитали. Она характеризует -прочность электрон-ядерных связей верхних молекулярных орбиталей.

E(НСМО) эВ - энергия нижней свободной молекулярной орбитали (НСМО). Она характеризует диапазон энергии, которую нужно приложить для перехода электронов на самую нижнюю, свободную от них в стационарном состоянии молекулы, электронную орбиталь. Е(НСМО), в совокупности с ВЗМО, характеризует стабильность молекулярной системы химического соединения.

Анализ данных таблицы 1 свидетельствует о высокой стабильности N-метилглюкамина не только в виде молекулы, но и виде катиона (отрицательные значения AHf, Etot, Eel,, Е(ВЗМО). Форма N-метилглюкамина в виде молекулы обладает высокой конформационной активностью (положительное значение Dip), что характеризует его как вещество с высокой степенью аффинитета к клеточным рецепторам.

Таблица 1. Квантово-химические характеристики N-метилглюкамина

НАИМЕНОВАНИЕ МОЛЕКУЛА КАТИОН

ПОКАЗАТЕЛЕЙ

AHf ккал/моль -229.64 -85.48

Etot эВ -2723.23543 -2732.31662

Eel эВ -15471.74544 -15698.01956

Enn эВ 12748.51001 12965.70294

Dip Дебай 5.804 -

Е(ВЗМО) эВ -8.788 -13.770

Е(НСМО) эВ 2.033 -4.129

Однако НСМО имеет положительное значение, то есть в структуре №метилглюкамина заложены возможности повышения реакционной способности при перенесении её из инертной среды, например, в условия слабых электрических полей, каковыми являются межклеточные и внутриклеточные биологические среды.

Акридинуксусная кислота (таблица 2) стабильна как в форме молекулы, так и в виде аниона. Следует отметить, что её стабильность в виде аниона предполагает возможность создания стабильного комплекса с катионом №метилглюкамина. Конформационная активность кислоты ниже, чем у №метилглюкамина, однако энергия НСМО близка к 0, то есть данное соединение может взаимодействовать с другими веществами посредством электрон-электронных взаимодействий, которые в условиях организма могут легко ферментироваться. Следовательно данное соединение должно быть мало-токсичным, что подтверждают литературные данные [3, 4, 5].

Комплекс №метилглюкамина с акридиноуксусной кислотой (таблицы 3 и 4) может существовать в виде протонированного №метилглюкамина с анионом акридинуксусной кислоты и нейтральной молекулы.

Очевидно, что наиболее устойчивым является комплекс нейтральных молекул, связанных водородной связью: Ен_ьи^ = -0.27425 эВ = 6.33 ккал/моль, сумма энергий

нейтральных молекул ниже, чем у комплекса из заряженных частиц и суммы энергий разделенных аниона и катиона. Однако в условиях организма за счет сольватации более устойчивым может оказаться комплекс из заряженных частиц.

Таблица 2. Квантово-химические характеристики акридинуксусной кислоты

НАИМЕНОВАНИЕ МОЛЕКУЛА АНИОН

ПОКАЗАТЕЛЕЙ

AHf ккал/моль -70.00 -106.98312

Etot эВ -2989.58984 -2975.86096

Eel эВ -19854.74822 -19412.91346

Enn эВ 16865.15838 16437.05250

Dip Дебай 2.970 -

Е(ВЗМО) эВ -8.653 -4.903

Е(НСМО) эВ -0.698 2.274

Следует отметить, что как для протонированного, так и нейтрального комплексов N-метилглюкамина с анионом акридиноуксусной кислоты характерно близкое к 0 значение Е(НСМО), что свидетельствует в пользу повышения активности этой молекулы в условиях организма

Однако Dip выше у протонированного комплекса: его величина даже выше, чем у отдельных остатков. Т. е. при формировании протонированного комплекса существенно повышается конформационная активность.

Таблица 3. Квантово-химические характеристики комплекса протонированного N-метилглюкамина с анионом акридиноуксусной кислоты

НАИМЕНОВАНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МОЛЕКУЛА

AHf ккал/моль -287.29

Etot эВ -5712.28972

Eel эВ -51926.52065

Enn эВ 46214.23093

Dip Дебай 9.240

E(ВЗМО) эВ -8.116

E(НСМО) эВ -0.340

Следует также обратить внимание на повышение Епп, которое, с точки зрения квантовой химии, объясняется увеличением количества взаимодействующих ядер при образовании комплекса. При этом величины Епп как в комплексе протонированного N метилглюкамина, так и нейтрального ^метилглюкамина одинаковы. Т.е. оба комплекса имеют примерно одинаковый уровень стабильности, но, с учетом более высокой конформационной активности, в организме более значимую биологическую роль должна играть протонированная форма. Следовательно, по некоторым аспектам механизма протекания реакций циклоферон сходен с такими широко известными химическими комплексами, как гемоглобин, ферменты и т.д., что соответствует литературным данным о его способности активировать реакции биосинтеза, в частности, интерферонов [3, 4].

Таблица 4. Квантово-химические характеристики комплекса нейтральных N-метилглюкамина с акридиноуксусной кислотой

НАИМЕНОВАНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МОЛЕКУЛА

AHf ккал/моль -305.97

Б™ эВ -5713.09952

Eel эВ -51359.49489

Епп эВ 45646.39537

Dip Дебай 4.837

Б(ВЗМО) эВ -8.763

Б(НСМО) эВ -0.699

ТАКИМ ОБРАЗОМ, КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦИКЛОФЕРОНА СВИДЕТЕЛЬСТВУЮТ О ВЫСОКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ И КОНФОРМАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ЭТОГО ПРЕПАРАТА, КОТОРЫЕ ПРЕДПОЛАГАЮТ НАЛИЧИЕ ВЫСОКОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ, УРОВНЯ АБСОРБЦИИ И БОЛЬШОЙ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ циркуляции в организме в терапевтических концентрациях. Эти результаты подтверждаются литературными данными: после приема внутрь циклоферон быстро и полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта, терапевтическая концентрация сохраняется в крови около 8 часов.

Выявленная более значимая роль в организме протонированной формы открывает новые возможности в изучении его механизма действия и, в частности, поиске сходных элементов с механизмом регулирования реакций синтеза интерферонов с ферментами.

Анализ пространственного строения циклоферона (рис 1, 2 и 3) показывает, что все три стабильные конформации ^метилглюкамина и акридинуксусной кислоты имеют большое количество активных центров.

Конформация комплекса (циклоферона) обеспечивает сохранение активных центров обоих остатков, что обосновывает наличие высокой биологической активности исследуемого препарата.

Таким образом, наши квантово-химические исследования показали, что молекула циклоферона высоко стабильна, конформационно активна и обладает высокой реакционной активностью при наличии большого количества доступных для взаимодействий активных центров, что хорошо согласуется с полученными данными о его высокой биологической активности в качестве индуктора интерферона

В наших исследованиях впервые была выявлена высокая реакционная способность протонированных комплексов циклоферона, что свидетельствует в пользу возможного ферментоподобного действия этого вещества на синтез интерферонов.

Таким образом, компьютерные химические исследования циклоферона вновь дали важные результаты для изучения понимания функционирования иммунной системы при её коррекции индукторами интерферона и для нахождения путей коррекции её патологических изменений.

Выводы:

1. Компьютерные химические исследования дали новые важные данные при изучении механизма действия иммуностимулятора циклоферона._

Рис. 7 Пространственное строение ^метилглюкамина

Рис. 9 Пространственное строение комплекса N-метилглюкамина с акридинуксусной

кислотой

Литература

1. Perun T.J., Propst C.L. Computer-Aided Drug Design: Methods and Applications (Hardcover)

Marcel Dekker Ink New-York and Basel, 2010, 485 с

2. Шайтан К.В., Терешкина К.Б. Введение в метод молекулярной динамики. В: Молекулярная

динамика белков и пептидов (Методическое пособие), МГУ.

Htpp/www.moldyn.ru/library/manual, 2008 г cl - 2

3. Циклоферон. Справочник Видаль. www.vidal.kz

4. Исаков В.А., Коваленко А.Л., Евграфов В.Д., Аспель Ю.В., Бузунова С. Использование таблеток циклоферона в терапии менингитов. //Российский биомедицинский журнал, т 2, - с 49 - 51

5. Еремееева И.Г., Михайлова Е.В., Штейнберг А.В., Кошкин А.П., Каральский С.А. Иммунокоррегирующая терапия при нейроинфекциях у детей./ Врач-аспирант// Научно-практический журнал. www.vrach-aspirant.ru

6. Голубев С. - Циклоферон в терапии аденовирусного конъюнктивита. www.rusvrach.ru

7. Семениченко А.Г., Антонов А.Р., Куприянов И.А. Циклоферон - иммунокорректор общего применения для местного лечения //Современные наукоемкие технологии, №10, 2005 г - с 33-35