CC BY
77
УДК 544.18/577.29:577.17
ПРОГНОЗИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТАГОНИСТОВ ХОЛЕЦИСТОКИНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА
© 2014 Н. Б. Кузнецова, П. Е. Кузнецов
1 доцент каф. химии, канд. химич. наук e-mail: moscow 1978@mail.ru 2проф. каф. химии, доктор химич. наук e-mail: kuznetsovpe@mail. ru
Курский государственный университет
На основе квантово-химических расчетов взаимодействия пептида ССК-4 и рецептора ССК-2 с учетом ЯМР исследований предложена модель взаимодействия лигандов с ССК-2 рецептором. Предлагаемый механизм действия заключается в том, что протонированный ССК-4 инициирует перенос электрона с рецептора на пептид. Согласно предложенной модели антагонисты блокируют процесс переноса электрона. Адекватность предлагаемой модели подтверждается тем, что она объясняет экспериментальные данные о типе и степени активности лигандов ССК-2 рецептора.
Ключевые слова: квантово-химическая модель, лиганды ССК-2 рецептора, протонирование, пептид ССК-4, антагонисты рецептора, перенос электрона.
Нейропептид холецистокинин (ССК-33) локализуется в ЦНС [Crawley 1994: 731 -755] и состоит из 33 аминокислотных остатков [Deschenes 1984]. Известно, что ССК-17, ССК-8, ССК-4 пептиды, на которые расщепляется холецистокинин [Beinfeld 2003], также являются нейротрансмиттерами [Baamonde 1992; Lena 1997].
Установлено, что 90% всех ССК-пептидов составляет октапептид ССК-8(Б), сульфированный по тирозину в положении 27 (Tyr27) [Dockray 1976; Beinfeld 1981; Radu 2003; Dufresne 2006]. Пептиды ССК-4 (Trp30-Met31-Asp32-Phe33-NH2) и ССК-8 это С-концевые фрагменты ССК-33.
ССК-пептиды оказывают влияние на пищеварение [Morley 1982; Clerc 2007]. В ЦНС (как нейромодуляторы) они регулируют процессы обучения и памяти, болевые ощущения, стресс, панические реакции [Shlik 1999]. Кроме того, они также участвуют в развитии никотиновой, опиоидной и алкогольной зависимостей, шизофрении [Dufresne 2006].
Антагонисты ССК-2 рецепторов вышеперечисленные состояния купируют [Strohle 2000], а агонисты, наоборот, инициируют их.
Рассмотрим на молекулярном уровне механизм взаимодействия ССК-2 рецепторов с пептидом ССК-4, содержащим наименьшее количество атомов из всех ССК-пептидов. В расчетах использовались методы квантовой химии, молекулярной механики и программы HyperChem 7e, Discovery Studio Client v2.5.0.9164.
Рецептор ССК-2, состоящий из семи петель, является трансмембранным рецептором. Структура петли рецептора ССК-2, с которой ССК-4 образует водородные связи (ЕС1), неизвестна. Но известны аминокислотные последовательности петель родопсинового рецептора, структура которого наиболее близка к структуре петель ССК-2 рецептора. Гомология фрагментов ССК-2 рецептора, с которыми его лиганды образуют
ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
водородные связи, относительно аналогичных фрагментов родопсинового рецептора составляет 60 %.
В настоящей работе сконструирована модель внеклеточной петли (EC1) ССК-2 рецептора путем поточечных аминокислотных замен петли родопсинового рецептора ЕС1 [Protein Data Base]. Далее была проведена оптимизация структуры петли методами молекулярной механики и полуэмпирическим квантово-химическим методом РМЗ.
Структура петли ECi рецептора ССК2 представлена на рисунке 1.
Рис. 1. Структура петли ЕС1 рецептора ССК-2
Два электрона ВЗМО петли рецептора, находящегося в триплетном состоянии, группируются на концевых фрагментах глобулы -NH3+ и СОО_группах. Расчеты показали, что разность энтальпий образования триплетного и синглетного состояний равна минус 16,6 ккал/моль. Таким образом, триплетное состояние петли рецептора термодинамически более выгодно.
Структура гормона ССК-4, так же как и рецептор ССК-2, обладает некоторыми особенностями. Известно, что С-конец ССК-4 амидирован, а N-конец пептида протонируется, как и все пептиды. Ранее мы уже рассматривали роль протонирования в биохимических процессах [Кузнецова 2006; Kuznetsova 2006]. Эти работы анализировали реакции гидроксилирования на цитохроме Р-450 в клеточной мембране. Была также показана роль протонирования различных лигандов при их взаимодействии с ядерными [Кузнецова 2013] и цитозольными [Кузнецова 2014] рецепторами и другими биомишенями.
Рассмотрим взаимодействие трансмембранного рецептора ССК-2, находящегося в триплетном состоянии, и протонированного пептида ССК-4. На рисунке 2 представлена упрощенная модель гормон-рецепторного комплекса, основанная на работах [Giragossian 2001; Giragossian 2002].
Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 2
Кузнецова Н. Б., Кузнецов П. Е. Прогнозирование биологической активности
антагонистов холецистокининового рецептора
Рис. 2. Упрощенная модель комплекса гормона ССК-4 и фрагментов петель рецептора ССК-2 - ЕС1, содержащего аминокислоты N115, T119, и ЕС2, содержащего аминокислоту H207
В этих исследованиях с помощью ЯМР и молекулярного моделирования были определены вероятные сайты связывания ССК-8 с рецептором ССК-2. Поскольку нас интересует перенос электронной плотности, то в первую очередь мы рассматриваем наличие водородных связей. В данной работе обнаружено, что в комплексе (ССК-8 -рецептор ССК-2) аминокислоты фенилаланин и аспарагиновая кислота образуют восемь водородных связей с петлей рецептора ЕС1 и одну водородную связь с петлей рецептора ЕС2. В образовании водородных связей участвуют атомы водорода амидной группы Phe33 и три атома кислорода Asp32, с одной стороны, и аминокислоты петли ЕС 1 (F110, T111, N115, T119) и петли ЕС2 (H207), с другой стороны. Таким образом, активными группами ССК-8 являются депротонированная карбоксильная группа аспарагиновой кислоты и амидированный С-конец фенилаланина, которые образуют водородные связи с петлей рецептора ЕС1, и группа С=О Asp32, которая образует водородную связь с петлей рецептора ЕС2. Упрощенная модель гормон-рецепторного комплекса, представленная на рисунке 2, содержит фрагменты двух внеклеточных петель рецептора ЕС1, ЕС2 и три водородные связи между атомами карбоксильной группы Asp32 и аминокислотами петли рецептора ЕС1, а также одну водородную связь между группой С=О Asp и гистидином петли рецептора ЕС2. Активный центр рецептора находится в виде цвиттер-иона, причем фрагмент петли ЕС1 не заряжен, а фрагмент петли ЕС2 содержит две положительно заряженные аминокислоты.
Гормон ССК-4 протонирован по N-концу, поэтому его следует рассматривать как акцептор электронной плотности.
ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
Анализ распределения спиновой и зарядовой плотности в комплексе после взаимодействия показывает, что в каждой из областей, отмеченных пунктиром на рисунке 3, находится на ВЗМО по одному электрону с параллельными спинами.
Рис. 3. Распределение спиновой плотности в упрощенной модели комплекса гормона ССК-4 и фрагментов петель рецептора ССК-2 - ЕС1 и ЕС2
До взаимодействия электроны с параллельными спинами находились на рецепторе. Следовательно, произошло перераспределение электронов. Так, заряд на протонированном ССК-4 до взаимодействия был равен нулю, а после - минус 1. Следовательно, электрон перераспределился с рецептора на гормон. Соответственно, на фрагменте ЕС2 петли рецептора до взаимодействия заряд был равен плюс 1, а после - плюс 2. Вероятно, взаимодействие гормона с активным центром рецептора инициирует перенос электрона с рецептора (с петли ЕС2) на гормон.
Таким образом, протонированный гормон как акцептор электрона катализирует перенос электрона с рецептора и этим вызывает его трансформацию. Расчеты показали, что перенос электрона термодинамически выгоден, разность энтальпий образования конечного и исходного состояний равна минус 84,3 ккал/моль.
В результате переноса электрона гормон ССК-4 превращается в анион-радикал. После распада комплекса возможно депротонирование ССК-4, перенос электрона на переносчики электронов и образование исходного гормона ССК-4, который вновь будет взаимодействовать с рецептором с переносом электрона. Данный процесс может повторяться много раз вплоть до биодеградации молекул гормона. Таким образом, малое количество молекул создает эффект высоких концентраций гормона, который по сути является переносчиком электронов.
Таким образом, гормон ССК-4 при определенных условиях выступает в роли переносчика электронов и катализатора переноса электрона с рецептора на гормон. Данный процесс и возможность протонирования гормона могут выступать критериями
Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 2
Кузнецова Н. Б., Кузнецов П. Е. Прогнозирование биологической активности
антагонистов холецистокининового рецептора
отбора агонистов и антагонистов ССК-4. Предположительно, агонисты катализируют перенос электрона, а антагонисты - нет.
И действительно, расчеты показали, что если модификация N-конца гормона ССК-4 не приводит к существенным изменениям структуры активного центра или электронным параметрам гормона, то такие аналоги являются агонистами. Если же в процессе модификации резко изменяется электростатический потенциал (ЭСП) молекулы, энергия НСМО-уровня или разрушается сетка водородных связей активного центра, то такой аналог является антагонистом. В таблице 1 представлены результаты отнесения аналогов ССК-4 к антагонистам/агонистам ССК-2 рецептора на основе анализа влияния структуры N-концевой группы (с учетом протонирования) на электронные параметры ССК-4.
Таблица 1
№ Наименование Термодинамически выгодный протонированный аналог Энергия НСМО-уровня в протонированной форме, эв Расчетные данные Эксперимен тальные данные
1 ССК-4 Протонирование по N-концу -2,22 Агонист Агонист
2 CH3CH2-C(O)- Протонирование по атому азота индольного кольца -2,76 Агонист Агонист
3 СН3СН2-0-С(0)- Протонирование по атому азота индольного кольца -2,99 Агонист Агонист
4 (CH3)3C-O-C(O)- Протонирование по атому азота индольного кольца -2,88 Агонист Агонист
5 CH3-C(O)- Протонирование по атому азота индольного кольца -2,82 Агонист Агонист
6 CH3-O-C(O)- Протонирование по атому азота индольного кольца -3,02 Агонист Агонист
7 CC^4- СО-(СН2)2-СОО- Протонирование по атому кислорода СОО-группы модифицированного N-конца ССК-4 1,47 Антагонист Антагонист
8 CC^4- СО-СН(СН3)-СОО- Протонирование по атому кислорода СОО-группы модифицированного N-конца ССК-4 1,44 Антагонист Антагонист
9 CC^4- СО-СН2-СОО- Протонирование по атому кислорода СОО-группы модифицированного N-конца ССК-4 1,39 Антагонист Антагонист
10 CC^4- СО-СН2^О3- Протонирование по атому кислорода SО3-группы модифицированного N-конца ССК-4 0,64 Антагонист Антагонист
ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
Протонирование аналогов ССК-4 возможно по N-концу для ССК-4; по атому азота индольного кольца или по атому кислорода СОО-, БО3- групп модифицированного N-конца для аналогов ССК-4. Но в действительности реализуется лишь термодинамически выгодный протонированный аналог с меньшей энтальпией образования.
Из табличных данных видно, что для антагонистов протонирование по СОО-, БО3-группам N-конца термодинамически выгодно. Но ЭСП таких молекул и энергия их НСМО-уровня отличаются от таковых для гормона ССК-4. Поэтому их молекулярные орбитали не будут взаимодействовать с молекулярными орбиталями рецептора и переноса электрона не произойдет. Для протонированных агонистов ССК-4 энергия НСМО-уровня близка по величине к таковой для протонированного пептида ССК-4. Поэтому для них взаимодействие с рецептором и дальнейший перенос электрона возможны.
Таким образом, механизм действия гормона ССК-4 и его агонистов заключается в том, что они связываются с активным центром рецептора, протонируются по атому азота индольного кольца триптофана и выступают в роли переносчика электронов и катализатора переноса электрона с рецептора на гормон или агонист.
Антагонисты, напротив, либо не протонируются, либо протонируются по более сильным основаниям N-конца по сравнению с N-концом ССК-4, в результате чего электронная структура настолько сильно отличается от структуры для ССК-4, что переноса электрона не происходит.
Ниже представлены свойства антагонистов:
1. Не протонируются, либо параметры их протонированных производных значительно отличаются от параметров для ССК-4, в частности энергией НСМО-уровня.
2. Содержат группы модифицированного N-конца - сильные основания.
3. Липофильность молекулы протонированного аналога: 2 ^ 6.
4. Липофильность N-концевого заместителя протонированного аналога: 0,5 ^ 4.
Перенос электрона с рецептора на гормон ССК-4 определяется тем, что в
протонированной форме пептид активируется и у него появляются акцепторные свойства (достаточная электронная плотность на ИИ3-группе НСМО-уровня). Квантово-химические расчеты свидетельствуют о том, что протонированная производная молекулы ССК-4 является акцептором электронной плотности. Электронно-акцепторные свойства молекулы ССК-4 определяются возможностью протонирования N-концевой аминокислоты пептида.
Тип активности лиганда определяется возможностью протонирования, наличием сильных оснований, близостью значений энергий НСМО-уровня к аналогичным значениям для ССК-4 и липофильностью.
Известно [Якубке 1985], что пептидные гормоны инициируют сигнал на рецептор, в результате которого изменяется конформация последнего. Поскольку в комплексе лиганд ССК-4 - активный центр рецептора ССК-2 образуется 7 водородных связей, логично предположить, что таким сигналом является перенос электрона с рецептора ССК-2 на молекулу лиганда ССК-4.
Из вышеперечисленных положений следует, что агонисты ССК-2 рецептора -аналоги ССК-4 могут образовывать комплекс с ССК-2 рецептором подобно молекуле ССК-4 и являются акцепторами электронной плотности. Антагонисты ССК-2 рецептора могут образовывать комплекс с ССК-2 рецептором, но не являются акцепторами электронной плотности, то есть не участвуют в переносе сигнала на рецептор. Антагонисты ССК-2 рецептора могут конкурировать с молекулой ССК-4 или другим агонистом за активный центр рецептора.
Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 2
Кузнецова Н. Б., Кузнецов П. Е. Прогнозирование биологической активности
антагонистов холецистокининового рецептора
На основании предложенной модели взаимодействия лиганда ССК-4 с рецептором ССК-2 были найдены объяснения литературным экспериментальным данным. Известно [Якубке 1985], что дезамидирование, замещения в индольном кольце триптофана (Trp30) и в фенильном кольце фенилаланина (Phe33), любое замещение в аспарагиновой кислоте (Asp32) приводят к снижению активности или к инактивации тетрапептида [Calberg 1992]. И действительно, дезамидирование и замещение в аспарагиновой кислоте (Asp32) разрушают структуру сетки водородных связей активного центра петида ССК-4. Замещения в индольном кольце триптофана (Trp30) также влияет на расположение атомов активного центра ССК-4, так как связь N-H триптофана расположена рядом с ним. Замещения в фенильном кольце фенилаланина (Phe33) приводят к перераспределению электронной плотности в структуре активного центра ССК-4, и водородные связи с рецептором могут не образовываться. При этом изменяются не только электронные свойства молекул, но и энергии их НСМО-уровней.
Таблица 2
Зависимость величины полумаксимального значения на агонистической кривой pA50 от последовательной замены аминокислотных остатков в ССК-4 на аланин [Calberg 1992]
№ Соединение Полумаксимальные значения на агонистической кривой, pA50 Липофильность, lgP
1 Trp30-Met31-Asp32-Phe33- nh2 8.9 3,7
2 Ala30-Met31-Asp32-Phe33- nh2 6.0 2,3
3 Trp30-Ala31-Asp32-Phe33- nh2 7.0 3,8
4 Trp30-Met31-Ala32-Phe33- nh2 Пептид не активен -
5 Trp30-Met31-Asp32-Ala33- nh2 4.0 2,0
Замещение аспарагиновой кислоты (Asp32) аланином, а также дезамидирование разрушают структуру активного центра ССК-4 и приводят к инактивации тетрапептида.
При замене аминокислот Trp30, Met31 и Phe33 на аланин происходит уменьшение липофильности ССК-4 и агонистические свойства ССК-4 уменьшаются на несколько порядков. Это подтверждается высоким коэффициентом корреляции (0,86) между полумаксимальным значением на агонистической кривой (pA50) и липофильностью (lgP).
Известно, что окисление метионина ССК-4 приводит к инактивации пептида. И действительно, при этом резко изменяются липофильные свойства пептида, в частности, lgP окисленного метионина становится равен минус 1,05, что приводит к переходу пептида в водную среду. В результате лиганд не достигает биомишени и лиганд - рецепторный комплекс не образуется.
Известно, что сульфированный тетрапептид ССК-4 теряет свою активность. И действительно, поскольку в структуре пептида аминокислотные остатки триптофан и аспарагиновая кислота находятся рядом, то сульфирование приводит к образованию водородной связи между 803И-группой и аспарагиновой кислотой. В результате электронная структура активного центра пептида изменяется и взаимодействия не происходит.
ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ
Таким образом, известные экспериментальные данные могут быть объяснены на основе предлагаемой модели взаимодействия ССК-4 и его аналогов с рецептором ССК-2. Это свидетельствует об адекватности предлагаемой модели.
Таким образом, на основе исследования электронной структуры гормона ССК-4 и его комплекса с активным центром рецептора ССК-2 был выдвинут механизм действия гормона ССК-4 и его антагонистов на молекулярном уровне. Механизм заключается в том, что протонированный по N-концу пептид ССК-4 связывается с активным центром рецептора ССК-2 и катализирует перенос электрона с рецептора на гормон. После депротонирования и образования исходного состояния гормона ССК-4 вновь множество раз будет взаимодействовать с рецептором с переносом электрона, катализируя данный процесс.
Таким образом, малое количество молекул создает эффект высоких концентраций гормона, который по сути является переносчиком электронов. Антагонисты, наоборот, блокируют перенос электрона, так как электронные параметры их протонированных производных значительно отличаются от таковых для ССК-4 и их молекулярные орбитали не взаимодействуют с молекулярными орбиталями рецептора ССК-2.
Библиографический список
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е., Согуренко И.А. Возможный механизм токсического действия экотоксикантов класса дибензо-п-диоксина // Вестник Саратовского государственного аграрного университета. 2006. № 2. С. 18-24.
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Квантово-химическая модель гормонов щитовидной железы как доноров и переносчиков электронов // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2013. № 4. С. 179-184.
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Квантово-химическое моделирование механизма действия лигандов NR3C4 рецептора // Auditorium: электронный научный журнал. 2014. № 1. URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/001-004.pdf (дата обращения: 12.05.2014).
Якубке Х.Д., Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985. 456 с.
Baamonde A., Dauge V., Ruiz-Gayo M., Fulga I.G., TurcaudS. Antidepressant-type effects of endogenous enkephalins protected by systemic RB 101 are mediated by opioid 5 and dopamine D1 receptor stimulation // Eur. J. Pharmacol. 1992. V. 216. P. 157-166.
Beinfeld M.C. Biosynthesis and processing of pro-CCK: recent progress and future challenges // Lite Sci. 2003. V. 72. P. 747-757.
BeinfeldM.C., PalkovitsM. Distribution of cholecystokinin (CCK) in the hypothalamus and limbic system of the rat // Neuropeptides. 1981. V. 2. P. 123-129.
Calberg M., Gundlach A.L., Mercer L.D., Beart P.M. Autoradiographic localization of cholecystokinin A and B receptors in the rat brain using ( 125 I) D-Tyr (Nle 28, 31) - CCK25 -33 (S) // Eur. J. Neurosci. 1992. V. 4. P. 563-573.
Clerc P., Constans M.G.C., Lulka H., Broussaud S., Guigne C., Leung-Theung-Long S., Perrin C., Knauf C., Carpene C., Penicaud L., Seva C., Burcelin R., Valet P., Fourmy D., Dufresne M. Involvement of cholecystokinin 2 receptor in food intake regulation: Hyperphagia and increased fat deposition in cholecystokinin 2 receptor-deficient mice // Endocrinol. 2007. V. 148. № 3. P. 1039-1049.
Crawley J.N., Corwin R.L. Biological actions of cholecystokinin // Peptides. 1994. V. 15. P. 731-755.
Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 2
Кузнецова Н. Б., Кузнецов П. Е. Прогнозирование биологической активности
антагонистов холецистокининового рецептора
Deschenes R.J., Lorenz L.J., Haun R.S., Roos B.A., Collier K.J., Dixon J.E. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding rat preprocholecystokinin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1984. V. 81. P. 726-730.
Discovery Studio Client v2.5.0.9164 [Сайт]. URL: http//www.accelrys.com/ (дата обращения: 20.06.2011).
Dockray G.J. Immunochemical evidence of cholecystokinin-like peptide in brain // Nature. 1976. V. 264. P. 568-570.
Dufresne M.N., Seva C., Fourmy D. Cholecystokinin and gastrin receptors // Physiol. Rev.
2006. V. 86. P. 805-847.
Giragossian C., Mierke D.F. Intermolecular interactions between cholecystokinin-8 and the third extracellular loop of the cholecystokinin-А receptor // Biochemistry. 2001. V. 40. № 13. P. 3804-3809.
Giragossian C., Mierke D.F. Intermolecular interactions between cholecystokinin-8 and the third extracellular loop of the cholecystokinin-2 receptor // Biochemistry. 2002. V. 41. № 14. P.4560-4566.
Hyper Chem Release 7 for Windows. 2002. HyperCube, Inc. 860 p.
Kuznetsova N.B., Vlasov I.A., Kuznetsov P.E., Mihirev D.A. Quantum-chemical and Experimental Modelling of Hydrogen Peroxide Formation in Heterogeneous Water Surroundings/Milieus Which Contain Dibenzo-p-dioxines or Their Analogues // SPIE Proceedings. 2006. V. 5067. P. 288-294.
Lena I., Roques B.P., Durieux C. Dual modulation of dopamine release from anterior nucleus accumbens through cholescystokinin-B // J. Neurochem. 1997. V. 68. P. 162-168.
Morley J.E. Minireview: The ascent of cholecystokinin (CCK)—from gut to brain // Life Science. 1982. V. 30. P. 479-493.
Netto C.F., Guimaraes F.S. Anxiogenic effect of cholecystokinin in the dorsal periaqueductal gray // Neuropsychopharmacol. 2004. V. 29. № 1. P. 101-107.
Protein Data Base [Сайт]. URL: www.rcsb.org/pdb/home/home.do (дата обращения:
14.07.2013).
Radu D., Ahlin A., Svanborg P., Lindefors N. Pentagastrin test for anxiety -psychophysiology and personality // Psychopharmacol. 2003. V. 166. P. 139-145.
Shlik J., Zhou Y., Koszycki D., Vaccarino J.F., Bradwejn J. Effects of CCK-4 infusion on the acoustic eye-blink startle and psychophysiological measures in healthy volunteers // J. Psychopharmacol. 1999. V. 13. № 4. P. 385-390.
Strohle A., Holsboer F., Rupprecht R. Increased ACTH concentrations associated with cholecystokinin tetrapeptide-induced panic attacks in patients with panic disorder // Neuropsychopharm. 2000. V. 22. № 3. P. 251-256.
