CC BY
18
УДК 544.18/577.29:577.17
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ФУНКЦИОНАЛА ПЛОТНОСТИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗМОЖНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ АГОНИСТОВ ХОЛЕЦИСТОКИНИНОВОГО РЕЦЕПТОРА
© 2017 Н. Б. Кузнецова, П. Е. Кузнецов
1канд. хим. наук, доцент кафедры химии e-mail: moscowl978@mail.ru
2докт. хим. наук, профессор кафедры химии e-mail: kuznetsovpe@mail.ru
Курский государственный университет
На основе литературных данных ЯМР исследований и наших расчетов методом функционала плотности предложена модель взаимодействия холецистокининового рецептора с его агонистами. Расчеты показали, что при взаимодействии холецистокининового пептида ССК-4 с рецептором ССК-2 происходит перенос электрона с комплекса рецептор-гуанозиндифосфат на протонированный ССК-4.
Ключевые слова: квантово-химическая модель, агонисты холецистокининового рецептора, протонирование, перенос электрона.
Авторы настоящей статьи разрабатывают теорию гормонов и гормоноподобных соединений. Она основана на некоторых экспериментах [Кузнецов и соавт. 2013, 2016] и квантово-химических расчетах с использованием экспериментальной базы данных PDB [Кузнецова, Кузнецов 2013-2017]. Теория состоит из двух частей. В первой исследуется взаимодействие гормонов с молекулой кислорода в реакциях окислительного гидроксилирования [Кузнецова, Кузнецов 2006; Кузнецов и соавт. 2013, 2016] и окислительного фосфорилирования [Кузнецова, Кузнецов 2013]. Во второй части изучается взаимодействие гормонов с внутриклеточными рецепторами: трансмембранными [Кузнецова, Кузнецов 2014а, 2015б, 2016, 2016б], цитозольными и ядерными [Кузнецова, Кузнецов 2014, 2017, 2017а].
Так, было показано, что диоксины протонируются по атому кислорода диоксинового кольца и взаимодействуют с молекулярным кислородом цитохрома Р-450, активируя побочную реакцию образования перекиси водорода.
Гормоны щитовидной железы также взаимодействуют с кислородом цитохромоксидазы в реакции окислительного фосфорилирования. В этих процессах гормоны множество раз участвуют в переносе электрона на молекулу кислорода, являясь переносчиками электронов, в данном случае донорами электронов.
Таким образом, малое количество гормонов инициирует значимый биохимический эффект. Перенос электронов на кислород становится возможным потому, что молекула кислорода находится в основном триплетном состоянии. При ее взаимодействии с синглетной молекулой гормона возникает градиент мультиплетности и перераспределение электронной плотности и перенос электронов.
В случае внутриклеточных рецепторов гормоны протонируются и являются акцепторами электронов, которые переносятся от молекул нуклеотидов:
гуанозиндифосфата G-белка в случае трансмембранного рецептора и ДНК в случае ядерного рецептора. Ни один из компонентов комплекса [гормон - рецептор - нуклеотид] не находится в основном триплетном состоянии. Однако при образовании этого комплекса возможен переход системы из синглетного в основное триплетное состояние. Для этого конечные продукты процесса переноса электрона должны быть устойчивее начальных продуктов.
Описанный механизм позволяет объяснить множество экспериментальных данных.
Было разработано две модели взаимодействия гормонов с рецепторами: одна -на основе полуэмпирических квантово-химических методов, она оказалась недостаточно точной; другая - на основе метода функционала плотности (DFT), который является более надежным методом.
Расчеты выполнены с применением программы Gaussian 09 [[Сайт]. www.gaussian.com]. Предварительный расчет был проведен с использованием программы HyperChem 7.01 и метода MNDO/d [Hyper Chem Release 7 for Windows].
В данной статье в качестве объекта исследований были выбраны
30 31 32 33
холецистокининовый рецептор и его агонист пептид ССК-4 (Trp -Met -Asp -Phe -NH2). Пептиды ССК-4 и ССК-8 это концевые фрагменты ССК-33. Нейропептид холецистокинин (ССК-33) локализуется в ЦНС [Crawley, Corwin 1994] и состоит из 33 аминокислотных остатков [Deschenes и соавт. 1984]. Механизм действия агонистов основан на их связывании с холецистокининовыми рецепторами. В ЦНС (как нейромодулятор) ССК-4 регулирует процессы обучения и памяти, болевые ощущения, стресс, панические реакции [Shlik и соавт. 1999]. Кроме того, ССК-4 также участвует в развитии никотиновой, опиоидной и алкогольной зависимостей, шизофрении [Dufresne и соавт. 2006].
Модель в методе DFT была построена на основе полуэмпирической модели [Кузнецова, Кузнецов 2014а]. В расчетах учитывался принцип построения модели как комплекса агониста, фрагмента активного центра рецептора и гуанозиндифосфата (ГДФ) G-белка.
На рисунке 1 представлена упрощенная модель ССК-4 - рецепторного комплекса,
Рис. 1. Упрощенная модель комплекса холецистокининового пептида ССК-4 и фрагментов петель рецептора ССК-2 - ЕС1, содержащей аминокислоты N115, T119, и ЕС2, содержащей аминокислоту H207
Auditorium. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2017. № 3 (15)
В этих исследованиях с помощью ЯМР и молекулярного моделирования были определены вероятные сайты связывания ССК-8 с рецептором ССК-2. Было экспериментально показано, что в комплексе (ССК-8 - рецептор ССК-2) аминокислоты фенилаланин и аспарагиновая кислота образуют восемь водородных связей с петлей рецептора ЕС1 и одну водородную связь с петлей рецептора ЕС2. Таким образом, активными группами ССК-8 являются депротонированная карбоксильная группа аспарагиновой кислоты и амидированный С-конец фенилаланина, которые образуют водородные связи с петлей рецептора ЕС1, и группа С=О Asp32, которая образует водородную связь с петлей рецептора ЕС2. Упрощенная модель ССК-4 - рецепторного комплекса, представленная на рисунке 1, содержит фрагменты двух внеклеточных петель рецептора ЕС 1, ЕС2 и три водородные связи между атомами карбоксильной группы Asp32 и аминокислотами петли рецептора ЕС1, а также одну водородную связь между группой
32
С=О Asp и гистидином петли рецептора ЕС2.
На основе данной упрощенной модели была построена модель в методе DFT.
Схема переноса электрона с ГДФ на агонист представлена уравнением 1.
E E E E
[[A +H+DAH]+R++GOH]" [AH---R---GOH-2]"[AH---R---GOH-2]-
ч___; ч_ п У
V V
C-1 C-1
e H+ H+
(1)
J # E # & & &
► [AH-("1)+R+H++GO"2]" [AH-("1)+R+H++GO"2]" [AH-("1)+R+H++GO"2]" A-1+R+
--.-- 1---' \ V
С-1 11+12+13
иде Я+ - фрагмент активного центра рецептора с зарядом плюс один и ионизированными К,С-концевыми группами;
ООН - гуанозиндифосфат, заряд минус два;
ОО ' - радикал ГДФ после переноса электрона с ГДФ на агонист и переноса протона с ГДФ на фрагмент активного центра рецептора, заряд минус два;
А - агонист ССК-4, заряд минус один;
С-1 - комплекс исходных реагентов, заряд минус один;
вверху строки схематически изображено спиновое состояние электронов на верхней занятой молекулярной орбитали (ВЗМО): Е - синглетное, ТТ - триплетное;
11, 12, 13 - интермедиаты;
Р - продукты реакции;
----обозначено существование водородных и ионных связей соединений комплекса.
Упрощенная модель комплекса представлена на рисунке 2.
В модели комплекса в качестве агониста рассматривался протонированный по КН2-группе К-конца пептид ССК-4, который следует рассматривать как акцептор электронной
плотности. В биообъектах пептиды существуют в виде цвиттер-ионов, в которых КН2-группа протонирована. Таким образом, агонист представляет собой молекулу с зарядом ноль.
В качестве модели фрагмента рецептора рассматривался гистидин с зарядом плюс один. Согласно экспериментальным данным, он образует водородную связь с агонистом [Опа§08з1ап, Млегке 2002]. К- и С-концевые группы ионизированы в соответствии с экспериментальными данными.
ГДФ имеет заряд минус два и может являться донором электронов._
Рис. 2. Упрощенная модель комплекса фрагмента активного центра холецистокининового рецептора, его протонированного агониста ССК-4 и гуанозиндифосфата. Пунктиром показаны водородные связи между агонистом, активным центром рецептора и ГДФ
На следующем этапе методом функционала плотности DFT в параметризации B3LYP в базисе STO 6-31G(d) был рассчитан упрощенный комплекс протонированного агониста, фрагмента активного центра рецептора и гуанозиндифосфата (ГДФ) G-белка (С-1 в уравнении). Комплекс был рассчитан в триплета ом состоянии. В результате расчетов была найдена стационарная точка на поверхности потенциальной энергии. Распределение спиновой плотности комплекса, полученное в результате расчетов, показано на рисунке 3.
Рис. 3. Распределение спиновой плотности в упрощенной модели комплекса, содержащего протонированный агонист холецистокининового рецептора ССК-4, фрагмент активного центра этого
Auditorium. Электронный научный журнал Курского государственного университета.
2017. № 3 (15)
рецептора и гуанозиндифосфат. Комплекс находится в триплетном состоянии. Эллипсами показаны области, на которых расположены электроны ВЗМО с параллельными спинами В результате взаимодействия и перераспределения электронной плотности в комплексе произошел перенос электрона от атомов кислорода фосфатной группы ГДФ на ССК-4, а также перенос протона от ГДФ на фрагмент активного центра рецептора.
В каждой из областей, отмеченных на рисунке, находится на валентной оболочке по одному электрону с параллельными спинами. Так, один электрон локализуется на молекуле ГДФ на атомах кислорода, а другой - на С=О-группе ССК-4.
Заряд на протонированном агонисте был равен нулю, а стал близок к минус единице (-0,86 ат. ед.). Заряд на молекуле ГДФ был равен минус двум, а после взаимодействия в результате переноса протона на фрагмент активного центра рецептора и в результате переноса электрона на агонист остался равен примерно минус 1,48 ат. ед. Заряд на фрагменте активного центра рецептора был равен плюс единице, а после взаимодействия в результате переноса протона стал близок к плюс 1,34 ат. ед. Следовательно, электрон перераспределился с ГДФ на агонист ССК-4.
Таким образом, возможно, механизм молекулярного действия заключается в том, что происходит перенос электрона с комплекса рецептор - гуанозиндифосфат на протонированный агонист. Это возможно лишь в случае, когда комплекс находится в основном триплетном состоянии. Из структуры найденного комплекса С-1 следует, что наиболее вероятными интермедиатами, образующимися в данной реакции будут:
- АН- (-1) в дублетном состоянии;
- протонированный фрагмент активного центра рецептора Я+Н+ с зарядом плюс два, ионизированной К-концевой группой и нейтральной (в результате переноса протона) С-концевой группой в синглетном состоянии;
- ГДФ (ОО-2') после переноса электрона на агонист и протона на фрагмент активного центра рецептора с зарядом минус два.
Затем после переноса электрона на агонист комплекс диссоциирует, теряет электрон и вновь может взаимодействовать с рецептором (возможно, многократно).
Далее были рассчитаны геометрия и разность энтальпий образования исходных реагентов и интермедиатов.
Расчеты проводились методом функционала плотности ББТ в параметризации БЗЬУР в базисе БТО 6-31О(ё). Результаты показали, что сумма энтальпий образования интермедиатов ниже, чем сумма энтальпий образования исходных реагентов. Таким образом, триплетное состояние комплекса устойчивее синглетного.
Можно говорить о том, что основное состояние комплекса триплетное.
Возможный механизм взаимодействия агонистов с холецистокининовым рецептором, в соответствии с неэмпирическим расчетами, заключается в следующем:
- агонист пептид ССК-4 находится в биообъектах в протонированном состоянии;
- агонист ССК-4 связывается с активным центром рецептора, образуя комплекс с восемью водородными связями с аминокислотами активного центра рецептора, в том числе и с гистидином петли ЕС2 рецептора ;
- после электронного взаимодействия ССК-4, петель рецептора и ГДФ происходит перенос электрона с ГДФ на агонист и переход комплекса в триплетное состояние;
- затем, после переноса электрона на агонист, взаимодействие ССК-4 с рецептором и ГДФ может происходить многократно;
- в дублетном состоянии у молекулы ГДФ изменяется структура, электронные и зарядовые параметры. В результате ГДФ вытесняется из комплекса гуанозинтрифосфатом (ГТФ). Это служит сигналом для дальнейших изменений в клетке.
Таким образом, в результате того, что основное состояние комплекса [ССК-4 -холецистокининовый рецептор - ГДФ] является триплетным, становится возможным следующий механизм действия холецистокининового пептида ССК-4 на молекулярном уровне. Как показали расчеты методом DFT, протонированный ССК-4 связывается с активным центром рецептора и катализирует реакцию переноса электрона с ГДФ на ССК-4. В результате изменения структуры после переноса электрона ГДФ вытесняется ГТФ, и далее сигнал передается в клетку. После диссоциации комплекса гормон ССК-4 превращается в исходное состояние и вновь множество раз может взаимодействовать с рецептором и ГДФ. Таким образом, микроскопическое количество ССК-4 может оказывать на клетку значительный эффект.
Библиографический список
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Квантово-химическая модель гормонов щитовидной железы как доноров и переносчиков электронов // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2013. № 4. С. 179-184.
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Квантово-химическое моделирование механизма действия лигандов NR3C4 рецептора // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. № 1(1). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/001-004.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Прогнозирование биологической активности антагонистов холецистокининового рецептора // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014а. № 2(2). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/002-003.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Возможный механизм биологического действия гормонов как доноров, акцепторов и переносчиков электронов // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014б. № 4(4). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/004-004.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н. Б., Кузнецов П. Е. Возможный механизм биологического действия агонистов NRзC4-рецептора как доноров, акцепторов и переносчиков электронов // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2015. № 2(6). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/006-002.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е Возможный механизм биологического действия ДНК как доноров электронов // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2015а. № 1(5). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/005-004.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Прогнозирование биологической активности лигандов каппа-опиоидного рецептора // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2015б. № 4 (8). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/008-002.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецов П.Е., Кузнецова Н.Б., Власов И.А. Экспресс-метод определения 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксина в водных средах // Ученые записки. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2013. Вып. 3 (27). Ч. 2. URL: www.scientific-notes.ru/pdf/032-014.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Auditorium. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2017. № 3 (15)
Кузнецов П.Е., Кузнецова Н.Б., Власов И.А. Реакция образования пероксида водорода, катализируемая диоксиноподобными соединениями // AUDITORIUM. 2016. № 2 (10). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/010-001.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Прогнозирование биологической активности антагонистов дофаминового D2 рецептора // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2016. № 1 (9). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/009-002.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Применение метода функционала плотности для исследования возможного механизма действия агонистов динорфинового рецептора // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2016а. № 3 (11). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/011-001.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е. Новый электронный дескриптор, отражающий биологическую активность лигандов внутриклеточных рецепторов // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2016б. № 4 (12). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/012-001.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н. Б., Кузнецов П. Е. Применение метода функционала плотности для исследования возможного механизма действия агонистов ядерного NR3C4 рецептора // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2017. № 1(13). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/013-002.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н. Б., Кузнецов П. Е. Применение метода функционала плотности для исследования возможного механизма действия агонистов ядерного эстрогенового рецептора // AUDITORIUM. Электронный научный журнал Курского государственного университета. 2017. № 2(14). URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/014-001.pdf (дата обращения: 13.08.2017)
Кузнецова Н.Б., Кузнецов П.Е., Согуренко И.А. Возможный механизм токсического действия экотоксикантов класса дибензо-п-диоксина // Вестник Саратовского государственного аграрного университета. 2006. № 2. С. 18-24.
Crawley J.N., Corwin R.L. Biological actions of cholecystokinin // Peptides., 1994. V. 15. P. 731-755.
Deschenes R.J., Lorenz L.J., Haun R.S., Roos B.A., Collier K.J., Dixon J.E. Cloning and sequence analysis of a cDNA encoding rat preprocholecystokinin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1984. V. 81. P. 726-730.
Dufresne M.N., Seva C., Fourmy D. Cholecystokinin and gastrin receptors // Physiol. Rev., 2006. V. 86. P. 805-847.
[Сайт]. www.gaussian.com (дата обращения: 5.04.2017).
Giragossian C., Mierke D.F. Intermolecular interactions between cholecystokinin-8 and the third extracellular loop of the cholecystokinin-А receptor // Biochemistry., 2001. V. 40. № 13. P. 3804-3809.
Giragossian C., Mierke D.F. Intermolecular interactions between cholecystokinin-8 and the third extracellular loop of the cholecystokinin-2 receptor // Biochemistry., 2002. V. 41. № 14. P.4560-4566.
Hyper Chem Release 7 for Windows. 2002. HyperCube, Inc. 860 p.
Shlik J., Zhou Y., Koszycki D., Vaccarino J.F., Bradwejn J. Effects of CCK-4 infusion on the acoustic eye-blink startle and psychophysiological measures in healthy volunteers // J. Psychopharmacol., 1999. V. 13. № 4. P. 385-390.
