CC BY
40
5. Гаврилов, В.Б., Гаврилова, А.Р., Мажуль Л.М. // Вопр. мед. химии. - 1987. - №1. - С. 118-122.
6. Фоломеев, В.Ф. Фотоколориметрический ультрамикрометод количественного определения сульфгидрильных групп белка и небелковых соединений крови // Лаб. дело. - 1981 - №1. - С. 33-35.
9. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т.2. - Минск: Беларусь, 2000. С. 74-75.
ABOUT THE OPPORTUNITY OF CORRECTION OF SOME PARAMETERS OF ANTIOXIDATIVE SYSTEM OF THE ORGANISM OF MILCH COWS BY THE FEEDING OF THE COMPLEX BIOLOGICALLY ACTIVE
MATERIALS
R.V. Rusakov, N.A. Garifullina
Summary. In article the opportunity of updating of some parameters of antioxidative system of an organism of milch cows is shown by a feeding of a complex biologically the active materials having antioxidative activity, influence on milk efficiency is determined.
Key words: antioxidative system, correction, cows, feeding, biologically active materials, malonic dial, a hepatocuprein, a sulfhydryl groups of proteins.
УДК 619:317 - 619:616.982.2
КУЛЬТУРАЛЬНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
В.Г. ОЩЕПКОВ, доктор ветеринарных наук, директор
ЛЛ. ТAЛЛЕР, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
Е.Ю. СЕКИН, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник
T.A. BAССИMИРСКAЯ, аспирант AM. СЛЕПЧЕНКО, аспирант ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных E-mail: vniibtg@rambler.ru
Резюме. Приведены результаты исследований, подтверждающие возможность эффективного использования ПЦР-анализа в ветеринарных лабораториях в качестве дополнительного метода, позволяющего выявлять труднорастущие и некультивируемые формы микобактерий. При этом повышается надежность исследования (до 100 %) и значительно сокращаются сроки постановки диагноза (в 6-20 раз).
Ключевые слова: диагностика, ускоренная идентификация, трудно культивируемые микобактерии туберкулеза, крупный рогатый скот, ПЦР.
Один из главных методов бактериологической диагностики туберкулеза, в основе которого лежит способность микобактерий размножаться на соответствующих питательных средах и образовывать микро- и макроколонии, - культуральный.
Наиболее часто для культивирования микобактерий используют плотные яичные питательные среды - Ле-венштейна-Йенсена, Гельберга, Финн-2. Однако на сегодняшний день они не всегда отвечают требованиям практической лабораторной диагностики [1, 4].
Наряду с усовершенствованием микробиологических методов обнаружения возбудителя ведется поиск новых способов индикации и идентификации микобактерий. В лабораториях все чаще, наряду с микробиологическими методами применяют молекулярно-генетические, в частности полимеразную цепную реакцию, в основе которой лежит ферментативная амплификация
выбранных специфических участков генома M. tuberculosis, M. bovis, их детекция и идентификация [2].
Достоверность результатов во многом зависит от выбора объекта исследований. Например, большинство авторов отмечают, что при использовании метода ПЦР при анализе непосредственно биоматериала от больного туберкулезом крупного рогатого скота положительный результат наблюдается в 45,5 % случаев, в то время, как при исследовании выделенных культур он достигается в 95,4...100 % случаев [3].
Цель наших исследований разработать оптимальный комбинированный метод лабораторной диагностики туберкулеза с применением модифицированных питательных сред в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
Условия, материалы и методы. Работа проведена на базе лаборатории клеточной биотехнологии и лаборатории диагностических исследований ВНИИБТЖ.
При производственной апробации разработанного метода для изучения отбирали биоматериал (легкие, печень, лимфоузлы) от крупного рогатого скота положительно реагировавшего на ППД-туберкулин для млекопитающих из хозяйств Омской области с различной эпидемиологической ситуацией по туберкулезу.
После предварительной пробоподготовки суспензии биоматериала высевали на 3 варианта питательных сред: Левенштейна-Йенсена (контроль) ФБС-1 и ФБС-2 (плотные питательные среды в нашей модификации), культивировали при 37 °С в течении 1.2 месяцев. Кроме того, для подтверждения наличия микробного агента в исследуемом биоматериале суспензиями заражали морских свинок.
Наряду с общепринятыми методами для индикации и идентификации возбудителя в ранние сроки его культивирования использовали полимеразную цепную реакцию (тест-система «МТБ-КОМ» для выявления возбудителя туберкулеза M.bovis и M.tuberculosis, производства ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии»). Всего было исследовано 20 проб биоматериала от крупного рогатого скота, в том числе 12 - от животных с туберкулезными поражениями и 8 - без визуально определяе-__ Достижения науки и техники АПК, №05-2010
Таблица. Результаты сравнительного исследования биоматериала от крупного рогатого скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств комбинированным методом в ранние сроки культивирования в сопоставлении с традиционным бактериологическим методом.
Характеристика ис-следованного материала
Число
проб
Комбинированный метод ______(посев ^ + ПЦР)___
З сутки
положи-
тельные
чис-
ло
%
отрица-
тельные
чис-
ло
%
Б сутки
положи-
тельные
чис-
ло
%
отрица-
тельные
чис-
ло
%
Традиционные бактериологические методы
культуральное
исследование
положи-
тельные
чис-
ло
%
отрица-
тельные
чис-
ло
%
биологическая проба___________
положи-
тельные
чис-
ло
%
отрица-
тельные
чис-
ло
%
С характерными поражениями Без характерных поражений Итого: Культура М.Ьо^!Э шт.14 (контроль)
12
в
20
12 100,0
1 12,5
13 65,0
1 100,0
12
100,
0
в 66,6
12 100,0
в7,5 2 25,0
35,0 14 70,0
100, - 1 0
75.0
30.0
в 40,0 12 60,0 12
- в 100,0
60,0 в 40,0
100,
0
1 100,0
1
Примечание: * - выявлены только атипичные микобактерии
мых туберкулезных поражений. На З и 5 сутки культивирования при отсутствии видимого роста были приготовлены смывы с одной пробирки с каждой среды, которые исследовали методом ПЦР. В качестве положительного образца в опыте использовали суспензию культуры M.bovis шт. 14 в разведении 1:106. Мазки каждого образца, окрашивали по Циль-Нильсену и исследовали методом световой микроскопии с помощью визуализированной системы Axiostar plus с микрофотографированием, результаты обрабатывали в электронной программе Axiovision Rel 4.7.
Результаты и обсуждение. Положительная реакция в ПЦР отмечалась в 12 пробах биоматериала с характерными туберкулезными поражениями (100,0 %), как на З, так и 5 сутки (см. табл.).
При исследовании этих же проб культуральным методом микобактерии туберкулеза были выделены только на 20.40 сутки из 8 проб (66,6 %), а атипичные из 7 проб (58,4 %). Биологическим методом на морских свинках туберкулез подтвержден, также как и комбинированным, в 100 % случаев, но только через 40 суток.
При изучении 8 проб биоматериала без видимых туберкулезных поражений на З сутки положительная реакция в ПЦР отмечена в одной (12,5 %), отрицательная - в 7 пробах (87,5 %). На 5 сутки положительный результат зафиксирован в 2 пробах (25,0 %), а отрицательный - в 6 (75,0 %).
В случае культуральных исследований этих же проб рост M.bovis не зафиксирован, в одном случае (12,5 %)
выделены атипичные микобактерии IV группы по классификации Раньона. Биологическая проба на морских свинках была отрицательной в 100 % случаев.
При исследовании контрольной культуры М.Ьомв шт.14 комбинированным и традиционными методами получен положительный результат.
При микроскопии мазков обнаружены как бактериальные формы в форме типичных красных палочек, так и измененные - в форме шаровидных клеток, зернистых элементов, нитевидных структур, обладающих пониженной жизнеспособностью.
Выводы. Разработанный комбинированный «культурально-генетический» метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может применяться в качестве одного из основных методов для ранней диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Его использование дает возможность не только сократить сроки диагностических исследований, по сравнению с традиционным бактериологическим методом, в 6-20 раз, но и повысить надежность (информативность) культурального метода на 33,4 %. При необходимости определения видовой принадлежности возбудителей туберкулеза, выявленных комбинированным методом, далее следует использовать в ПЦР соответствующие монови-довые праймеры (только М.Ьомв или МЛиЬвгаи!ов1в).
Разработанный экспресс-метод можно применять в обычных производственных ветеринарных лабораториях, занимающихся диагностикой туберкулеза крупного рогатого скота и имеющих оборудование для ПЦР.
Литература.
1. Василев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. // Медицина и физкультура. София. - 1971. - С.25 - 29.
2. Иртуганова О.А. Современные возможности микобактериологической лаборатории// Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №4. - С. 21-35.
3. Найманов А.Х., Овдиенко Н.П., Осипова Е.П. и др. ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота// Ветеринария. - 2004. - №10. - С. 19-23.
4. Федосеев В.С., Рубцова И.Н., Байгазанов А.Н. Проблемы изменчивости микобактерий. / Сборник научных трудов. Совершенствование систем и методов в борьбе с бруцеллезом и туберкулезом животных. ВАСХНИЛ. ВНИИБТЖ. Новосибирск, 1987. - C. 82-84.
THE CULTURAL-GENETIC METHOD OF DIAGNOSTICS OF CATTLE’S TUBERCULOSIS V.G. Oschepkov, L.A. Taller, E.Yu. Sekin, T.A. Vassimirskaya, A.D. Slepchenko
Summary. There are given the results of researches confirming an opportunity of an effective use of PCR method in veterinary laboratories as additional, allowing to reveal heavy-growing and uncultivated forms mycobacteria, thus raising reliability of research (up to 100 %), and considerably reducing terms of statement of the diagnosis (in 6 - 20 times).
Key words: diagnostics, accelerated identification, heavy-cultured mycobacterium of tuberculosis, cattle, PCR. Достижения науки и техники АПК, №05-2010 ____________________________________________________ 65
