CC BY
264
Криоконсервация культивируемых клеток нейробластомы мыши N^-115
С.Н.Мякишева1, Н.Ю. Сахарова24, Н.А Ивличева1’3
Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Моск. обл.,
2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Моск. обл., 3Пущинский государственный университет, Пущино, Моск. обл.
4Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Для изучения морфологической дифференцировки нервных клеток в культуре предложена перспективная модель - нейробластома Ы1Е-115 клона С-1300. Были подобраны оптимальные условия для замораживания-оттаивания данной культуры. Показаны способы культивирования нейробластомы и воздействие на культуру различных препаратов, что важно для исследований в области нейробиологии, нейрофармакологии и биомедицины.
Ключевые слова: культура нервных клеток, нейробластома, пролиферация, диффе-ренцировка, криоконсервация.
Одной из актуальных медико-биологических проблем нейробиологии является изучение механизмов, обеспечивающих сложные межнейронные взаимодействия в мозге как при экспериментальных воздействиях, так и при патологических состояниях, а также при регенерации. Значительный вклад был внесен в понимание механизмов нейрональной диффе-ренцировки методами, использующими культуры различных нервных клеток [8], изолированных как из нормальных, так и малигнизированных тканей нейрогенного происхождения. Большое преимущество клеточных культур заключается в возможности прижизненного анализа динамики морфологических и функциональных изменений этих клеток в процессе развития [7] или под влиянием биологически активных веществ, вводимых в питательную среду [2, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16]. Существенно и то, что для исследования культур может быть использовано большинство известных сегодня нейрогистологических, гистохимических, ультраструктурных и иммуноцитохимиче-
ских методов [3, 6]. Дифференцировка опухолевых нейробластов обратима: клетки могут втягивать образовавшиеся отростки и повторно делиться [18, 19] Связь процесса деления с дифференцировкой, по-видимому, не однозначна [6, 9, 10].
Основное достоинство клеток нейроб-ластомы как модели для изучения процессов дифференцировки нейронов заключается в возможности получения большого количества нервных клеток одного типа и их способности к пролиферации и диф-ференцировке (морфологической, элект-рофизиологической и биохимической) [6]. Известно, что при определенных условиях культивирования клетки нейроб-ластомы мыши обнаруживают свойства, характерные для нормальных нервных клеток. При дифференцировке нейробла-стомы во многих случаях экспрессируется полная ее программа, т.е. морфологическая дифференцировка как правило сопровождается биохимической и электро-физиологической.
На клетках нейробластомы при изучении механизма действия индукторов кле-
точной дифференцировки основное внимание уделяется взаимодействию их с клеточной мембраной, а также свойствам клеточной мембраны при экспрессии дифференцировки. Основными маркерными признаками нервных клеток является: морфология клетки (наличие у нее специфических нервных отростков), высокая активность ферментов, участвующих в метаболизме нейромедиаторов, электрическая возбудимость клеточной мембраны. Эти особенности характерны и для культивируемых клеток нейробла-стомы. Уровень спонтанной дифференци-ровки в культивируемых клетках довольно низкий. Известно много агентов, повышающих уровень дифференцировки клеток нейробластомы, в результате чего они становятся фенотипически сходными с другими нервными клетками [6].
Важно отметить, что в процессе длительного культивирования те или иные свойства клеток меняются, культура претерпевает процесс так называемого старения, поэтому для поддержания постоянства характеристик данной линии прибегают к замораживанию (хранению в жидком азоте) значительного количества клеток одного пассажа и последующему возобновлению культуры из замороженного состояния [1].
В связи с этим целью нашей работы было проведение исследований по изучению пролиферации и дифференцировки нервных клеток нейробластомы мыши N1E-115 клона C-1300 под влиянием изменений окружающей среды и подбор оптимальных условий замораживания — оттаивания данной культуры.
Материалы и методы
Все исследования были проведены на культуре клеток нейробластомы мыши N1E-115 клона C-1300, которая хранится в
криобанке Института биофизики клетки РАН. Клетки нейробластомы N1E-115 мыши культивировали в среде DMEM (Sigma, США), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Flow Laboratories, Великобритания) при 37°С. Пересев клеток проводили 2 раза в неделю. В экспериментах использовали клетки на 3-й день после пересева. Посевная доза — 1х104 кл/см2 поверхности пластиковых флаконов для культивирования. Через 1 сутки первичную среду меняли на среду, индуцирующую дифференцировку. Дифференциров-ку индуцировали: добавлением в окружающую среду форсколина и аверсектина. Количество дифференцированных клеток оценивали методом прижизненного наблюдения и подсчета в поле зрения под микроскопом. Степень морфологической дифференцировки клеток определяли как долю клеток, образующих отростки (нейриты) длиной не менее 50 мкм, по отношению к общему количеству клеток в каждом из полей зрения микроскопа (не менее 5). Учитывая коэффициент пересчета на кв. см, определяли количество дифференцированных клеток во флаконе. Для статистической обработки материала был использован критерий Стьюдента.
Режимом замораживания было постепенное охлаждение со средней скоростью
0,6-0,7°С / мин до температуры -40°С. Предварительно готовили концентрированную суспензию клеток в среде DMEM и в сыворотке. В качестве криопротектора добавляли 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Затем флаконы быстро переносили в жидкий азот (-196°С).
Оттаивание культуры клеток проводили по следующей схеме. Флаконы из жидкого азота помещали на 2-3 мин в теплую воду (37°С), затем суспензию клеток переносили в центрифужные пробирки и проводили 2-3 отмывания в сыворотке центрифугированием при 500-1000 об/мин. Далее клетки суспендировали в среде
БМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки и помещали в культуральные флаконы. После размораживания проводили 2-3 пассажа и затем использовали в экспериментах.
Результаты исследования и их обсуждение
Как показали наши исследования, выживаемость клеток при замораживании-оттаивании значительно зависит от состава суспензии, в которой проводят заморозку клеток (рис.1).
Рис.1. Выживаемость клеток нейробластомы мыши после криоконсервации в зависимости от состава криоконсервирующего раствора: а) 10% ДМСО + 90% (среда ДМЕМ с 10% сыворотки) б) 10% ДМСО + 90% сыворотки
Так, при использовании среды БМЕМ с 10% сывороткой сохраняют жизнеспособность максимум 56% клеток. В то же время при замораживании в 100% сыворотке число жизнеспособных клеток достигает максимум 92 %. Мы предполагаем, что данные результаты можно объяснить тем, что при криоконсервации клеток в культуральной среде БМЕМ возникает большая вероятность повреждения клеток образующимися кристаллами льда
при замораживании в отличие от замораживания в сыворотке. В то же время, возможно, что и сама сыворотка обладает естественными криозащитными свойствами. Сравнительный анализ показал, что наиболее оптимальными условиями замораживания с сохранением наибольшего числа жизнеспособных клеток нейроб-ластомы является использование 10% ДМСО и 90% сыворотки. При этом концентрация клеток в суспензии составляет не менее 2 млн. в 1 мл.
При изучении пролиферации и диф-ференцировки было показано, что под действием всех использованных индукторов пролиферирующие клетки нейробла-стомы претерпевают морфологическую дифференцировку в полном соответствии с картиной, описанной в литературе [6, 9, 17]. При культивировании в среде с 10% сывороткой в присутствии индукторов число морфологически дифференцированных клеток составляет максимум 2530%, в то время как число дифференцированных клеток в бессывороточной среде и среде с 1%-ой сывороткой достигает 50-60% от общего числа клеток. При культивировании без смены питательной среды (более 3-4 сут) дифференцированные клетки гибнут по типу апоптоза. В большинстве случаев скорость диффе-ренцировки клеток нейробластомы прямо пропорциональна их последующей гибели. Необратимая морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы под действием всех индукторов достигается практически одновременно на 3-4-сутки. Для получения больших количеств необратимо дифференцированных нейронов лучше использовать бессывороточ-ную среду БМБМ или среду БМБМ с 1%-ой сывороткой в комбинации с агентами, вызывающими дифференцировку. Наилучшие результаты были при добавлении в среду в качестве индуктора фор-сколина (рис.2).
Рис. 2. Культура клеток нейробластомы мыши (6-7 сут. культивирования), 50 мкм а) контроль (среда ДМЕМ + 10% сыворотки)
б) дифференцированная культура нейробластомы (ДМЕМ +1%сыворотки +
аверсектин)
в) дифференцированная культура нейробластомы (ДМЕМ +1%сыворотки +
форсколин)
Таким образом, для изучения морфологической дифференцировки нервных клеток в культуре предложена перспективная модель нейробластомы мыши ШБ-115 клона С-1300. Были подобраны оптимальные условия для замораживания — оттаивания данной культуры. Показаны способы культивирования ней-робластомы и возможности использования ее с целью изучения процессов пролиферации — дифференцировки нервных клеток под воздействием различных препаратов, что важно для исследований в области нейробиологии, нейрофармакологии и биомедицины.
Литература
1. Гахова Э.Н., Дмитриева Е.В. Криоконсервация нервной ткани // Биофизика живой клетки, Т. 7, с.65-68 (http: // cam.iteb. psn.ru /).2003.
2. Костенко М.А. Ионная регуляция дифференцировки и регенерации нейронов в культуре // Успехи совр. биол, Т. 5, с.221-234. 1980.
3. Костенко М.А., Лермонтова Н.Н. Культивирование нервной ткани и клеток беспозвоночных // В кн.: Руководство по культивированию нервной ткани. — М.: Наука, c.233-242. 1988.
4. Костенко М.А., Мякишева С.Н., Попов В.И. Морфологическая диффе-ренцировка клеток мышиной нейробластомы N1E-115. // Морфология, Т. 110, № 4, с.64-70. 1996.
5. Мякишева С.Н., Костенко М.А., Дри-няев В.А., Мосин В.А. Пролиферация и морфологическая дифференцировка клеток нейробластомы в культуре под влиянием авермектинов. // Морфология, Т. 120, № 6, с.24-26. 2001.
6. Никольский Н.Н., Вахтин Ю.Б., Игнатова Т.Н. и др. Биология клетки в культуре. — Л.: Наука, 280 с. 1984.
7. Пол Д. Культура клеток и тканей. — М.: Медгиз, 348 с, 1963.
8. Сотников О.С., Костенко М.А. Механическое напряжение и подвижность межклеточных контактов в культуре нервных клеток. // ДАН СССР, Т. 281, № 3, с.690-693. 1985.
9. Bodowei R., Hering S., Schubert B. et al. Sodium and Calcium Currents in Neuroblastoma x Glioma Hybrid Cells Before and After Morphological Differentiation by Dibutyryl Cyclic AMP. // Gen. Physiol. Biophys., Т4, p.113-127. 1985.
10. Eckert R., Hescheler J., Krautwwurst D. et al. Calcium currents in neuroblastoma x glioma hybrid cells after cultivation with dibutyryl cyclic AMP and nicel. //
European Journal of Physiology, Pflugers Arch, V 417, p.329-335. 1990.
11. Foulds L. Neoplastic development. // L.: Acad.Press, V. 1. 1969.
12. Foulds L. Neoplastic development. // L.: Acad.Press, ,V. 2. 1975.
13. Kostenko M. A., Myakisheva S.N.The Role of Chemotaxis in Morphological Differentiation of Mollusc Neurons. // Comp. Biochem. Physiol., V.115A, № 3, p.265-268. 1996.
14. Kostenko M.A., Myakisheva S.N., Popov V.I. Morphological differentiation of N1E-115 mouse neuroblastoma cells. // Neurosci. Behav. Physiol., 27 (5), p.516-523. 1997.
15. Kruman I.I., Kostenko M.A., Gordon RYa. et al. Differentiation and apoptosis of murine neuroblastoma cells. // Biochem.Biophys. Res. Commun. V 191(3), p.1309-1318.1993.
16. Perez-Juste G., Aranda A. Differentiation of mouse neuroblastoma cells by phorbol esters and insulin-like growth factor 1 is associated with induction of retinoic acid receptor ¡3 gene expression. // ONCOGENE, V 18, № 39, p.5393-5402. 1999.
17. Prasad K.N. Differentiation of neuroblastoma cells in culture. // Biol. Rev, V. 50, p.129-265. 1975.
18. Schubert D., Humphreys S., Baroni C., Cohn M. In vitro differentiation of a mouse neuroblastoma. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, V 66, p.5611-5615. 1979.
19.Seeds N.W., Gilman A.G., Amano T., NirenbergM.W. Regulation of axon formation by clonal lines of a neural tumor. // Proc. Nat. Acad. Sci. USAA, V. 66, p. 160167. 1970.
СRYOPRESERVATION OF CULTIVATED CELLS OF THE MOUSE N1E-115 NEUROBLASTOMA S.N. Myakisheva1, N.Yu. Sakharova2,4, NA Ivlicheva1,3
institute of Cell Biophysics, RAS, Pushchino, Moscow Region,
2Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, RAS, Pushchino, Moscow Region, 3Pushchino State University, Pushchino, Moscow region,
4The Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
Key words: in vitro culture of neuron cells, neuroblastoma, proliferation, differentiation, cryopreservation.
The mouse neuroblastoma N1E-115, Clone C-1300, was proposed as a perspective model for the studying of nerve cell morphological differentiation in culture. We have selected the optimal conditions for the freezing-thawing of this cell culture. The method of neuroblastoma cultivating, that allow to investigate the influence of different preparations on the nerve cell proliferation-differentiation processes were worked out. These data may play an important role in neurobiology, neuropharmacology and biomedicine investigations.
