CC BY
45
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 577.112:576.385.5:616-006.487
А.М. Строганова, Г.Ю Чемерис., Е.М. Чевкина, А.И. Сендерович, А.И. Карселадзе
БЕЛОК CRABP 1 И ЕГО РОЛЬ В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ НЕЙРОБЛАСТОМЫ
Строганова Анна Михайловна, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной патологии отдел патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Чемерис Галина Юрьевна кандидат биологических наук старший научный сотрудник отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Чевкина Елена Максимовна, доктор биологических наук заведующий лабораторией регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Сендерович Анастасия Ильинична кандидат медицинских наук научный сотрудник лаборатории молекулярной патологии отдел патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Карселадзе Аполлон Иродионович доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Контактная информация:
115478 г. Москва Каширское ш. 24, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, НИИ КО, лаборатория молекулярной патологии отдел патологической анатомии опухолей человека, Строганова А.М. e-mail: stroganova am@mail.ru
Статья поступила 06.06.2016, принята к печати 14.06.2016. Абстракт
Основной функцией белка CRABP 1 является связывание ретиноевой кислоты. Изменение экспрессии этого белка характерно для ряда новообразований человека и в некоторых случаях коррелирует с неблагоприятным прогнозом. Целью работы стало изучить экспрессию белка CRABP 1 в нейробластомах разной степени дифференцировки и имеющих различные генетические нарушения. Исследование выполнено с использованием метода иммуногистохимии и флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) на гистологическом материале 46 больных. В результате была обнаружена корреляция между уровнем экспрессии CRABP 1 и степенью клеточной дифференцировки. В недифференцированных и низкодифференцированных нейробластомах экспрессия этого белка была ниже, чем в созревающих и зрелых опухолях, ганглионейробластомах и ганглионевромах. Мы показали также, что уровень экспрессии CRABP 1 коррелирует с отсутствием генетических нарушений (таких как амплификация гена N-myc, делеции локусов 1р36 и 11q23) в опухолевых клетках, т.е. в группе незрелых нейробластом с генетическими аберрациями экспрессия белка CRABP 1 была снижена по сравнению с опухолями без хромосомных нарушений.
Ключевые слова: нейробластома, дифференцировка опухоли, экспрессия CRABP 1, генетические аберрации.
A.M. Stroganova, G.Yu. Chemeris., EMChevkina, A.I. Senderovich, A.I. Karseladze
CRABP PROTEIN 1 AND ITS ROLE IN THE PROCESS OF DIFFERENTIATION NEUROBLASTOMA Abstract
Cellular retinoic acid-binding protein is supposed to play an important role in retinoic acid-mediated differentiation and proliferation processes. Alteration in expression of CRABP 1 is characteristic for many human tumors and according to several communications can correlate with prognosis. The aim of the study was to investigate CRABP 1 expression in low-grade and high-grade neuroblastomas with different genetic aberrations (amplification MYCN, 1p36 and 11q23 deletions). Samples of neuroblastoma from 46 patients were investigated by immunohistochemical (IHC) analysis and fluorescent in situ hybridization (FISH). Our data show that CRABP 1 expression in neuroblastoma depends on tumor cell differentiation. We found that there is an inverse correlation between the CRABP 1 expression and the presence of genetic aberrations.
Key words: neuroblastoma, tumor differentiation, CRABP 1 expression, genetic aberrations.
Введение нальную дифференцировку и индуцируя экспрес-
сию нейрональных белков [1]. В связывании РК и, Ретиноевая кислота играет важную роль в раннем предположительно, снижении ее транскрипцион-
развитии нервной системы, стимулируя нейро- ной активности основную функцию выполняет
белок CRABP 1, который локализуется в цитоплазме. Отмечено, что в ходе эмбриогенеза CRABP 1 экспрессируется на высоком уровне в клетках нервного гребня и в эмбриональной дерме [2]. В исследованиях, проведенных на клеточных моделях, отмечено, что стимуляция метаболизма РК снижает уровень клеточной дифферен-цировки, что является одним из показателей опухолевой прогрессии. В связи с этим в последнее время значительно возрос интерес к изучению механизмов регуляции РК в процессе возникновения и роста опухолей.
Таким образом, одним из механизмов участия белка CRABP 1 в опухолевой прогрессии может быть снижение активности РК за счет усиления ее метаболизма. Интересно, что проонкоге-ная функция белка CRABP 1 может реализовы-ваться, по-видимому, и независимо от его способности к связыванию РК. Было показано, что гиперэкспрессия CRABP1 приводит к изменению экспрессии более 100 генов, включая гены, кодирующие ключевые регуляторные белки, участвующие в прогрессии опухолей. Такая альтернативная внутриклеточная функция способствует приобретению клеткой злокачественного потенциала [3].
Существует другая точка зрения на функцию белка CRABP 1, согласно которой данный белок выполняет опухоль-супрессорную функцию [4].
Известно, что изменение экспрессии CRABP 1 характерно для ряда новообразований человека, таких как опухоли молочной железы, аденокарцинома эндометрия, немелкоклеточный рак легкого, рак яичников и нейрогенные опухоли, и, по некоторым немногочисленным наблюдениям, может коррелировать с неблагоприятным прогнозом [5; 6].
Данные об экспрессии белка CRABP 1 в опухолях нейробластомы на сегодняшний день в научной литературе отсутствуют, поэтому представляется чрезвычайно актуальным изучить экспрессию этого белка в нейробластомах разной степени дифференцировки.
Наше исследование посвящено изучению взаимосвязи экспрессии белка CRABP 1 с целым рядом параметров как патологоанатомического, так и клинического плана у пациентов с нейроб-ластомой.
Материалы и методы
Материалы исследования
Материалом для исследования служили парафиновые срезы операционного материала 46 больных с диагнозом "нейробластома", проходивших лечение в» РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Возраст пациентов - от 2 месяцев до 20 лет.
Метод иммуногистохимии
Иммуногистохимическое исследование проводилось на парафиновых срезах по стандартной методике и было выполнено на 54 образцах
опухолей с ранее установленным диагнозом нейробластома (ганглионейробластома, ганг-лионеврома).
Срезы толщиной 4 мкм депарафинизирова-ли и дегидратировали по стандартной схеме. Для демаскировки антигена проводили обработку на водяной бане при + 95 оС в течение 40 мин с использованием цитратного буфера рН б,0 (Dako, Дания). Затем срезы инкубировали 1 ч с первичными антителами anti-CRABPl (Sigma-Aldrich, США). В качестве вторичных антител использовали систему детекции Super SensitiveTM Polymer-HRP (BioGenex, США). Для визуализации применялся раствор диаминобензидина DAB+ (Dako, Дания). Ядра клеток докрашивались гематоксилином.
Оценка результатов реакции проводилась полуколичественным методом двумя независимыми морфологами.
Оценивался процент антиген-позитивных клеток в образце опухоли и интенсивность реакции в цитоплазме и на мембране опухолевых клеток (мембран-но-цитоплазматическое окрашивание).
Флуоресцентная in situ
гибридизация на парафиновом срезе
Парафиновые срезы (4 мкм) депарафини-ровали в ксилоле 3 раза по 5 мин, затем отмывали в 9б %-ном этаноле 2 раза по 2 мин. Погружали стекла в кипящий раствор 0.1 мМ раствор ЕДТА рН 8.0, кипятили 5 мин при максимальном давлении. Затем стекла погружали в 0,15 мг/мл-ный раствор протеазы (Abbott Molecular, США) рН 2,0 на 30 мин. Дегидратировали по 2 мин в серии охлажденных спиртов 70 %; 85 %; 9б %. Наносили 1,5 мкл флуоресцентного зонда LSI N-myc Spectrum Green/CEP2 Spectrum Orange DNA Probe, 1p36 Microdeletion Region Probe (Abbott Molecular, США), ON MLL (11q23)/SE 11 (Kreatech) на интересующую область среза, накрывали покровным стеклом и денатурировали при +78 еС в течение 8 мин, заливали резиновым клеем, гибридизацию проводили во влажной камере при +37 еС в течение ночи (14-16 ч). После инкубации стекла отмывали 2 мин в 0,4-кратном цитратном буфере 0,44SSC/0,3 % NP-40, предварительно нагретым до +73 еС и 2 мин в двухкратном цитратном буфере 2чSSC/0,1 % NP-40 при комнатной температуре. Затем наносили контркраситель DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) для визуализации ядер.
Оценка результатов FISH-реакции
Результаты FISH-реакции оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа (Axioskop2 mot plus, Zeiss, Германия) и программы Isis. Визуализация сигналов осуществлялась с использованием фильтров: DAPI, Spectrum Green, Spectrum Orange, соответствующим спектрам испускания флуорофоров, которыми мечены флуоресцентные зонды. FISH-реакция расценивалась как положительная, если определялась амплификация гена N-myc, т.е. более чем четырехкратное увеличение
количества этого гена по сравнению с референс-ным участком, локализующимся на этой же хромосоме, т.е. центромерной областью. Известно, что уровень амплификации этого гена при ней-робластоме находится в диапазоне от 4- до 500-кратного увеличения, хотя чаще всего это 50-100-кратное увеличение.
При оценке результатов РШИ-реакции на наличие делеции локусов 1р36 и 1Ц23 реакция расценивалась как положительная, если количество ядер с делецией было более 10 %.
Результаты исследования
Изучение экспрессии белка СКЛЕР 1 в образцах нейробластомы разной степени диффе-ренцировки
Исследование проведено на 40 образцах опухоли, которые по гистологическому строению были поделены на 2 группы:
• 1 группа - недифференцированные и низкодифференцированные нейробла-стомы (25 образцов),
• 2 группа - нейробластомы с признаками созревания, ганглионейробластомы и ганглионевромы (15 образцов).
Исследование экспрессии белка СЯЛБР 1 проводилось иммуногистохимическим способом. Амплитуда результатов ИГХ исследования колебалась от полного отсутствия продукта реакции до интенсивной, распространенной окраски цитоплазмы клеток.
В группе недифференцированных и низко-дифференцированных нейробластом (1) окраска на СЯЛБР 1 была гетерогенной:
Для абсолютно незрелых опухолей (недифференцированных нейробластом) была характерна отрицательная реакция: это обычно ней-робластомы, строма которых имела ангиоматоз-ный характер с полным отсутствием фибриллярного материала.
Реакция оставалась отрицательной и в опухолях, которые как бы отражали более продвинутую стадию дифференцировки (низкодифферен-цированные нейробластомы), в которых ангиома-тозная строма постепенно замещалась фибриллярной, а то и слегка фиброзированной. Однако в этих опухолях в небольшой части крупноклеточной популяции реакция на СЯЛБР 1 была положительная, но на уровне мембранной окраски (рис. а, б).
С нарастанием процессов созревания число клеток, дающих положительную мембранную реакцию, повышалось (рис. 1 в, г). Особенно это относилось к клеткам, строящим трабекулярные структуры.
В опухолях, которые по своей морфологии представляли собой как бы связывающее звено между нейробластомой и ганглионейробластомой (клеточная популяция представлена нейробласта-ми с намечающимися ядрышками, растущими на фоне большого количества фибриллярного материала), реакция на СЯЛБР 1 была положительна
почти в 90 % клеточной популяции.
Группа (2) нейробластом с признаками созревания, ганглионейробластом и ганглионевром, демонстрировала высокий уровень экспрессии белка СЯЛБР 1.
В группе ганглионейробластом выделялись разные фазы созревающих новообразований. В опухолях, которые по своей структуре были ближе к низкодифференцированной нейробластоме, можно проследить динамику нарастания интенсивности окраски от слабой светло-коричневой в цитоплазме мелких клеток до интенсивной темно-коричневой окраски в цитоплазме более крупных клеток.
При этом интенсивность окраски была максимальной в зрелых клетках, имеющих нервные отростки. Появление клеток с пузырьковидными ядрами и с крупным эозинофильным ядрышком знаменовало окончательное созревание нейробласта и характеризовалось умеренно интенсивной положительной реакцией на СЯЛБР 1.
Клетки с пикнотическими ядрами давали очень высоко интенсивную реакцию, но, судя по их морфологии, речь шла об артефактах с пассивным накоплением антигена в цитоплазме этих клеток.
И, наконец, в ганглионевромах число зрелых клеточных элементов резко снижалось, крупные ганглиозные клетки были окружены мелкими сателлитными клетками (рис. 1 д, е). ИГХ окраска на СЯЛБР 1 во всех клетках была положительная, интенсивная. Продукт реакции накапливался и в клетках-сателлитах, но, что самое интересное, и в отростках, которые в препаратах, окрашенных гематоксилином-эозином часто не видны.
Такой подход давал возможность увидеть и идентифицировать зрелые нейрогенные элементы среды лимфоидных клеток, которые при обычных окрасках сливаются с фоном, и позволял более точно определить степень дифференцировки опухоли.
Интересно заметить, что структурная характеристика окрашенного продукта в ганглиоз-ных клетках, своего рода слоистость с чередованием полосок с разной интенсивностью окраски, вызывала сходство с окраской «тигроидного» вещества по Нислю.
Является ли это формальное сходство отражением метаболизма зрелых нервных клеток, определяющих «тигроидность», сказать трудно, и предметом дальнейшего исследования может быть изучение связи гранулярного эндоплазмати-ческого ретикулума и синтеза белка СЯЛБР 1.
Таким образом, при изучении экспрессии белка СЯЛБР 1 в двух группах нейробластом отмечено, что степень и интенсивность экспрессии этого белка отличается в опухолях разной степени зрелости: в недифференцированных опухолях уровень экспрессии был ниже по сравнению с более дифференцированными опухолями. При сравнении этих групп была обнаружена корреляция между уровнем экспрессии белка СЯЛБР 1 и степенью клеточной дифференцировки.
ч.
4 » • •
Рис. Окраска гематоксилин-эозином (*100) и экспрессия белка СЯДВР 1 (*400) в нейробластомах разной степени дифференцировки:
A, Б) недифференцированная нейробластома;
B, Г) низкодифференцированная нейробластома; Д, Е) ганглионеврома.
Изучение экспрессии белка СЕАБР 1 в недифференцированных нейробластомах с генетическими нарушениями Недифференцированные и низкодиффе-ренцированные нейробластомы (т.е. незрелые формы) в ряде случаев характеризуются различными генетическими нарушениями, такими как амплификация гена Ы-тус, делеция локуса 1р36 на коротком плече хромосомы 1 и делеция длинного плеча хромосомы 11. На нашем материале из 25 недифференцированных нейробластом в 13 мы обнаружили различные генетические аберрации
методом FISH (11 - с амплификацией гена N-myc, 2 - с делецией локуса 1р36, 4 - с делецией длинного плеча хромосомы 11), у двух пациентов эти нарушения перекрывались.
Представлялось чрезвычайно интересным сравнить экспрессию белка CRABP 1 в двух группах нейробластом: 1) без генетических нарушений и 2) имеющих хромосомные нарушения разного типа (в связи с небольшой выборкой пациентов с генетическими аберрациями было решено не делить их на подгруппы в зависимости от вида хромосомной аберрации, а рассматривать как одну).
При сравнении экспрессии СЯЛБР 1 в двух группах недифференцированных нейробластом было отмечено снижение уровня экспрессии белка в опухолях с генетическими аберрациями как в количественном (окраска менее 50 % клеток в образце опухоли), так и в качественном отношении - уменьшение интенсивности окраски.
Уровень экспрессии СЯЛБР 1 в недифференцированных нейробластомах имеет обратную корреляцию с наличием генетических нарушений, т.е., при прочих равных условиях в опухолях с генетическими нарушениями в количественном отношении экспрессия ниже, чем в опухолях той же самой степени дифференцировки без генетических нарушений.
Изменение экспрессии белка СКЛЕР 1
в процессе терапии нейробластомы
Представлял большой интерес вопрос, касающийся экспрессии белка СЯЛБР 1 в процессе терапии нейробластомы. На нашем материале мы располагали случаями параллельных биопсий, проведенных до и после лечения: 14 образцов от 7 пациентов.
Терапевтические мероприятия включали полихимиотерапию по программе низкого, среднего или высокого риска, у одного пациента наряду с ПХТ проводилась лучевая терапия. Естественно, лечение проводили больным, у которых были недифференцированные формы нейробла-стомы. Рассмотрим более подробно эти случаи.
Пациент 1.
До лечения имел нейробластому, представленную незрелыми клетками в ангиоматозной строме, с положительной экспрессией продукта гена СКЛЕР 1 в 30-40 % клеток.
После лечения в опухолевой ткани обнаруживались выраженные вторичные дистрофические процессы: очаги некроза, отложения солей кальция, гиалиноз стромы, апоптотические тельца. Большая часть клеточных элементов претерпела незначительно выраженное созревание. Наблюдались небольшие очаги ганглионей-робластомы. Экспрессия СКЛЕР 1 была повышена независимо от вторичных дистрофических изменений, т.е. в этом случае появление и накопление продукта гена СКЛЕР 1 протекало параллельно с выраженными дистрофическими процессами, сопровождающими химиотерапию.
Пациент 2.
Первичная опухоль до лечения состояла из продолговатых клеток в ангиоматозной, частично фиброзированной строме. Продукт белка СКЛЕР 1 отсутствовал в цитоплазме опухолевых клеток.
В препаратах после терапии количество незрелых элементов было значительно уменьшено и четко видно созревание опухоли с переходом в ганглионейробластому. Продукт гена СКЛЕР 1 в 100 % определялся в зрелых элементах и, кроме того, в значительной части незрелых нейробла-стов. Причем прослеживалась определенная ди-
намика нарастания интенсивности сигнала и количества продукта по мере увеличения площади цитоплазмы опухолевых клеток.
Пациент 3.
До лечения в опухоли экспрессия белка СКЛЕР 1 не определялась.
После лечения опухоль представляла собой низкодифференцированную нейробластому с переходом в ганглионейробластому с большим количеством фибриллярного материала. При ИГХ-реакции наблюдалось легкое мембранное окрашивание, тогда как в крупных клетках ганглионей-робластомы реакция была положительной.
Пациент 4.
В образце опухоли до лечения трудно было провести грань между недифференцированными нейробластами и лимфоцитами, которые густо инфильтрировали опухолевую ткань из-за чрезвычайной схожести обеих клеточных популяций. Продукт белка СКЛЕР 1 отсутствовал в цитоплазме опухолевых клеток.
После лечения исследование проводилось на метастазе нейробластомы в легкое. Опухоль имела более зрелое строение: опухолевые клетки крупнее, с более широкой цитоплазмой; наблюдалось большое количество многоядерных гигантов с пузырьковидными ядрами и эозинофильным ядрышком. Фибриллярного межклеточного материала было мало. Выявлялись формирующиеся розетки. На препаратах ИГХ исследования экспрессия белка СКЛЕР 1 наблюдалась в крупных многоядерных клетках, примерно в 10 %. В тех клетках, где количество ядер превышало 10-12, цитоплазма не содержала продукта реакции.
Пациент 5.
В образцах опухоли до лечения исследуемый белок отсутствовал в участках незрелых нейроб-ластов и определялся только в крупных клетках ганглионейробластомы, особенно в периферических участках цитоплазмы.
После лечения продукт гена СКЛЕР 1 определялся на уровне мембранной окраски в минимальном количестве. Причем интересно отметить, что вторичные, дистрофические процессы опухолевых клеток нигде не были найдены.
Пациент 6.
До лечения имел гетерогенное строение опухолевых узлов: опухоль была представлена незрелыми клетками с единичными участками, содержащими фибриллярный материал со множеством розеток. Продукт белка СКЛЕР 1 в этом случае определялся в цитоплазме опухолевых клеток в 10 %.
После лечения степень дифференцировки опухолевых клеток явно повысилась, хотя фибриллярный материал полностью отсутствовал. Появились гигантские многоядерные элементы с дистрофическими изменениями. Продукт ИГХ в целом отсутствовал, за исключением единичных клеток с эксцентрично расположенными ядрами. В этом случае формальные процессы увеличения дифференцировки не сопровождались накоплением продукта гена СКЛЕР 1.
Пациент 7.
Изначально (до лечения) была совершенно незрелая нейробластома с ангиоматозной стро-мой с выраженным «плазмацитоидным» характером клеток. При ИГХ исследовании продукт гена СКЛЕР 1 в опухолевых клетках не определялся.
После лечения выявлены участки двух типов (диморфный характер процесса): незрелые без признаков экспрессии белка и зрелые, формирующие участки ганглионейробластомы, в которых идет интенсивное накопление ИГХ продукта.
Обобщая полученные результаты, подчеркнем:
1. вторичные посттерапевтические дистрофические изменения в опухолевых клетках не влияют на экспрессию СЯЛБР 1;
2. в отдельных случаях происходило увеличение экспрессии белка СЯЛБР 1 в опухолях после лечения по сравнению с первоначальной биопсией. Таким образом, или проведенная химиотерапия помогала отбору клона, способного к дальнейшей дифференцировке, или в результате лечения происходило повышение уровня клеточной дифферен-цировки, и, как следствие, повышение экспрессии СЯЛБР 1.
Обсуждение полученных результатов
В настоящее время роль белка СЯЛБР 1 в канцерогенезе, прогрессии опухоли, опухолевой дифференцировке остается неясной. Исследования по этой теме, проведенные разными группами ученых, предоставили противоречивые данные об экспрессии белка СЯЛБР 1 и его участии в патогенезе злокачественных новообразований человека.
С одной стороны, ряд эпителиальных опухолей характеризуется пониженной экспрессией СЯЛБР 1. Например, при почечно-клеточном раке наблюдается выраженное снижение продукции мРНК белка СЯЛБР 1 в опухоли по сравнению с таковым в неизмененных тканях [7]. Активное снижение эспрессии СЯЛБР 1 наблюдается при папиллярной карциноме щитовидной железы, при этом белок рассматривают как потенциальный биомаркер опухолей данного гистологического типа [8]. Показано, что снижение экспрессии белка СЯАВР 1 можно использовать как прогностический маркер для серозной и светлоклеточной карциномы яичника.
При этих опухолях общая и безрецидивная выживаемость были значительно меньше в группе с низким уровнем экспрессии СЯАВР 1 по сравнению в группе женщин с такими же опухолями, в которых экспрессия сохранялась, вне зависимости от стадии болезни [5]. При плоскоклеточном раке пищевода отсутствие иммунореак-тивности к СЯАВР 1 ассоциировано со снижением дифференцировки клеток опухоли и отдаленным лимфогенным метастазированием [9].
С другой стороны, в ряде новообразований человека экспрессия СЯАВР 1 повышается и зачастую четко коррелирует со злокачественным фенотипом опухоли. Так, для эндометриоидного рака яичника характерно более чем 100-кратное повышение количества мРНК СЯАВР 1 [10]. В аденокарциномах эндометрия экспрессия СЯЛБР 1 ассоциирована с высоким уровнем инвазивно-сти, а также с низкой степенью дифференцировки опухолевых клеток. Также показано, что высокий уровень экспрессии СЯАВР 1 ассоциирован с низкой гистологической дифференцировкой и наличием регионарных и отдаленных метастазов при нейроэндокринных опухолях [3; 11].
Исследования, посвященные изучению экспрессии белка СЯАВР 1 при нейробластомах, актуальны, если:
во-первых, принять во внимание, что изменение экспрессии этого белка является прогностическим маркером в ряде опухолей;
во-вторых - данные об экспрессии белка СЯЛБР1 в нейробластомах на сегодняшний день в научной литературе отсутствуют;
в третьих - терапия ретиноевой кислотой представляет собой один из первых и, безусловно, ярких примеров успешной генонаправляемой дифференцировочной терапии.
В нашей работе мы продемонстрировали, что экспрессия белка СЯЛБР 1 зависит от уровня клеточной дифференцировки, т.е. в недифференцированных и низкодифференцированных ней-робластомах экспрессия этого белка ниже, чем в созревающих и зрелых опухолях, ганглионейро-бластомах и ганглионевромах. Подобная зависимость была отмечена и при карциномах яичника. В нормальной ткани яичников экспрессия СЯЛБР 1 была больше, чем в клетках карциномы, что, по-видимому, связано с дедифференцировкой клеток карциномы. Исходя из этого допущения, можно предположить, что нормальное функционирование белка СЯЛБР 1 поддерживает дифференци-ровку клеток яичника, а уменьшение его экспрессии может привести к сбою в дифференцировке, т.е. дедифференцировать опухолевые клетки. В результате чего наблюдались ранний рецидив и уменьшение общей выживаемости [5].
Мы показали также, что уровень экспрессии СЯЛБР 1 коррелирует с отсутствием генетических нарушений в опухолевых клетках (таких как амплификация гена М-шус, делеции локусов 1р36 и 1^23), т.е. в группе незрелых нейробла-стом с генетическими аберрациями экспрессия белка СЯЛБР 1 была снижена по сравнению с опухолями без хромосомных нарушений. Полученные данные не противоречат друг другу, т.к. нейробластомы с амплификацией гена М-шус являются, как правило, недифференцированными или низкодифференцированными опухолями с высоким митотическим индексом и классифицируются как неблагоприятная гистологическая группа [12]. Делеция 1р36 часто выявляется также в недифференцированных и бедных стромой ней-робластомах [13].
В последней части нашего исследования проведен сравнительный анализ экспрессии белка CRABP 1 до и после проведенной терапии. Уникальной чертой нейробластомы является способность к спонтанной дифференцировке. При проведении исследований in vitro доказано, что этот процесс способны индуцировать различные агенты: ретиновая кислота, так называемый фактор роста нервной ткани, некоторые цитостатики, папаверин [14]. Таким образом, в процессе химиотерапии зачастую происходит повышение дифференцировки опухолевых клеток, отсюда и усиление экспрессии белка CRABP 1 в опухоли после проведенного лечения. В подобных случаях
уровень экспрессии этого белка может служить дополнительным маркером для более точной оценки дифференцировки опухолевых клеток до и после лечения.
Заключение
Проведенное исследование является первой работой по изучению экспрессии белка CRABP 1 в нейробластомах, ее связи с уровнем дифференцировки опухоли и оценки эффекта проведенной терапии. Полученные результаты, безусловно, требуют дальнейшего углубления и расширения спектра изучаемых новообразований.
Список литературы
1. Acosta S., Lavarino C., Paris R., Garcia I., de Torres C., Rodriges E., Beleta H., Mora J. Comprehensive characterization of neuroblastoma cell line subtypes reveals bilineage potential similar to neural crest stem cells. // BMC Developmental Biology. - 2009. - Vol. 9, N 12. - P 1-14.
2. Collins C., Watt F. Dynamic regulation of retinoic acid-binding proteins in developing, adult and neoplastic skin reveals roles for beta-catenin and Notch signaling. // Dev. Biol. - 2008. - Vol. 324, N 1. - P 55-67.
3. Kainov Y, Favorskaya I, Delektorskaya V, Chemeris G, Komelkov A, Zhuravskaya A, Trukhanova L, Zueva E, Tavitian B, Dyakova N, Zborovskaya I, Tchevkina E. CRABP1 provides high malignancy of transformed mesenchymal cells and contributes to the pathogenesis of mesenchymal and neuroendocrine tumors. // Cell Cycle. 2014. - Vol 13, N 10. - P 1530-1539.
4. Е.М.Чевкина, И.А.Фаворская Белки CRABP - родственники или однофамильцы? // Успехи молекулярной онкологии. - 2015. - Т.2, № 2. - С. 6-16.
5. Miyake T, Ueda Y, Matsuzaki S, Miyatake T, Yoshino K, Fujita M, Nomura T, Enomoto T, Kimura T. CRABP1-reduced expression is associated with poorer prognosis in serous and clear cell ovarian adenocarcinoma. // J Cancer Res Clin Oncol. - 2011. - Vol. 137, N 4. - P 715-722.
6. Chile T., Corrкa-Giannella M.L., Fortes M.A., Bronstein M.D., Cunha-Neto M.B., Giannella-Neto D., Giorgi R.R. Expression of CRABP1, GRP, and RERG mRNA in clinically non-functioning and functioning pituitary adenomas. // J Endocrinol Invest. - 2011. - Vol. 34, N 8. - P 214-218.
7. Pfoertner S., Goelden U., Hansen W., Toepfer T, Geffers R, Ukena S.N., von Knobloch R, Hofmann R, Buer J, Schrader A.J. Cellular retinoic acid binding protein I: expression and functional influence in renal cell carcinoma // Tumour Biol. - 2005. - Vol. 26, N 6. - P 313-323.
8. Hawthorn L, Stein L, Varma R, Wiseman S, Loree T, Tan D. TIMP1 and SERPIN-A overexpression and TFF3 and CRABP1 underexpression as biomarkers for papillary thyroid carcinoma. // Head Neck. -2004. - Vol. 26, N 12. - P 1069-1083.
9. Tanaka K., Imoto I., Inoue J., Kozaki K., Tsuda H., Shimada Y., Aiko S., Yoshizumi Y., Iwai T., Kawano T., Inazawa J. Frequent methylation-associated silencing of a candidate tumor-suppressor, CRABP1, in esophageal squamous-cell carcinoma. // Oncogene. - 2007. - Vol. 26, N 44. - P 6456-6468.
10. Banz C., Ungethuem U., Kuban R.J., Diedrich K., Lengyel E., Hornung D. The molecular signature of endometriosis-associated endometrioid ovarian cancer differs significantly from endometriosis-independent endometrioid ovarian cancer. // Fertil Steril. - 2010. - Vol. 94, N 4. - P 1212-1217.
11. Делекторская В.В., Чемерис Г.Ю., Каинов Я. А., Козлов Н.А., Зборовская И.Б. Экспрессия белка, связывающего ретиноевую кислоту, и пролиферативная активность клеток в нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы. // Молекулярная медицина. - 2013. - №1. - С. 38-43.
12. Nakazawa A., Haga C., Ohira M., Okita H., Kamijo T., Nakagawara A. Correlation between the International neuroblastoma pathology classification and genomic signature in neuroblastoma. // Cancer Sci. -2015. - Vol. 106, N 6. - P 766-771.
13. Ambros I.M., Zellner A., Roald B., Amann B., Ladenstein R., Printz D., Gadner H., Ambros P.F. Tyrrole of ploidy, chromosome 1p, and Schwann cells in the maturation of neuroblastoma. // N Engl J Med. -1996. - Vol 334, N 23. - P 1505-1511.
14. Papac R.J. Spontaneous regression of cancer. // Cancer Treatment Reviews. - 1996. - Vol. 22. - P. 395423.
