CC BY
525
CV
CS
и ш U
Нейробластома: морфологическая структура, молекулярно - генетические особенности и прогностические факторы
А.М. Строганова, А. И. Карселадзе
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Анна Михайловна Строганова stroganova_am@mail.ru
Нейробластома — наиболее распространенная экстракраниальная опухоль у детей, происходит из развивающихся нейрональных клеток симпатической нервной системы (стволовых клеток нервного гребня) и имеет разнообразные биологические и клинические характеристики. Средний возраст дебюта заболевания — 18 мес. Нейробластому отличает ряд уникальных черт: способность к спонтанной регрессии у детей младше 12 мес даже с отдаленными метастазами, к дифференцировке (созревание в ганглионеврому) s> у детей после первого года жизни и к стремительному агрессивному развитию и бурному метастазированию. Существуют § 2 клинические классификации нейробластомы: Международная система стадирования нейробластом (International Neuroblas-toma Staging System), которая основывается на результатах оперативного вмешательства, и классификация предоперационного ж стадирования (International Neuroblastoma Risk Group Staging System). Одной из принципиально важных проблем для клинической картины нейробластомы является сложность прогнозирования. Наряду с параметрами клинического характера (возраст § пациента, распространение и локализация опухоли) многообещающими оказались некоторые гистологические, молекулярно-био-® химические (плоидность) и генетические (хромосомные аберрации, статус гена MYCN, делеция локусов 1р36 и 11q, увеличение яс длинного плеча хромосомы 17 и др.) характеристики опухолевых клеток. Амплификация гена MYCN наблюдается в 20—30 % s первичных нейробластом и является одним из главных показателей агрессивности заболевания, ранней устойчивости к химиотерапии ® и неблагоприятного прогноза. Существует 2 типа амплификации гена MYCN: экстрахромосомная (наличие двойных ацентричных ^ хромосом) и внутрихромосомная (гомогенно окрашенные регионы). При изучении двойных ацентричных хромосом был отмечен ^ интересный факт: они могут быть элиминированы (удалены) из ядра путем формирования микроядер. Амплификация онкогена ас MYCN часто сопровождается делецией локуса 1р36 и увеличением плеча 17q, реже — делецией 11q23, что является факторами Е5 неблагоприятного прогноза заболевания. В статье подробно рассматриваются специфические черты биологического поведения Ü нейробластомы, не свойственные другим опухолям; гистологическое строение; факторы, определяющие прогноз заболевания, в том _ числе статус гена MYCN; механизмы формирования амплификации и элиминации амплифицированных последовательностей >< из ядра.
ta Ключевые слова: нейробластома, история изучения, гистологическая структура, классификация, амплификация гена MYCN, гетерогенность амплификации, прогностические факторы, элиминация амплифицированных последовательностей, хромосомные аберрации
DOI: 10.17650/2313-805X-2016-3-1-32-43
Neuroblastoma: morphological pattern, molecular genetic features, and prognostic factors
A.M. Stroganova, A.I. Karseladze
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115478, Russia
Neuroblastoma, the most common extracranial tumor of childhood, arises from the developing neurons of the sympathetic nervous system (neural cress stem cells) and has various biological and clinical characteristics. The mean age at disease onset is 18 months. Neuroblastoma has a number of unique characteristics: a capacity for spontaneous regression in babies younger than 12 months even in the presence of distant metastases, for differentiation (maturation into ganglioneuroma) in infants after the first year of life, and for swift aggressive development and rapid metastasis. There are 2 clinical classifications of neuroblastoma: the International neuroblastoma staging system that is based on surgical results and the International Neuroblastoma Risk Group Staging System. One of the fundamentally important problems for the clinical picture of neuroblastoma is difficulties making its prognosis. Along with clinical parameters (a patient's age, tumor extent and site), some histological, molecular biochemical (ploidy) and genetic (chromosomal aberrations, MYCN gene status, deletion of the locus 1p36 and 11q, the longer arm of chromosome 17, etc.) characteristics of tumor cells are of considerable promise. MYCN gene amplification is observed in 20—30 % of primary neuroblastomas and it is one of the major indicators of disease aggressiveness, early chemotherapy resistance, and a poor prognosis. There are 2 types of MYCN gene amplification: extrachromosomal (double acentric chromosomes) and intra-chromosomal (homogenically painted regions). Examination of double acentric chromosomes revealed an interesting fact that it may be eliminated (removed) from the nucleus through the formation of micronuclei. MYCN oncogene amplification is accompanied frequently by 1p36 locus deletion and longer 17q arm and less frequently by 11q23 deletion; these are poor prognostic factors for the disease. The paper considers in detail the specific, unique characteristics of the biological behavior of neuroblastoma, which are untypical of other tumors; his-
tological structure; determinants of the prognosis of the disease, including MYCN gene status; and mechanisms for formation of the amplification and elimination of amplified sequences from the nucleus.
Key words: neuroblastoma, history of study, histological pattern, classification, MYCN gene amplification, amplification heterogeneity, prognostic factors, amplification of sequences, chromosomal aberrations
cv
CS
История изучения нейробластом
Нейробластома (более точный, но менее используемый термин «периферическая нейробластная опухоль») — наиболее распространенная экстракраниальная солидная опухоль детского возраста, происходит из развивающихся нейрональных клеток симпатической нервной системы (стволовых клеток нервного гребня).
Опухоль была впервые описана в 1864 г. немецким ученым Rudolf Ludwig Karl Virchow, который назвал ее «детской глиомой». В 1891 г. немецкий патолог Felix Marchand отметил, что опухоль развивается из симпатической нервной системы и надпочечников. Стадию IVS нейробластомы, которая характеризуется метаста-зированием в печень, но не в кости, описал William Pepper в 1901 г. Название «нейробластома» было пред -ложено James Homer Wright. Он в 1910 г. показал, что ряд опухолей забрюшинного пространства и заднего средостения имеет четкое морфологическое сходство с незрелой примитивной нервной тканью. J. Wright также документировал формирование в образцах костного мозга округлых структур из клеток, которые получили название псевдорозеток Homer-Wright.
В 1914 г. Karl Herxheimer применил серебряные красители, позволяющие визуализировать нейрональ-ные фибриллы под микроскопом.
В 1927 г. Н. Cushing и S. Wolbach заметили, что не все нейробластомы злокачественные, хотя многие из них широко метастазируют в печень, кожу, кости, костный мозг; другие исчезают вне зависимости от лечения. Авторы продемонстрировали, что в редких случаях опухоли становятся доброкачественными ганглио-невромами, которые могут исчезать сами по себе [1]. В 1966 г. в своей монографии Т. Everson и W. Cole добавили к этому, что трансформация злокачественной формы опухоли в доброкачественную было замечено у детей старше 6 мес [2].
Общая характеристика нейробластом
Наиболее часто нейробластомы диагностируют у детей, их доля составляет 7—10 % всех опухолей детского возраста, включая лейкозы. Средний возраст дебюта заболевания — 18 месяцев, при этом нейробла-стому у 50 % пациентов диагностируют в возрасте 2 лет и у 90 % — до 6 лет.
В целях доклинического выявления нейробласто-мы в ряде стран (в Японии и Канаде более 35 лет назад и позднее в европейских странах) был введен массовый скрининг. Полученные результаты вызвали разногласия, так как скрининг в возрасте от нескольких
недель до 6 месяцев привел к существенному увеличению количества диагностируемых нейробластом с благоприятным прогнозом, но не привел к уменьшению опухолей с агрессивной IV стадией и снижению общей смертности. Это указывает на то, что генетически и биологически «благоприятные» опухоли особенно в возрасте до 6 месяцев клинически не обнаруживаются, но способны к спонтанной регрессии позднее [3—6]. Было рекомендовано прекращение скрининга у детей младше 7 месяцев. Скрининг в возрасте 9—12 месяцев, проводимый в Японии и Австрии, возможно, выявляет генетически неблагоприятные и гетерогенные опухоли.
Большинство нейробластом возникают спорадически. Семейные (наследственные) случаи описывают редко. Однако в работе американских и итальянских исследователей показано, что причиной возникновения большинства случаев наследственных нейроблас-том служат активирующие мутации в тирозинкиназ-ном домене онкогена ALK (anaplastic lymphoma kinase). Соматические мутации, приводящие к активации этого онкогена, наблюдаются в 5—15 % нейробластом. Дети со спорадической или наследственной нейробла-стомой в сочетании с синдромом центральной гипо-вентиляции («проклятие Ундины») и/или болезнью Гиршпрунга обычно имеют мутации в области гена PHOX2B — гомеодомена фактора транскрипции, экс-прессирующегося в клетках, формирующих ганглии. Хотя большинство семейных случаев нейробластом ассоциированы с нарушением в генах ALK и PHOX2B, скорее всего, будут найдены дополнительные гены, отвечающие за развитие нейробластомы. Возможно, вероятность возникновения нейробластомы увеличена у пациентов с нейрофиброматозом I типа, ассоциированного с нарушениями в генах PHOX2B и NF1/2. Возникновение опухоли под воздействием условий окружающей среды неизвестно [5, 7—9].
Анатомическая локализация нейробластом достаточно разнообразна: 50 % в надпочечниках, в пара-и превертебральных симпатических ганглиях и параганглиях (5 % в цервикальных, 15 % в торакальных, 25 % в ретроперитонеальных и 5 % в тазовых). Нейробла-стома с локализацией первичного очага в надпочечнике статистически имеет более низкую безрецидивную выживаемость по сравнению с опухолями других локализаций [10].
Нейробластома принадлежит к группе эмбриональных опухолей, таких как гепатобластома, нефро-бластома, эмбриональная рабдомиосаркома. Все они характеризуются манифестацией в раннем возрасте,
и ш u
ж ш
и
CV
CS
и ш U
ж ш
и
имеют сходные цитоморфологические характеристики, свойственные эмбриональным опухолям. Эмбриональное происхождение нейробластомы установлено методом иммуногистохимии (ИГХ) с помощью таких белковых маркеров, как Phox2b и С-kit (маркеры стволовых клеток нервного гребня), Sox10 и AP2a (эмбриональные глиальные маркеры, которые экспрессируются в незрелых глиальных клетках нейробластных опухолей) [11].
Нейробластому отличает ряд специфических, уникальных черт ее биологического поведения, не свойственных другим злокачественным опухолям.
♦ Спонтанная регрессия опухоли (без цитотоксиче-ского лечения) у некоторых детей младше 12 месяцев [2, 5, 12, 13].
♦ Способность к дифференцировке (созревание в ганглионеврому) у детей после первого года жизни. Это удивительное свойство опухолевых клеток нейробластомы впервые описано Харви Кушин-гом в 1926 г. у пациента (1 год 8 месяцев) с низко-дифференцированной нейробластомой, у которого спустя 9 лет остаточная опухоль дифференцировалась в ганглионеврому [1]. Также в литературе есть сообщение о том, что вероятность созревания опухоли зависела от пола и была выше у девочек, чем у мальчиков [14]. Процесс созревания также зарегистрирован при исследовании культуры клеток, взятых из агрессивно растущей опухоли. В процессе культивирования клетки приобретали черты дифференцирующейся нервной ткани. Различные агенты способны индуцировать этот процесс in vitro (ретиноевая кислота (фактор роста нервной ткани), некоторые цитостатики, папаверин) [12].
♦ Способность к стремительному агрессивному развитию и бурному метастазированию. У 60 % пациентов опухоли метастазируют в костный мозг, кости, лимфатические узлы, печень и кожу. Уникальный пример распространенных метастазов с благоприятным прогнозом — это стадия нейробластомы IVS [15-17, 18].
Клинические стадии нейробластомы
По Международной системе стадирования нейробластом (International neuroblastoma staging system, INSS, 1986) различают 4 клинические стадии. Данная система основывается на результатах оперативного вмешательства.
Стадия I. Локализованная опухоль, находящаяся в области первоначального развития; новообразование полностью удалено с микроскопическими признаками его остатков или без них; макроскопически - подтвержденное отсутствие поражения лимфатических узлов по обе стороны позвоночника.
Стадия IIA. Односторонняя опухоль с удалением большей ее части; микроскопически - нет поражения лимфатических узлов с обеих сторон.
Стадия IIB. Односторонняя опухоль, удаленная полностью или большая ее часть; микроскопически — имеется поражение односторонних лимфатических узлов.
Стадия III. Опухоль распространяется на противоположную сторону с метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов или без него; односторонняя опухоль с метастазами в противолежащих лимфатических узлах; срединная опухоль с метастазами в лимфатических узлах с обеих сторон.
Стадия IV. Диссеминированная опухоль с метастазами в отдаленные лимфатические узлы, кости скелета, печень и поражением костного мозга.
Стадия IVS. Локализованная первичная опухоль I, IIA и IIB стадий, имеющая метастазы в печень, кожу и/или костный мозг.
В 2009 г. была введена новая клиническая классификация нейробластом (классификация предоперационного стадирования) — International Neuroblastoma Risk Group Staging System (INRGSS) [19].
Стадия L1. Локализованные опухоли, не затрагивающие жизненно важных структур, ограниченные в пределах одного отдела — шея, грудь, живот или таз.
Стадия L2. Локорегиональные опухоли с вовлечением 1 или нескольких радиографических факторов риска (по данным компьютерной томографии или магнитно-резонансной томографии): шея, шейно-груд-ной переход, грудная клетка, торакоабдоминальная область, брюшная полость/таз, распространение в спинномозговой канал, инфильтрация окружающих органов/структур.
Стадия М. Отдаленное метастазирование (исключая стадию MS).
Стадия MS. Метастатическая болезнь у пациентов младше 18 месяцев с метастазами в кожу, печень и/или костный мозг.
В классификации INRGSS, в отличие от INSS, локорегиональное поражение протекает 2 стадии вместо 3, так как возрастает важность биологических прогностических факторов, и отмечена хорошая общая выживаемость у пациентов с неметастатической нейро-бластомой. Система предоперационного стадирования INRGSS может быть использована в качестве самостоятельной и независимой классификации для определения группы риска и дальнейшей тактики лечения, однако она не предназначена для замены классификации INSS. Предполагается, что обе системы будут использоваться параллельно [19].
Гистологическое строение нейробластом
Микроструктура нейробластомы сложна и отражает процесс созревания опухоли. Существующие гистологические классификации морфологического строения нейробластом (INPC-Shimada, Joshi) основаны на степени дифференцировки опухоли: от недифференцированной мелкокруглоклеточной нейробласто-мы до высокодифференцированной ганглионевромы.
Клеточный состав нейробластомы:
1) нейробласты:
♦ мелкие клетки с круглыми ядрами, в которых хроматин распределен в виде мелких точек («соль и перец»), тонкий ободок эозинофильной цитоплазмы; хорошо видны границы между клетками,
♦ крупные клетки с ядрами в 1,5—2,0 раза больше типичных ядер нейробластов, с 1—4 видимыми ядрышками. Обычно встречаются в недифференцированных и низкодифференцированных нейро-бластомах (8—10 %). Ассоциированы с MYCN-ам-плификацией и плохим прогнозом;
2) ганглиозные клетки, имеющие крупные круглые ядра с видимыми ядрышками, широкую эозинофильную цитоплазму с тельцами Ниссля (базофильные гранулы, располагающиеся на эндоплазматической сети).
Строма, окружающая клетки нейробластомы, также отражает уровень дифференцировки:
1) шванновская строма — для идентификации методом ИГХ применяются антитела к S100 (позитивное окрашивание);
2) нейропиль — фибриллярные экстрацеллюляр-ные волокна;
3) плотный лимфоидный инфильтрат (присутствует нечасто).
В Международной гистологической классификации нейробластомы (INPC-Shimada system) выделяют 4 категории по степени клеточной дифференцировки [20]:
1) нейробластома (бедная шванновской стромой):
♦ недифференцированная, полностью состоящая из нейробластов. Отсутствуют зрелые ганглиозные клетки (часто требуется ИГХ-исследование для верификации диагноза). Характеризуется бедной шван-новской стромой (менее 50 % окружающей стромы или может отсутствовать) (рис. 1а);
♦ низкодифференцированная, преимущественно состоящая из нейробластов. Имеется менее 5 % созревающих или зрелых ганглиозных клеток; по крайней мере 1 фокус нейропиля. Характеризуется бедной шванновской стромой (менее 50 % окружающей стромы или может отсутствовать) (рис. 16);
♦ дифференцированная, преимущественно состоящая из нейробластов. Имеется более 5 % созревающих или зрелых ганглиозных клеток; по крайней мере 1 фокус нейропиля. Характеризуется бедной шванновской стромой (менее 50 % окружающей стромы или может отсутствовать);
2) нодулярная ганглионейробластома, преимущественно состоящая из созревающих или зрелых ган-глиозных клеток. Имеется по крайней мере 1 ограниченный участок (узел) остаточных нейробластов. Нодулярная ганглионейробластома и все последующие типы (ганглионейробластома и ганглионеврома) богаты шванновской стромой (50 % и более окружающей стромы);
3) ганглионейробластома, преимущественно состоящая из созревающих или зрелых ганглиозных кле-
ток. Имеется > 1 участка остаточных нейробластов, смешанных с ганглиозными клетками (изолированные участки нейробластов отсутствуют) (рис. 1в); 4) ганглионеврома:
♦ созревающая, полностью состоящая из созревающих или зрелых ганглиозных клеток. Отсутствуют остаточные нейробласты,
♦ зрелая, полностью состоящая из зрелых ганглиоз-ных клеток. Отсутствуют остаточные нейробласты (рис. 1г).
В типичных случаях опухоль состоит из мелких однородных круглых клеток с гиперхромным ядром, окруженным тонким ободком цитоплазмы. Для нейро-бластомы характерно формирование псевдорозеток Homer-Wright — своеобразных морфологических структур, образованных по периферии ядрами нейроблас-тов с расположенными по центру эозинофильными фибриллами. Опухоль часто содержит большие участки некроза. Интерстициальные кровоизлияния относительно часто встречаются в менее дифференцированных опухолях, диффузная инфильтрация лимфоцитами — в более дифференцированных. Наличие кальцифика-тов — характерный признак нейробластомы, их количество может увеличиваться в процессе ответа опухоли на терапию. Сообщается также, что присутствие видимых ядрышек в клетках нейробластомы является признаком амплификации гена MYCN. Предполагается, что это результат наличия большого количества транскриптов этого гена[21].
Для точной верификации диагноза практически всегда необходимо проведение ИГХ-исследования. Клеточные компоненты нейробластомы могут быть идентифицированы с помощью ряда белковых маркеров: S100, S100A6 (Calcyclin) (семейство кальцийсвязыва-ющих белков для идентификации глиального компонента), нейрофиламенты (NF), хромогранин, синап-тофизин, нейронспецифическая энолаза (NSE) [11].
Факторы, определяющие прогноз заболевания
Одной из принципиально важных проблем нейро-бластомы является сложность прогнозирования. Наряду с параметрами клинического характера (возраст пациента [22], распространение и локализация опухоли [7, 23]) многообещающими оказались гистологические (гистопатологическая классификация по системе Н. Shimada [20], количество клеток с митозом [24] и апоптозом), молекулярно-биохимические (плоид-ность [25, 26]) и генетические (хромосомные аберрации, статус гена MYCN, делеция локусов 1р36 и 11q, увеличение длинного плеча хромосомы 17 и др.) характеристики опухолевых клеток [17, 27—29].
К факторам благоприятного прогноза относят: возраст пациента младше 1 года, стадии I, II или IVS, отсутствие амплификации гена MYCN и сегментных хромосомных аберраций, полисомия (увеличение количества целой хромосомы).
CV
CS
и ш u
X ш
и
и Рис. 1. Гистологическое строение нейробластомы (окраска гематоксилин-эозином) (х 100): а — недифференцированная; б — низкодифференци-рованная; в — ганглионейробластома; г — зрелая ганглионеврома
Промежуточные прогностические факторы: возраст пациента старше 1 года, локализованная опухоль с поражением лимфатических узлов, у детей младше 1 года метастазы в кости и костный мозг, отсутствие амплификации гена MYCN и сегментных хромосомных аберраций.
Факторы неблагоприятного прогноза включают: возраст пациента старше 1 года, метастазы в кости и костный мозг, сегментные хромосомные аберрации, такие как делеции субтеломерной области (ёе11р36) [27], длинного плеча хромосомы 11(de111q), увеличение длинного плеча хромосомы 17(+17q), амплификация гена MYCN, морфологически недифференцированная опухоль, высокий митотический индекс (см. таблицу).
Таким образом, определенный геномный ДНК-профиль опухоли предсказывает клиническую картину течения заболевания. Хромосомные аберрации могут изменять биологическое поведение опухолей в неблагоприятную сторону. Однако наибольшее значение в установлении прогноза, выборе оптимального объема лечения, устойчивости к химиотерапии приобрело изучение состояния гена MYCN.
Характеристика и функции гена MYCN
MYCN — клеточный протоонкоген семейства транскрипционных факторов. Он кодирует один из ядерных белков, который участвует в создании транскрипционных регуляторных комплексов со специфическими ДНК-связывающими свойствами. Располагается ген MYCN на коротком плече хромосомы 2 в локусе 2р24. Известно, что белки семейства MYC играют централь -ную роль в контроле клеточного цикла, клеточной пролиферации. MYCN выполняет важную регулятор-ную функцию в процессе миграции стволовых клеток, модуляции апоптоза, плюропотентности и дифферен-цировки [9, 16, 30]. Онкоген MYCN также регулирует гены множественной лекарственной устойчивости — MRP1 и MDR1 [31]. Важно отметить, что MYCN контролирует белки, участвующие в биогенезе рибосом, тем самым влияя на синтез белка. В нормальных клетках уровень белка MYCN строго регулируется фосфатидилинозитол-3-киназой (PI3K), которая стабилизирует белок и регулирует его включение в клеточный цикл [9].
Прогностические факторы нейробластомы
Характеристика Прогностический фактор
благоприятный неблагоприятный
Возраст Младше 1 года Старше 1 года
Клиническая стадия I, II, 1У8 III, IV
Гистологическое строение Богатые шванновской стромой, дифференцированные Бедные шванновской стромой, богатые стромой и нодулярные
Хромосомные аберрации Отсутствует амплификация гена МУСЫ, делеция локу-са 1р36 и другие сегментные хромосомные аберрации Наличие амплификации гена MYCN, делеции локуса 1р36 и/или другие сегментные хромосомные аберрации
CV
CS
Амплификация гена МУСЫ. Особенности при нейробластоме
Амплификация ДНК — механизм, с помощью которого клетки злокачественной опухоли приобретают многочисленные копии части своего генома, что приводит к гиперэкспрессии клеточных онкогенов, посредством которой опухолевая клетка получает преимущество в росте и устойчивость к химиотерапии. Ген МУСЫ является первым онкогеном в солидных опухолях, для которого была обнаружена амплификация (более чем 4-кратное увеличение количества этого гена по сравнению с референсным участком, локализующимся на этой же хромосоме, чаще всего это центромерная область). Уровень амплификации этого гена при нейробластоме находится в диапазоне от 4-до 500-кратного увеличения, чаще от 50- до 100-кратного. Туморогенный потенциал МУСЫ связан именно с процессом амплификации, так как функциональные мутации в его пределах не обнаружены [16].
Амплификация МУСЫ наблюдается в 20—30 % первичных нейробластом [16, 27, 32] и является одним из главных показателей агрессивности заболевания, ранней устойчивости к химиотерапии и неблагоприятного прогноза. Амплификация этого гена — мощнейшая «движущая сила» для увеличения митотической активности и предотвращения созревания опухоли. Нейробластомы с амплификацией МУСЫ являются, как правило, недифференцированными или низко-дифференцированными опухолями с высоким мито-тическим индексом и классифицируются как неблагоприятная гистологическая группа [28]. Корреляция между амплификацией гена МУСЫ и неблагоприятным исходом подтверждена в ходе многочисленных исследований, однако аналогичная ассоциация между экспрессией МУСК и исходом остается спорной.
В ряде доклинических исследований показано, что низкие уровни МУС-белков увеличивают пролиферацию, а высокие нужны для индукции апоптоза. Если это верно для нейробластомы, то предполагается, что амплификация гена МУСЫ служит в первую очередь для нарушения регуляции функции белка МУСК во время клеточного цикла, а не просто для увеличения его экспрессии. Эта гипотеза согласуется с утвержде-
нием, что именно амплификация, а не гиперэкспрессия, является показателем агрессивности заболевания [9]. При анализе нейробластом без амплификации гена MYCN было показано, что все пациенты с опухолями, в которых зафиксирован высокий уровень экспрессии MYCN, имели благоприятный исход болезни, без рецидивов и метастазов [6]. Также показано, что клетки с гиперэкспрессией MYCN сохраняют способность к дифференцировке [33]. Механизмы, посредством которых амплификация гена MYCN приводит к развитию агрессивной и резистентной опухоли, остаются неясными.
Размер ампликонов гена MYCN при нейробластоме может варьировать от 350 kb до 8 Mb, при этом наблюдается высокая вариабельность количества ко-амплифицированных генов. Часто коамплифицируется ген DDXI (локус 2р24), принадлежащий к семейству генов, кодирующих белки DEAD-бокса (Asp—Glu— Ala—Asp), вовлеченные в ряд клеточных процессов, таких как посттранскрипционная и трансляционная регуляция генов. Кроме того, опубликованы данные, касающиеся экспрессии гена ID2 (ингибитор ДНК-связывания/дифференцировки), расположенного в ло-кусе 2р25.1.
Ген NAG (NBAS, neuroblastoma amplified gene), также локализованный в локусе 2р24.3, коамплифицируется в 20—56 % нейробластом. Следует отметить, что случаи амплификации данного гена зафиксированы только в опухолях с амплификацией MYCN, и никогда в отсутствие последней. Продукт этого гена входит в состав комплекса, обеспечивающего белковый транспорт в системе эндоплазматического ретикулума аппарата Гольджи [34]. Наконец, коамплификация гена ALK происходит редко и наблюдается только в случаях с плохим исходом [35].
Группа японских ученых [36] исследовала активность фермента теломеразы в 100 образцах нейробластомы. Теломеры — специальные структуры на концах хромосом, которые вовлечены в процесс репликации и играют важную роль в обеспечении генетической стабильности. Регуляция длины теломер контролируется ферментом теломеразой. В опухолевых и стволовых клетках наблюдают высокую экспрессию теломе-
и ш u
X ш
и
CV
CS
и ш U
X ш
и
разы, в результате чего длина теломерных участков хромосом этих клеток увеличивается или сохраняется на постоянном уровне, позволяя им делиться неограниченно долго. Все нейробластомы с амплификацией гена MYCN демонстрируют высокую теломеразную активность (это ассоциировано с плохим прогнозом и высокой генетической нестабильностью). Однако большинство нейробластом стадии IVS имели низкую теломеразную активность или короткие теломеры [5, 36, 37]. Таким образом, длина теломер является весьма важным прогностическим параметром клинической значимости у больных с диагнозом нейробластомы [38].
Примечательно, что и при отсутствии амплификации гена MYCN клетки нейробластомы могут содержать от 1 до 4 лишних копий этого гена относительно количества центромер хромосомы 2. Опухолевые клетки могут получить небольшое количество дополнительных копий гена посредством следующих механизмов:
♦ увеличение количества копий только короткого плеча хромосомы 2 или изохромосомы 2р (рис. 2) [39];
♦ дупликация гена MYCN in situ в локусе 2р24 (показано на 2 клеточных линиях);
♦ несбалансированная транслокация дистального конца короткого плеча хромосомы 2 (и, следовательно, MYCN и соседних генов) на другие хромосомы (ранее продемонстрировано на 5 клеточных линиях без амплификации гена MYCN и на некоторых первичных опухолях) [32].
Эти данные свидетельствуют о том, что присутствие дополнительных копий гена MYCN в неамплифи-цированной нейробластоме позволяет выявить клетки с комбинированными (сегментными и количествен-
Рис. 2. Увеличение количества копий короткого плеча хромосомы 2 (FISH-реакция с флуоресцентным зондом LSI MYCN (2p24) Spectrum Green/CEP 2 (2p11.1-q11.1 Spectrum Orange) Dual ColorProbe, Abbott-Molecular, x 1000). Сигналы зеленого цвета — ген MYCN, красного — центромер хромосомы 2
ными) генетическими нарушениями, которые впоследствии помогают понять поведение этих опухолей [16].
Следует отметить, что в опухолях, которые имели амплификацию гена MYCN, наблюдали широкую внутриклеточную вариабельность в количестве копий этого гена [30].
Методы определения статуса гена MYCN
Надежное и своевременное определение амплификации гена MYCN — это ключевая точка в лечении нейробластом. На практике амплификация этого гена устанавливается разными способами.
До июля 1993 г. количество копий гена MYCN определяли с помощью Саузерн-блот-гибридизации. Однако с июля 1993 г. приобрел популярность и стал широко использоваться метод флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) для определения наличия амплификации гена MYCN [15, 40].
При сравнении этих 2 методов было показано, что при Саузерн-блот-анализе наряду с опухолевыми клетками нормальные клетки были также включены в исследование, тогда как при FISH-анализе каждое опухолевое ядро идентифицировалось отдельно [15, 16, 30]. Саузерн-блот-гибридизация без стандартизации сигнала для одной копии хромосомы 2 может привести к явной демонстрации амплификации гена MYCN вследствие анеуплоидии хромосомы 2 [30], тогда как для интерфазной FISH-реакции эта проблема была решена путем одновременной гибридизации со специфической а-сателлитной пробой, что позволяет прямо пересчитывать количество хромосомы 2 по отношению к количеству генов MYCN. Важно отметить, что количество копий одной хромосомы в клетках опухоли не обязательно отражает плоидность опухоли [3].
Таким образом, в настоящее время метод FISH является основным для оценки статуса гена MYCN («золотым стандартом» для характеристики нейробластомы). К преимуществам FISH следует отнести скорость и техническую простоту данного метода, а также возможность определять гетерогенность амплификации гена MYCN между отдельными нейробластами в пределах одной опухоли [39] как в интерфазных, так и метафазных ядрах. Одновременный анализ метафаз-ных хромосом — важное дополнение к интерфазным исследованиям, так как позволяет получить ценную информацию о типе амплификации гена MYCN:: экстрахромосомная (наличие двойных ацентричных хромосом, double minute — dmin) (рис. 3а), реже — внутрихромо-сомная (гомогенно окрашенные регионы, homogeneous stain region — HSR) (рис. 3б) или анеуплоидия хромосомы 2 (рис. 3в) [15, 16, 30].
Если речь идет о клинических образцах нейробластом, то метод интерфазной FISH позволяет быстро и надежно определить наличие амплификации гена MYCN даже в образцах, содержащих малое количество опухолевых клеток. Для младенцев и детей младшего
возраста с подозрениями на нейробластому способность оценивать амплификацию гена в небольших образцах ткани, в том числе при тонкоигольной пункции опухоли или костного мозга, может служить альтернативой более инвазивным диагностическим хирургическим процедурам.
К недостаткам FISH следует отнести дороговизну, трудоемкость данного метода и сложности реализации мультиплексного анализа [17].
Гетерогенность амплификации гена MYCN
В некоторых случаях нейробластом описана вну-триопухолевая гетерогенность копий MYCN. Она наблюдается как в локализованных, так и в диссемини-рованных опухолях. Различают 3 типа гетерогенности [39]:
♦ гетерогенность по клеткам — кластеры амплифи-цированных клеток, окруженные опухолевыми клетками без амплификации гена, и/или в опухоли встречаются единичные клетки с амплификацией гена MYCN. Такой тип гетерогенности чаще наблюдается в нейробластомах III и IV стадий и метастатических опухолях;
♦ гетерогенность наблюдается в первичном очаге и метастазе (амплификация гена MYCN в метастазе нейробластомы в костный мозг и отсутствие в первичной опухоли);
♦ гетерогенность по времени (появление амплификации гена MYCN в процессе течения болезни, часто после рецидива).
Клиническое значение гетерогенности амплификации гена MYCN практически не исследовано.
Механизм формирования амплификации
Несмотря на десятилетия интенсивных исследований, молекулярные механизмы амплификации гена остаются не полностью изученными. Тем не менее последние данные молекулярного анализа и цито-генетических исследований предлагают один часто используемый механизм формирования хромосомной нестабильности, который начинается с продукции ацентрических, циркулярных, экстрахромосомальных молекул ДНК, реплицирующихся автономно. Амплификация гена — результат неравномерной митотической сегрегации и аккумуляции этих элементов в определенных условиях. В большинстве случаев первоначально сформированные циркулярные ДНК очень малы и не могут быть визуализированы световым микроскопом, но они увеличиваются со временем и формируют гетерогенные по размеру двойные минихро-мосомы. Последние данные демонстрируют хронологию амплификации гена, в которой первоначальные экстра-хромосомальные элементы интегрируются и образуют внутрихромосомные регионы амплификации гена. Процесс амплификации коротко можно описать по следующей схеме: вырезание, циркуляция, внутренняя реорганизация, амплификация и (при формировании HSR) внутрихромосомная интеграция и даль-
Рис. 3. Типы амплификации гена MYCN и анеуплоидия хромосомы 2 (FISH-реакция с флуоресцентным зондом LSI MYCN (2p24) Spectrum Green/CEP 2 (2p11.1-q11.1) Spectrum Orange Dual ColorProbe, AbbottMolecular). Сигналы зеленого цвета — ген MYCN, красного — центромер хромосомы 2: а — в виде dmin (х 1000); б — в виде HSR (х 1000); в — анеуплоидия хромосомы 2 (х 1000)
CV
CS
и ш U
X ш
и
нейшая амплификация [41—43]. Тип амплификации в виде HSR является более стабильным, так как при делении дополнительные копии гена могут передаваться дочерним клеткам [40]. В некоторых случаях dmin или HSR могут формироваться без предшественников [41].
Встречающуюся гетерогенность количества копий гена MYCN от клетки к клетке можно объяснить неравномерным разделением двойных минихромосом между дочерними клетками в процессе митоза, в результате которого они могут быть объединены в микроядра или потеряны через какое-то время [30, 40].
Типы амплификации гена MYCN и их прогностическое значение при нейробластоме. Элиминация амплифицированных последовательностей
Удобной моделью для изучения разных типов амплификации (dmin и HSR) послужила клеточная линия HL-60, полученная из крови больного острым промиело-цитарным лейкозом. На ранних стадиях культивирования клеток линии HL-60 амплификация гена MYC наблюдалась в виде dmin, которые затем заменялись HSR на более поздних стадиях культивирования [41]. При сравнении опухолевых клеток с разными типами амплификации значительной разницы в этих субгруппах по интенсивности роста или устойчивости к химиотерапии не выявлено. Тем не менее показано, что в опухолевых клетках, имеющих амплификацию гена MYC в виде HSR, не наблюдался апоптоз после дифферен-цировки, и после отмены химиопрепарата клетки возвращались в недифференцированное состояние. В тех клетках, которые содержали dmin, наблюдали существенное уменьшение уровня экспрессии MYC. Это предполагает, что клетки с амплификацией в виде HSR не так восприимчивы к действию дифференцирующих
агентов, возможно, из-за развития дополнительных механизмов резистентности [40].
Что касается нейробластомы, проведено исследование наличия возможной корреляции между разными типами амплификации гена MYCN и основными факторами риска при нейробластоме (возраст, стадия, плоидность и гистологическое строение нейробластомы по классификации Н. Shimada). Никакой статистически значимой ассоциации между этими параметрами выявлено не было. Однако отмечено, что опухоли с амплификацией гена MYCN в виде dmin по сравнению с HSR преобладали у пациентов более старшего возраста с поздними стадиями нейробластомы и наличием метастазов [40]. Не выявлено также различий между безрецидивной и общей выживаемостью у пациентов с амплификацией гена MYCN в виде двойных минихромосом и HSR [44].
При исследовании in vitro dmin отмечен интересный факт: они могут быть элиминированы (удалены) из ядра [40, 45, 46]. Подобное явление наблюдали также in vivo в клетках нейробластомы. Удаленные последовательности ДНК выглядят как микроядра (мелкие ядерноподобные структуры). Микроядра возникают во время S-фазы путем почкования или после митоза при перестройке ядерной мембраны (рис. 4а, б). Они могут содержать не только амплифицированные онкогены, но также фрагменты ацентричных хромосом или целые поврежденные хромосомы. Размер микроядер может варьировать в пределах одной опухоли. Одно из возможных объяснений этого — разное количество содержащейся в них ДНК [47]. Возникает вопрос: зачем клетке удалять последовательности, которые она же ранее амплифицировала (накапливала)? Ведь при этом появляется явное противоречие между двумя событиями, так как амплификация генов при-
Рис. 4. Механизмы формирования микроядер при элиминации амплифицированных последовательностей из ядра: а —путем почкования ядерной мембраны (FISH-реакция с флуоресцентным зондом LSI MYCN Spectrum Orange DNA Probe, AbbottMolecular, x 1000); б — периферическая локализация dmin перед элиминацией их из ядра (FISH-реакция с флуоресцентным зондом LSI MYCN (2p24) Spectrum Green/CEP 2 (2p11.1-q11.1 Spectrum Orange, x 1000)
ТОМ 3 / УО1.. 3
ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ
41
дает клетке селективное преимущество, а спонтанная элиминация амплифицированных последовательностей может подавить опухолевый фенотип. Но в этом случае механизм экструзии рассматривается как самозащита клетки при избыточном количестве содержащихся в ней последовательностей. Существует строгая «архитектура» ядра, и в нем соблюдается определенное распределение последовательностей хромосом, поэтому не исключено, что если амплификация превышает ядерное пространство, то клетка должна удалить избыток генов путем экструзии. Потеря клеткой ампли-фицированных последовательностей коррелирует с потерей злокачественных свойств и клеточной диф-ференцировкой [31].
Хотя амплификация гена МУСЫ — признак неблагоприятного исхода болезни, иногда агрессивное течение заболевания наблюдается в отсутствии амплификации данного гена. Это значит, что существуют другие генетические пути, влияющие на развитие нейробластом с плохим прогнозом [44].
Хромосомные аберрации при нейробластоме
Амплификация онкогена МУСЫ часто сопровождается делецией 1р36 [3] и увеличением плеча 17д, реже — делецией 1Ц23 [27, 29].
Как было описано выше, делеция в коротком плече хромосомы 1 (1р36) — наиболее частая структурная хромосомная аберрация при нейробластоме (около 30 %) и встречается у пациентов с плохим прогнозом [3]. При изучении большой группы пациентов (п = 915) с нейробластомой была выявлена ассоциация между делецией локуса 1р36 (23 %) и наличием неблагоприятных прогностических факторов (возраст пациента старше 1 года, IV стадия заболевания, амплификация гена МУСЫ, неблагоприятная гистологическая категория по Н. БЫшаёа и диплоидность). У пациентов, которые имели делецию локуса 1р36, 3-летняя безрецидивная и общая выживаемость были ниже на 30 и 20 % соответственно по сравнению с пациентами, в опухоли которых не определялась потеря локуса 1р36 [44, 27]. Европейские исследователи придерживаются точки зрения, согласно которой необходимо проводить анализ статуса 1р в клетках нейробластомы для определения группы риска и своевременной более эффективной терапии пациентов.
В спонтанно дифференцирующихся и богатых стромой нейробластомах делецию 1р36 не выявляли. Эти наблюдения позволяют предположить, что гены, ассоциированные с дифференцировкой, находятся в этом регионе. Рядом европейских исследователей
показано, что благоприятные гистологические структуры, такие как наличие ганглиозных клеток и обилие шванновской стромы, коррелируют с благоприятными генетическими результатами. С другой стороны, ни одна из опухолей с делецией 1 р не показала спонтанного развития шванновской стромы [3].
Увеличение длинного плеча хромосомы 17 (+17д) — добавление 1—3 лишних копий — впервые описано около 30 лет назад. Изучению этой аберрации уделялось мало внимания, но с появлением новых молекулярных цитогенетических исследований обнаружено, что это нарушение встречается в половине всех первичных опухолей. Клиническое значение этой аберрации противоречиво. С одной стороны, немецкие ученые показали, что увеличение длинного плеча хромосомы 17 не оказывает существенного влияния на прогноз заболевания [48]. С другой стороны, исследователи отметили, что данная аберрация ассоциируется с более агрессивным течением болезни и неблагоприятным прогнозом [44, 49]. В первичных нейробластомах амплификация гена МУСЫ часто ассоциирована с увеличением длинного плеча хромосомы 17, и само по себе это является неблагоприятным прогностическим фактором, так как плечо 17д считается удобным местом для интеграции амплифицированных последовательностей гена МУСЫ [40].
Делеция длинного плеча хромосомы 11 с высокой частотой наблюдается у больных нейробластомой с не-амплифицированным геном МУСЫ в возрасте от 2,5 до 7 лет и ассоциирована с плохим прогнозом у пациентов с клиническими стадиями II или ГУБ [10, 29]. Существует также обратная корреляция между наличием в опухоли делеции 1Ц и амплификацией гена МУСЫ [16]. Американские исследователи выдвинули предложение считать потерю локуса 1Ц23 полезным прогностическим маркером в случаях, связанных с низким (I, II или стадии) или средним (благоприятная III стадия или младенцы с IV стадией без амплификации гена МУСЫ) риском течения нейробластомы [27, 29, 50].
Заключение
Совершенствование методологических подходов, дающее возможность точно определять генетические нарушения, ассоциированные с высоким риском опухоли, такой как нейробластома, приведет к правильному и своевременному лечению и четкому пониманию молекулярных событий, результатом которых является злокачественная трансформация и опухолевая прогрессия.
см
ев
и ш и
X ш
и
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
CV
CS
и ш U
X ш
и
1. Cushing H., Wolbach S.B. The transformat ion of a malignant paravertebral sympathi-coblastoma into a benign ganglioneuroma. Am J Pathol 1927;3(3):203-16.
2. Everson T.C., Cole W.H. Spontaneous regression of neuroblastoma: Spontaneous Regression of Cancer. Philadelphia, Pa: WB Saunders, 1966.
3. Ambros I.M., Zellner A., Roald B. et al. Tyrrole of ploidy, chromosome 1p, and Schwann cells in the maturation
of neuroblastoma. N Engl J Med 1996;334(23):1505-11.
4. Beckwith J.B., Perrin E.V. In situ neuroblastomas: a contribution to the natural history of neural crest tumors. Am J Pathol 1963;43(6):1089-104.
5. Brodeur G.M., Bagatell R. Mechanisms of neuroblastoma regression. Nat Rev Clin Oncol 2014;11(12):704-13.
6. Matsunaga T., Shirasawa H., Hishiki T. et al. Enhanced expression of N-myc messenger RNA in neuroblastomas found by mass screening. Clin Cancer Res 2000;6(8):3199-204.
7. Maris J.M. Recent Advances in neuroblastoma. N Engl J Med 2010;362(23):2202-11.
8. Mosse Y.P., Laudenslager M., Longo L. et al. Identification of ALK as the major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature 2008;455(7215):930-5.
9. Gustafson W.C., Weiss W.A. Myc proteins as therapeutic targets. Oncogene 2010;29(9):1249-59.
10. Cohn S.L., Pearson A.D., London W.B. et al. The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system:
an INRG task force report. J Clin Oncol 2009;27(2):289-97.
11. Acosta S., Lavarino C., Paris R. et al. Comprehensive characterization
of neuroblastoma cell line subtypes reveals bilineage potential similar to neural crest stem cells. BMC Dev Biol 2009;9:12.
12. Papac R.J. Spontaneous regression of cancer. Cancer Treat Rev 1996;22(6): 395-423.
13. Cole W.H., Everson T.C. Spontaneous regression of cancer: preliminary report. Ann Surg 1956;144(3):366-83.
14. Wilson L.M., Draper G.J. Neuroblastoma, its natural history and prognosis: a study of 487 cases.
Br Med J 1974;3(3):301-7.
15. Georg R.E., London W.B., Cohn S.L. et al. Hyperdiploidy plus nonamplified MYCN confers a favorable prognosis
in children 12 to 18 months old with disseminated neuroblastoma: a Pediatric Oncology Group study. J Clin Oncol 2005;23(27):6466-73.
16. Jeison M., Ash S., Halevy-Berko G. et al. 2p24 Gain region harboring MYCN gene compared with MYCN amplified and non
amplified neuroblastoma. Am J Pathol 2010;176(6):2616-25.
17. Villamon E., Piqueras M., Mackintosh C. et al. Comparison of different techniques
for the detection of genetic risk-identifying chromosomal gains and losses in neuroblastoma. Virchows Arch 2008;453:47-55.
18. Iehara T., Hiyama E., Tajiri T. et al.
Is the prognosis of stage 4s neuroblastoma in patients 12 months of age and older really excellent? Eur J Cancer 2012;48(11): 1707-12.
19. Monclair T., Brodeur G.M., Ambros P.F. et al. The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) staging system: An INRG Task Force Report. J Clin Oncol 2009;27(2):298-303.
20. Shimada H., Ambros I.M., Dehner L.P. et al. The International Neuroblastoma Pathology Classification (the Shimada system). Cancer 1999;86(2):364-72.
21. Suganuma R., Wang L.L., Sano H. et al. Peripheral neuroblastic tumors with genotype-phenotype discordance: a report from the Children's Oncology Group and the International Neuroblastoma Pathology Committee. Pediatr Blood Cancer 2013;60(3):363-70.
22. London W.B., Castleberry R.P., Matthay K.K. et al. Evidence for an age cutoff greater than 365 days for neuro-blastoma risk group stratification
in the Children's Oncology Group. J Clin Oncol 2005;23(27):6459-65.
23. El-Sayed M.I., Ali A.M., Sayed H.A.
et al. Treatment results and prognostic factors of pediatric neuroblastoma: a retrospective study. Int Arch Med 2010;3:37.
24. Teshiba R., Kawano S., Wang L.L. et al. Age-dependent prognostic effect by Mitosis-Karyorrhexis Insex in neuroblastoma: a report from the Children's Oncology Group. Pediatr Dev Pathol 2014;17(6):441-9.
25. Look A.T., Hayes F.A., Shuster J.J. et al. Clinical relevance of tumor cell ploidy and N-myc gene amplification in childhood neuroblastoma: a Pediatric Oncology Group study. J Clin Oncol 1991;9(4):581-91.
26. Ladenstein R., Ambros I.M., Potschger U. et al. Prognostic significance of DNA di-tetraploidy in neuroblastoma. Med Pediatr Oncol 2001;36(1):83-92.
27. Attiyeh E.F., London W.B., Mosse Y.P. et al. Chromosome 1p and 11q deletions and outcome in neuroblastoma. N Engl J Med 2005;353(21):2243-53.
28. Nakazawa A., Haga C., Ohira M. et al. Correlation between the International Neuroblastoma Pathology Classification and genomic signature in neuroblastoma. Cancer Sci 2015;106(6):766-71.
29. Cetinkaya C., Martinsson T., Sandgren J. et al. Age dependence of tumor genetics
in unfavorable neuroblastoma: arrayCGH
profiles of 34 consecutive cases, using a Swedish 25-year neuroblastoma cohort for validation. BMC Cancer 2013;13:231.
30. Shapiro D.N., Valentine M.B., Rowe S.T. et al. Detection of N-myc gene amplification by fluorescence in situ hybridization.
Am J Pathol 1993;142(5):1339-46.
31. Valent A., Benard J., Clausse B. et al. In vivo elimination of acentric double minutes containing amplified MYCN from neuroblastoma tumor cells through the formation of micronuclei. Am J Pathol 2001;158(5):1579-1584.
32. Valent A., Le Roux G., Barrois M. et al. MYCN gene overrepresentation detected
in primary neuroblastoma tumour cells without amplification. J Pathol 2002;198(4):495-501.
33. Fredlund E., Ringner M., Maris J.M., Pahlman S. High Myc pathway activity and low stage of neuronal differentiation associate with poor outcome in neuroblastoma. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105(37):14094-9.
34. Aoki T., Ichimura S., Itoh A. et al. Identification of the neuroblastoma-amplified gene product as a component of the syntaxin 18 complex implicated in Golgi-to-endoplasmic reticulum retrograde transport. Mol Biol Cell 2009;20:2639-49.
35. Stock C., Bozsaky E., Watzinger F. et al. Genes proximal and distal to MYCN
are highly expressed in human neuroblastoma as visualized by comparative expressed sequence hybridization. Am J Pathol 2008;172(1):203-14.
36. Hiyama E., Hiyama K., Yokoyama T. et al. Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes. Nat Med 1995;1(3):249-55.
37. Pezzolo A., Pistorio A., Gambini C. et al. Intratumoral diversity of telomere length
in individual neuroblastoma tumors. Oncotarget 2014;6(10):7493-503.
38. Ohali A., Avigad S., Ash S. et al. Telomere Length Is a Prognostic Factor in Neuroblas-toma. Cancer 2006;107(6):1391-9.
39. Theissen J., Boensch M., Spitz R. et al. Heterogeneity of the MYCN oncogene
in neuroblastoma. Clin Cancer Res 2009;15(6):2085-90.
40. Moreau L.A., McGrady P., London W.B. Does MYCN amplification manifested
as homogeneously staining regions at diagnosis predict a worse outcome in children with neuroblastoma? A children's oncology group study. Clin Cancer Res 2006;12(19):5693-7.
41. Wahl G.M. The Importance of Circular DNA in Mammalian gene amplification. Cancer Res 1989;49:1333-40.
42. Storlazzi C.T., Lonoce A., Guastadisegni M.C. et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure. Genome Res 2010;20(9):1198-206.
43. L'Abbate A., Macchia G., D'Addabbo P. et al. Genomic organization and evolution of double minutes/homogeneously staining regions with MYC amplification in human cancer. Nucleic Acid Res 2014;42(14):9131-45.
44. Yong M.H., Hwang W.S., Knight L.A. et al. Comparing hystopathological classification with MYCN, 1p36 and 17q status detected by fluorescence in situ hybridization from 14 untreated primary neuroblastomas in Singapore. Singapore Med J 2009;50(11):1090-4.
45. Ambros I.M., Rumpler S., Luegmayr A. et al. Neuroblastoma cells can actively
eliminate supernumerary MYCN gene copies by micronucleus formation — sign of tumor cell revertance? Eur J Cancer 1997;33(12):2043-9.
46. Shimizu N., Shimura T., Tanaka T. Selective elimination of acentric double minutes from cancer cells through
the extrusion of micronuclei. Mutat Res 2000;448(1):81—90.
47. Shimizu N., Itoh N., Utiyama H., Wahl G.M. Selective entrapment
of extrachromosomally amplified DNA by nuclear budding and micronucleation during S phase. J Cell Biol 1998;140(6):1307-20.
48. Spitz R., Hero B., Ernestus K., Berthold F. Gain of distal chromosome arm 17q is not associated with poor prognosis in neuroblastoma. Clin Cancer Res 2003;9:4835-40.
49. Tajiri T., Tanaka S., Shono K. et al. Quick quantitative analysis of gene dosages associated with prognosis in neuroblastoma. Cancer Lett 2001;166(1):89-94.
50. Spitz R., Hero B., Simon T.,
Berthold F. Loss in chromosome11q identifies tumors with increased risk for metastatic relapses in localized and 4S neuroblastoma. Clin Cancer Res 2006;12(11):3368-73.
cv
CS
и ш u
X ш
и
