Научная статья на тему 'Индукция синтетическими аналогами цАМФ нейраминидазной активности в нейральных клетках in vitro'

Индукция синтетическими аналогами цАМФ нейраминидазной активности в нейральных клетках in vitro Текст научной статьи по специальности «Фармакология»

96
32
Поделиться
Ключевые слова
НЕЙРАМИНИДАЗЫ / ГАНГЛИОЗИДЫ / НЕЙРАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

Аннотация научной статьи по биологии, автор научной работы — Прошин Сергей Николаевич, Бычков Евгений Рудольфович, Лебедев Андрей Андреевич, Косякова Галина П., Шабанов Петр Дмитриевич

Экспозиция нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека к дибутирил-цАМФ приводила как повышению частоты нейронов, которые образовывали отростки, так и повышению активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), более чем в 2 раза. Повышение активности САПМ также сопровождалось увеличением количества мРНК этого фермента. В нейральных клетках с высокой активностью САПМ и развитыми отростками также регистрировалось достоверное повышение активности маркера биохимической дифференцировки нейральных клеток ацетилхолинэстеразы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что повышение активности САПМ связано с дифференцировкой нейральных клеток и делается предположение о возможности использования этого фермента, как потенциальной мишени (маркера) для терапии заболеваний, связанных с повреждением клеток нейронального происхождения (нейронов).

Похожие темы научных работ по биологии , автор научной работы — Прошин Сергей Николаевич, Бычков Евгений Рудольфович, Лебедев Андрей Андреевич, Косякова Галина П., Шабанов Петр Дмитриевич,

Induction of Neuraminidase Activity in Neural Cells in Vitro by Synthetic Analogues of cAMP

The treatment of human neuroblastoma NB-1 cells by db-cAMP induced the high frequency of neural cells bearing neurite as well as more than two-fold elevated activity of sialidase associated with plasma membrane (SAPM). The elevated silaidase activity was accompanied by increasing the quantity of mRNA for that enzyme as was estimated by RT-PCR. The neural cells with elevated SAPM activity and developed neurite were shown to have high activity of another enzyme (acetylcholinesterase) that is strongly considered as a biochemical marker of neural cell differentiation. Due to our experimental work it has been reasoned that elevated activity of sialidase associated with plasma membrane is closely related to neural cell differentiation and can be considered as a key factor for therapy of disorders connected to damage of cells of neuronal orogon

Текст научной работы на тему «Индукция синтетическими аналогами цАМФ нейраминидазной активности в нейральных клетках in vitro»

2434

НЕЙРОФАРМАКОЛОГИЯ

_________________________ IN VITRO

ИНДУКЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКИМИ АНАЛОГАМИ ЦАМФ НЕЙРАМИНИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В НЕЙРАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ

СЕРГЕЙ Николаевич ПРОШИН

ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России, отдел клеточной и молекулярной патологии

акад. Лебедева ул., 4/2, Санкт-Петербург, 194044, Россия, (812) 541-85-65, e-mail: medicine@arcerm.spb.ru

ЕВГЕНИЙ Рудольфович БЫЧКОВ

Медицинский центр университета Вандербилта, отдел фармакологии Нашвил, TN 37232, США

АНДРЕЙ Андреевич ЛЕБЕДЕВ

НИИ экспериментальной медицины РАМН, отдел физиологии отдел им. И.П. Павлова, ст. научн. сотр., д-р биол. наук, професссор

акад. Павлова ул., 12, Санкт-Петербург, 197376, Россия, (812) 234-27-35, e-mail: aalebedev08@rambler.ru ГАЛИНА П. КОСЯКОВА

ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН

Московское шоссе 55А, Санкт-Петербург, Пушкин, 196601, Россия, (812) 451-76-63, e-mail: spbvniigen@mail.ru ПЕТР Дмитриевич ШАБАНОВ

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ; кафедра фармакологии, зав. кафедрой, д-р мед. наук, профессор

акад. Лебедева ул., 6; Санкт-Петербург, 194044, Россия, e-mail: pdshabanov@mail.ru

Резюме

Экспозиция нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека к дибутирил-цАМФ приводила как повышению частоты нейронов, которые образовывали отростки, так и повышению активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), более чем в 2 раза. Повышение активности САПМ также сопровождалось увеличением количества мРНК этого фермента. В нейральных клетках с высокой активностью САПМ и развитыми отростками также регистрировалось достоверное повышение активности маркера биохимической дифференцировки нейральных клеток — ацетилхолинэстеразы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что повышение активности САПМ связано с дифференцировкой нейральных клеток и делается предположение о возможности использования этого фермента, как потенциальной мишени (маркера) для терапии заболеваний, связанных с повреждением клеток нейронального происхождения (нейронов).

Прошин С.Н., Бычков Е.Р., Лебедев А.А., Косякова Г.П., Шабанов П.Д. Индукция синтетическими аналогами цАМФ нейраминидазной активности В нейральных клетках in vitro. // Психофармакол. биол. наркол. 2008. Т. 8, № 3-4. С. 2434-2442

Ключевые слова

нейраминидазы; ганглиозиды; нейральные клетки

© Коллектив авторов, 2008; лицензиат ООО «Архив»

ISSN 1606-8181

ВВЕДЕНИЕ

Содержание ганглиозидов в плазматической мембране находится под контролем не только сиа-лилтрансфераз, участвующих в синтезе этих гли-косфинголипидов, но и сиалидаз(нейраминидаз), отвечающих за их деградацию.

К настоящему времени у млекопитающих выявлено, по крайней мере, четыре типа сиалидаз, отличающихся между собой по клеточной компарт-ментализации и специфичности к субстрату [1—3]. Ранее на грызунах (мыши) было показано, что матричная РНК (мРНК) для сиалидазы, связанной (ассоциированной) с плазматической мембраной клетки (САПМ), выявляется в корковом веществе головного мозга, глубоком ядре мозжечка, в клетках гранулярного слоя и клетках Пуркинье, а также в гиппокампе [4]. Поскольку ганглиозиды обнаруживаются в избыточном количестве в нервной ткани, можно предположить, что активность сиалидазы, связанной с плазматической мембраной клетки (САПМ), имеет значение в формировании пластичности нейронов [13].

Как известно, способность различных отделов центральной нервной системы к реорганизации была бы невозможна без нейропластичности, которая характеризует способность нейронов изменять свои функции, химические характеристики и/ или структуру (морфологию). Контакт нейрональной клетки с факторами внешней среды осуществляется через плазматическую мембрану и САПМ, локализуясь в плазматической мембране, может являться непосредственным участником событий, происходящих при аксоногенезе. Образование ак-

сона нейрональной клеткой сопровождается асси-метричным перераспределением в плазматической мембране определенных молекул, т. е. поляризацией нейрона [5]. Считается, что активность САПМ приводит к изменению в плазматической мембране содержания высших ганглиозидов и накоплением ганглиозидов с одной молекулой сиа-ловой кислоты [6]. Ганглиозиды концентрируются в участках плазматической мембраны, получивших название «липидные микродомены», которые также насыщены сигнальными молекулами (киназами) [7]. Получены данные, указывающие, что изменяя количественный и, главным образом, качественный состав ганглиозидов в микродоменах, сиалидаза, связанная с плазматической мембраной, способна модулировать активность киназ и, следовательно, реакцию клетки на определенные стимулы [8]. Несмотря на многообразие внешних стимулов, которые воздействуют на клетку, многие из них реализуются через определенные ключевые факторы, к которым, без сомнения, относится цАМФ [9]. Низкий молекулярный вес цАМФ позволяет этой молекуле быстро диффундировать в клетке и регулировать многие внутриклеточные процессы. В частности, происходит активация сигнальных систем, сопряженных с протеинкиназой А, которая, в свою очередь, проникая в клеточное ядро, подвергает фосфорилиро-ванию цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (СНЕБ) [10]. САПМ в своей первичной структуре имеет сайт для фосфорилирования про-теинкиназой А, что предполагает регуляцию этой сиалидазы через цАМФ-сопряженные сигнальные системы [11, 12]. В связи с тем, что значение ак-

Таблица 1

Активность лизосомальной сиалидазы (ед./мг белка) в нейральных клетках линии КБ-1 при разных экспериментальных состояниях

Время (ч) Культуральная среда

полная истощенней

дб-цАМФ дб-цАМФ

- + - +

24 1,G11 ± G,193 G,897 ± G,2G6 G,896 ± G,177 G,9G5 ± G,G97

48 G,856 ± G,G87 1,1G1 ± G,156 1,114 ± G,215 G,931 ± G,121

Примечание: в исходной клеточной культуре (0 ч) активность лизосомальной сиалидазы составила 0,884 ± 0,139 ед./мг белка.

2435

2436

тивности сиалидазы, связанной с плазматическом мембраной, важно для понимания механизма формирования морфофункциональной пластичности нервной ткани мы предприняли наше исследование на клеточной линии ЫБ-1 человека нейрального происхождения при воздействии цАМФ.

МЕТОДИКА

В работе использовалась нейральная клеточная линия NB-1 человека (Health Science Research Resources Bank), которая выращивалась на средах РПМИ-1640 (45 %) и Игла (45 %) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в пластиковых чашках, покрытых поли-Ь-лизином (Falkone). Клетки высевались при средней плотности (1,5 х 106). Через 1 сут после начала культивирования, когда плотность роста нейральных клеток достигала 50 %, клетки инкубировались либо в полной среде (РПМИ-1640, среда Игла и ЭТС), либо в истощенной среде (в отсутствии ЭТС) в течение 24 и 48 ч. При этом в эксперименте в среду добавляли (однократно) дибутирил циклический АМФ (дб-цАМФ, Sigma) в конечной концентрации 2 мМ (рис 1). Через 24 и 48 ч на инвертированном фазово-контрастном микроскопе (DIAPHOT—TMD,

%

измерение активности мРНК

Рис. 1

60

50

40

30

20

10

A

50,8 ± 1,3 48,6 ± 2,9

IV

Рис. 2

Схема эксперимента с нейральной клеточной линией NB-1 нейробластомы человека

Морфологическая характеристика нейральных (нейральная клеточная линия NB-1 человека) клеток по длине отростков (примечание см. далее на С. 2437)

Nikon) регистрировали отростки нейральных клеток, измеряя длину отростка от тела клетки и до его окончания. Не менее чем 600 клеток было измерено в каждом случае. В зависимости от длины отростка все нейральные клетки были подразделены на три группы: до 9 мкм, 9—15 мкм, 16—32 мкм и более 32 мкм (нейральные клетки с короткими, средними и длинными отростками, соответственно) [14]. Для целей биохимического анализа оценки активности сиалидазы, связанной с плазматической мембраной (САПМ), лизосомальной сиалидазы (ЛС) и ацетил-холинэстеразы (АХЭ) клетки снимали с поверхности чашек чистым резиновым шпателем и гомогенизировали в охлажденном фосфатно-солевом буфере (ФСБ, рН 7,0), содержащем 0,5 мМ фенилметан-сульфонилфлюорид, леупептин (10 мкг/мл) и пеп-статин (10 мкг/мл). После центрифугирования при 1 т. об/мин в течение 10 мин при 4 °С часть клеточного гомогената была подвергнута для анализа на активность САПМ. При этом в качестве субстрата использовали смесь ганглиозидов (конечная конц.

0,5мг/мл, Sigma) в присутствии 0,1 % Тритон Х-100, После инкубации в течение 1 ч при 37 °С свободные сиаловые кислоты определяли с использованием тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и регистрировали продукт реакции (хромофор) при длине волны 549 нм (Victor2) [15]. Активность САПМ выражали в единицах на мг белка (ед./мг белка).

0

I

II

80

70

60

50

40

30

20

10

0

культивирование в течение 24 ч в истощенной среде дб-цАМФ дб-цАМФ

(-) (+)

% культивирование в течение 48 ч в истощенной среде

63,0 ± 2,1

59,9 ± 1,9

34,1 ± 1,5

................V ..........................

80

70

60

50

40

30

20

10

дб-цАМФ

(-)

дб-цАМФ

(+)

15,9 ± 2,3‘

..........V ................

С24

80 .-культивирование в течение 24 ч в полной среде

дб-цАМФ дб-цАМФ

(-) (+)

64,8 ± 2,6

70

60

50

40

30

20

10

0

53,3 ±1,9

15,6 ± 2,1

5,4 ± 1,5

39,4 ± 2,9

I II III IV I II III IV

% культивирование в течение 48 ч в полной среде %6^ 58,6 ± 2,9*

дб-цАМФ дб-цАМФ

(-) (+)

50

40

30

20

10

37,4 ± 2,7*

26,3 ± 1,1*** 21,2 ± 2,3*

___И

15,1 ± 1,5

2,4*

4,1 ± 1,6 I

ж_Л

и____И

28,5 ± 2,6

I II III IV i II III IV

В

24

В

48

С

48

0

Продолжение рис. 2

Морфологическая характеристика нейральных (нейральная клеточная линия NB-1 человека) клеток по длине отростков:

клетки с длиной отростков: I — <9 мкм; II — 9-15 мкм; III — 16-32 мкм; IV — >32 мкм. (А) — исходная культура нейральных клеток ЫВ-1 человека. (В24) и (В48) — культуры нейральных клеток, инкубировавшиеся в истощенной среде в течение 24 и 48 ч, соответственно; (С24) и (С48) — культуры нейральных клеток, инкубировавшиеся в полной среде в течение 24 и 48 ч, соответсвенно; дб-цАМФ добавлен (+) или отсутствует (-) в культуральной среде; *р < 0,05,

**р < 0,01, ***р < 0,001 и 1 р < 0,001

2437

Рис. 3

Образование отростков нейральными клетками NB-1 нейробластомы человека без добавления (А) и в присутствии (Б) дибутирил-цАМФ:

нейральные клетки I, II, III и IV классов обозначены тонкими, черными (толстыми), белыми (толстыми) и стрелкой-пирамидкой соответственно

Следующая часть клеточного гомогената использовали для определения активности ЛС. Использовали синтетический субстрат 4-метилумбеллиферил-Ы-ацетилнейраминовую кислоту — (4-МУНАНК) в конечной концентрации 2 мМ. Флуорометрическое измерение продукта реакции 4-умбеллиферона проводили при 450 нм [16]. Активность фермента выражали в единицах на мг белка. Активность ацетилхо-

линэстеразы (АХЭ) регистрировали по методу Элл-мана [17]. Концентрацию белка в клеточном гомоге-нате определяли по методу Брэдфорда [18].

Для ОТ-ПЦР из чашек полностью удаляли культуральную среду и далее выделяли РНК из клеток с использованием гуанидинтиоционата и фенол-хлороформа согласно протоколу, предложенному ранее [19]. Для получения комплементарной ДНК

ед./мг белка

12

10

8

6

4

2

0

(+)

* p < 0,05

Рис. 4

Активность сиалидазы, связанной с плазматической мембраной в нейральных клетках NB-1 нейробластомы человека при разных экспериментальных условиях: клетки инкубировались в полной (А) или истощенной (Б) среде в присутствии (+) или без добавления (-) дб-цАМФ

1254 п.н. 937 п.н.

Рис. Ö

•1

г~*7 j

и » » il SS8 S Pst I

i ni i IV .

Количество мРНК гена САПМ, полученное методом ОТ-ПЦР в нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека:

I — 93,5 фгр (контроль); II — 400,7 фгр (24 ч, полная среда, + дб-цАМФ); III — 384,7 фгр (48 ч, полная среда, + дб-цАМФ); IV — 387,8 фгр (24 ч, истощенная среда,

+ дб-АМФ); V — 368,2 фгр (48 ч, истощенная среда,

+ дб-цАМФ); количество кДНК на дорожку приводится в фемтограммах

(кДНК) образцы выравнивали, чтобы получить концентрацию из РНК в 11 мкл воды высокой степени очистки. При этом к каждой пробе добавляли 1 мкл олиго-Т-праймера. Образцы инкубировались при следующих температурных и временных параметрах амплификатора (Amplicon) до внесения обратной транскриптазы (Superscript II RT): 70°С в течение 10 мин, 3°С в течение 5 мин. Непосредственно перед повышением температуры до 42 °С в пробирки вносили по 7 мкл буфера для обратной транскриптазы, включавший также смесь нуклеотидов (10 мМ), 0,1 М дитиотрейтола и 1 мкл обратной транскриптазы. Далее инкубацию образцов проводили при 42 °С в течение 50 мин. По завершении инкубации образцов при 70°С в течение 15 мин в пробирки добавляли 0,2 мкл РНКазы Н (из расчета 60 U/мкл) и продолжали инкубацию при 37 °С в течение 20 мин. Реакцию останавливали, добавив 480 мкл воды. Условия полимеразной цепной реакции в течение 45 циклов: 94 °С — 1 мин, 60 °С — 1 мин, 72 °С — 2 мин. Прямой праймер: 5-GACAGAGGGATTACCTACCGGATC-3’, нуклеотиды 55—78 от стартового кодона; обратный праймер: 5’-GAGCCATGATTCTGACGGTGTT-3’, нуклеотиды 966—987. Образцы нормализовали по уровню экспрессии 0-актина [4].

Статистическую обработку данных проводили по t-критерию Стьюдента. Полученные результаты являются экспериментами, проводившимися не менее, чем в трех повторениях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Результаты показывают, что в нейральных клетках, которые инкубировались в полной среде (см. раздел «Материал и методы») уже к 1 сут можно было определить спонтанное образование отростков (в отсутствие дб-цАМФ), что регистрировалось по сравнению с исходной (0 ч) клеточной культурой (рис. 2, А) в повышении частоты нейральных клеток II класса, т. е. клеток, длина отростков которых составляла от 9—15 мкм (рис. 2, С24). В культуре клеток, которые выращивались в течение 24 ч в истощенной по ЭТС среде также можно было зарегистрировать спонтанное (дб-цАМФ ( — )) образование отростков (рис. 2, Б24). При этом ни в нейральных клетках, которые культивировались в истощенной среде, ни в нейральных клетках, которые инкубировались в полной среде, в отсутствие синтетического аналога цАМФ, частота клеток III класса не превышала 3 % (длина отростков 16—32 мкм), а клетки с длиной отростков более 32 мкм (IV класс) не были выявлены (рис. 3, А). Напротив, обработка культур дб-цАМФ уже через 1 сут позволяла зарегистрировать не только достоверное (р < 0,001) повышение частоты нейральных клеток III класса, но и выявлять клетки, длина отростков которых превышала 32 мкм (рис. 3, Б). Инкубирование нейральных клеток в течение 48 ч в полной среде в присутствии дб-цАМФ привело к еще

500

400

300

200

100

0

полная среда

истощенная среда

24 ч

СО

LO

+1

+1

о

+1

со

о”

со

+1

о

контроль (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+)

24 ч 48 ч 24 ч 48 ч

Рис. 6

Количество мРНК (% от контроля) гена сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, в нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека при разных экспериментальных условиях,

* р < 0,001

2439

2440

% полная среда истощенная среда

1SC г

(-) (+) (-) (+)

Рис. 7

Активность ацетилхолинэстеразы (в % от контроля) в нейральных клетках NB-1 нейробластомы человека, оцененная через 48 ч инкубации в присутствии (+) или без добавления (-) в среду дб-цАМФ

большему повышению частоты клеток, длина отростков которых превышала 32 мкм (рис. 2, С48). При этом, достоверное различие с клетками IV класса для

24 ч культуры (рис. 2, С24) также было выявлено (р < 0,001). Исследование нейральных клеток, культивируемых в течение 48 ч в истощенной среде, но с добавлением дб-цАМФ позволило выявить достоверные (по сравнению с культурой инкубировавшейся в течение 24 ч) различия по частоте клеток, длина отростков которых составляла менее 15, 16—32 и более 32 мкм при уровне значимости р < 0,001, р < 0,05 и р < 0,01, соответственно (рис. 2, Б48). В культуре нейральных клеток, которая инкубировалась в течение 48 ч в полной среде, но в отсутствие дб-цАМФ также можно было определить повышение частоты клеток III и IV классов (рис. 2, С48). Между культурами нейральных клеток, инкубировавшихся с добавлением или без добавления дб-цАМФ, были выявлены достоверные различия по частоте клеток, длина отростков которых превышала 32 мкм (класс IV, р < 0,001, отмечено цифрой 1). В культуре клеток, которые инкубировались в течение 48 ч в истощенной питательной среде и без добавления синтетического аналога цАМФ, по-прежнему, не определялись нейральные клетки IV класса (рис. 2, Б48).

Активность САПМ в исходной клеточной культуре (0 ч) составила 4,2 ± 1,6 ед./мг белка (рис. 4). Через сут в присутствии дб-цАМФ активность

САПМ в нейральных клетках, которые культивировались в полной среде, была зарегистрирована на уровне 8,4 ± 1,5 ед./мг белка. Тогда как в клетках, которые культивировались в истощенной среде активность САПМ повысилась более, чем 2 раза как по сравнению с исходной культурой (0 ч), так и по сравнению с активностью САПМ в клетках, культивировавшихся в отсутствии ЭТС и дб-цАМФ (рис. 4, Б). При этом были выявлены достоверные различия (р < 0,05). На 2-е сут эксперимента активность САПМ в нейральных клетках, культивировавшихся в полной среде, показала тенденцию к возрастанию (9,2 ± 2,0 ед./мг белка) и значимо (р < 0,05) отличалась от активности САПМ нейральных клеток парной культуры, которая не обрабатывалась дб-цАМФ (рис. 4, А). Напротив, активность САПМ в нейральных клетках, культивировавшихся в течение 48 ч в истощенной среде и обработанных дб-цАМФ, снизилась до 8,2 ед./мг белка (рис. 4, Б).

Исследование активности лизосомальной сиали-дазы (ЛС) в клетках ЫБ-1 (табл. 1) не выявило достоверных различий по данному показателю между контрольной клеточной культурой и в эксперименте — при обработке нейральных клеток дб-цАМФ.

Повышение в активности САПМ сопровождалось также повышением количества мРНК для этой сиа-лидазы (рис. 5). Все нейральные клетки, которые обрабатывались дб-цАМФ, продемонстрировали достоверное (р < 0,001) повышение количества мРНК (кДНК) по сравнению с контролем и клетка-

поляризованный нейрон неполяризованный нейрон

Рж. 8

Предполагаемый механизм индукции аксоногенеза нейронов в результате активации сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной

ми, не подвергшимися экспозиции к дб-цАМФ (рис. 6).

Следует отметить, что в культурах нейральных клеток, которые были обработаны дб-цАМФ и развивали длинные отростки, также регистрировалось достоверное повышение активности АХЭ (р < 0,001) не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с нейральными клетками, которые не обрабатывались дб-цАМФ (рис. 7). Поскольку АХЭ является маркером дифференцировки нейральных клеток, то можно сделать вывод, что повышение активности сиалидазы (нейраминида-зы), ассоциированной с плазматической мембраной, взаимосвязано с образованием отростков при дифференцировке нейральных клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Зарегистрированное нами выраженное образование отростков в нейральной клеточной линии ЫБ-1 человека и повышение активности САПМ согласуется с ранее полученными результатами на других ней-ральнах клеточных линиях. Так, выраженное образование отростков нейральными клетками Ыеиго2А нейробластомы мыши также сопровождалось повышением активности САПМ [4]. Образование отростков нейральными клетками нейробластомы мыши было вызвано 5-бром-дезоксиуридином (БДУ). При этом уже на 3 сут эксперимента более чем 44 % клеток, обработанных БДУ, образовывали отростки, тогда как в контроле этот показатель составил менее 31%. В нейральных клетках Ыеиго2А нейробластомы мыши, которые образовывали отростки, также было зарегистрировано достоверное повышение ацетилхо-линэстеразной активности. Циклический аденозин-монофосфат является фактором, который вызывает образование отростков не только в исследованной нами нейральной клеточной линии ЫБ-1 нейробластомы человека, но и в ряде других клетках нейрального происхождения. Клеточная линия NG108—15 при экспозиции к дб-цАМФ также реагирует образованием отростков [20]. Являясь вторичным месенджером, цАМФ вовлечен в разнообразные сигнальные каскады внутри клетки. Вместе с тем, принято считать, что именно сопряженный с протеинкиназой А (А-киназа) сигнальный каскад в клетке регулируется цАМФ [21]. К настоящему времени установлено, что и САПМ, и А-киназа в плазматической мембране клетки компар-тментализованы в липидных микродоменах [22—24]. Можно предположить, что при экспозиции нейральных клеток (и, в частности, клеток ЫБ-1 нейроблас-

томы человека) к цАМФ (дб-цАМФ) происходит активация А-киназы, которая функционально — через фосфорилирование, воздействует на САПМ, поскольку установлено, что в своей первичной структуре эта сиалидаза имеет участок, который потенциально может быть фосфорилирован А-киназой [11, 12]. САПМ, в свою очередь, активирует факторы, вовлеченные в образование отростков нейральными клетками. Возможно, что сиалидаза, ассоциированная с плазматической мембраной, изменяя в результате своей активности количественный и, главным образом, качественный состав ганглиозидов (ОМ1) в плазматической мембране, вызывает поляризацию нейронов и стимулирует аксоногенез (рис. 8). Таким образом, исходя из представленных данных, можно предположить, что САПМ является потенциальным фактором для регенерации аксонов нейронов. Действительно, при исследовании первичной культуры гиппокампа, выделенного из эмбрионов крыс, было установлено, что повышение активности САПМ имело решающий эффект как на аксоногенез, так и на восстановление перерезанных аксонов [14]. Нейроны гиппокампа, в которых регистрировалась высокая активность САПМ, также развивали более длинные аксоны, по сравнению с нейронами, в которых активность САПМ выявлялась на низком (базальном) уровне. При повреждении (перерезке) аксона только те нейроны гиппокампа восстанавливали аксоны, чья си-алидазная активность была высокой.

Таким образом, сиалидаза, ассоциированная с плазматической мембраной, является не только одним из факторов в механизме, направленном на формирование пластичности нейральной клетки (нейрона), но и потенциальной терапевтической (фармакологической) мишенью в лечении заболеваний, в основе которых лежит повреждение нейронов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Miyagi T., Wada T., Iwamatsu A. Molecular cloning and characterization of a plasma membrane-associated sialidase specific for gangliosides. // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 5004-5011.

2. Yamaguchi K., Hata K., Koseki K. Evidence for mitochondrial localization of a novel human sialidase (NEU4). // Biochem. J. 2005. Vol. 390, N 1. P. 85-93.

3. Proshin S. Sialidase activity and metastatic characteristics of tumor cell clones in vivo of rat rhabdomyosarcoma RA-23. // J. Glycobiol. 2007. Vol. 17, N 11. P. 1228.

4. Hasegawa T., Yamaguchi K., Wada T., et al. Molecular cloning of mouse ganglioside sialidase and its increased expression in Neuro2a cell differentiation. // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 8007-8015.

2441

2442

5. Da Silva J.S., Hasegawa T., Miyagi T. Asymmetric membrane ganglioside sialidase activity specifies axonal fate. // Nat. Neurosci. 2005. Vol. 8, N 5. P. 606-615.

6. Kato K., Shiga K., Yamaguchi K. Plasma-membrane-associated sialidase (NEU3) differentially regulates integrin-mediated cell proliferation through laminin- and fibronectin-derived signaling. // Biochem. J. 2006. Vol. 394, N 3. P. 647-656.

7. Wang Y., Yamaguchi K., Wada T., et al. A close association of the ganglioside-specific sialidase Neu3 with caveolin in membrane microdomains. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, N 29. P. 26252-26259.

8. Odintsova E., Butters T.D., Monti E. Gangliosides play an important role in the organization of CD82-enriched microdomains. // Biochem. J. 2006. Vol. 400, N 2. P. 315-325.

9. Mao L., Wang J.Q. Glutamate cascade to cAMP response-binding protein phosphorylation in cultured striatal neurons through calcium-coupled group I metabotropic glutamate receptors. // Mol. Pharmacol. 2002. Vol. 62, N 3. P. 473-484.

10. Kumar A.P., Bhaskaran S., Ganapathy M., et al. Akt/cAMP-responsive element binding protein/cyclin D1 network: a novel target for prostate cancer inhibition in transgenic adenocarcinoma of mouse prostate model mediated by nexrutine, a phellodendron amurensen bark extract. // Clin. Cancer Res. 2007. Vol. 13, N 9. P. 2784-2794.

11. Palestini P., Pitto M., Ferraretto A., et al. Change of ganglioside accessibility at the plasma membrane surface of cultured neurons, following protein kinase C activation. // Biochemistry. 1998. Vol. 37. P. 3143-3148.

12. Hata K., Sasaki A., Sawada M., et al. Overexpression of ganglioside sialidase in transgenic mice leads to noninsulin dependent diabetes mellitus. // Glycoconj. J. 2001. Vol. 18. P. 90-94.

13. Kopitz J., von Reitzenstein C., Muhl C., Cantz M. Role of plasma membrane ganglioside sialidase of human neuroblastoma cells in growth control and differentiation. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol. 199. P. 1188-1193.

14. Rodriguez J.A., Piddini E., Hasegawa T., et al. Plasma membrane ganglioside regulates axonal growth and regeneration in hippocampal neurons in culture. // J. Neurosci. 2001. Vol. 21, N 21. P. 8387-8395.

15. Warren L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234, N 8. P. 1971-1975.

16. Miyagi T., Tsuiki S. Rat-liver lysosomal sialidase. Solubilization, substrate specificity and comparison with the cytosolic sialidase. // Eur.J. Biochem. 1984. Vol. 141. P. 75-81.

17. Ellman G., Courtney K.D., Andres V., et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. // Biochem. Pharmacol. 1961. Vol. 7. P. 88-95.

18. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the

Correspondence to: Sergey N. Proshin

Nikiforov Russian Center for Emergency and Radiation Medicine,

Emercom of Russia, St. Petersburg, 194044, Russia e-mail: medicine@arcerm.spb.ru

quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

19. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction. // Anal. Biochem. 1987. Vol. 162. P. 156-159.

20. Kozireski-Chuback D., Wu G., Ledeen R.W. Up-regulation of nuclear GM1 accompanies axon-like, but not dendrite-like, outgrowth in NG108-15 cells. // J. Neurosci. Res. 1999. Vol. 55. P. 107-118.

21. Shelly M., Cancedda L., Heilshorn S., Sumbre G., Poo M.M. LKB1/STRAD promotes axon initiation during neuronal polarization. // Cell. 2007. Vol. 129, N 3. P. 565-577.

22. Kalka D., von Reitzenstein C., Kopitz J., Cantz M. The plasma membrane ganglioside silaidase cofractionates with markers of lipid rafts. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 283. P. 989-993.

23. Razani B., Rubin C.S., Lisanti M.P. Regulation of cAMP-mediated signal transduction via interaction of caveolins with the catalytic subunit of protein kinase A. // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 26353-26360.

24. Razani B., Lisanti M.P. Two distinct caveolin-1 domains mediate the functional interaction of caveolin-1 with protein kinase A. // Am.J. Physiol. Cell Physiol. 2001. Vol. 281. P. C1241-C1250.

Proshin SN, Bychkov ER, Lebedev AA, Kosyakova GP, Shabanov PD.

Induction of Neuraminidase Activity in Neural Cells in Vitro by Synthetic Analogues of cAMP

Citation: Psychopharmacol Biol Narcol. 2008; 8(3-4): 2434-2442

Nikiforov Russian Center for Emergency and Radiation Medicine, Emercom of Russia, St. Petersburg, 194044, Russia;

Department of Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA;

Military Medical Academy, St. Petersburg, 194044, Russia All-Russian Institute for Farm Animal Genetics and Breeding of RAAS, Pushkin, 196601, Russia

SUMMARY: The treatment of human neuroblastoma NB-1 cells by db-cAMP induced the high frequency of neural cells bearing neurite as well as more than two-fold elevated activity of sialidase associated with plasma membrane (SAPM). The elevated silaidase activity was accompanied by increasing the quantity of mRNA for that enzyme as was estimated by RT-PCR. The neural cells with elevated SAPM activity and developed neurite were shown to have high activity of another enzyme (acetylcholinesterase) that is strongly considered as a biochemical marker of neural cell differentiation. Due to our experimental work it has been reasoned that elevated activity of sialidase associated with plasma membrane is closely related to neural cell differentiation and can be considered as a key factor for therapy of disorders connected to damage of cells of neuronal orogon.

KEY WORDS: neuraminidase; gangliosides; neural cells

Epub 2009 Feb 15. Russian © PPBN

http://www.psychopharmacology.ru/index.php/PPBN/article/view/993

http://www.elibrary.ru