CC BY
40
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ АДАПТИВНОГО И ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОСТРОЙ ИШЕМИИ ПЕЧЕНИ
Литвинова Е.С., Конопля А.И., Быстрова Н.А., Харченко А.В., Конопля Н.А.
Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия
Введение. Для более широкого внедрения заместительной клеточной терапии в клиническую практику необходимы дальнейшие экспериментальные исследования, направленные на определение иммунометаболи-ческих эффектов различных вариантов регенеративной клеточной терапии (использование аллогенных гепато-цитов и их культуральной жидкости), а также сочетанное применение аллогенных гепатоцитов и фармакологических препаратов при патологии печени.
Цель и задачи. Установить эффективность коррекции иммунных нарушений в условиях острой ишемии печени путем использования аллогенных гепатоцитов (АГ) и их культуральной жидкости (КЖАГ).
Материалы и методы. Исследования проведены на 88 здоровых крысах-самцах Вистар массой 150-200 г. Острую ишемию печени (ОИП) вызывалась оперативным методом под внутрибрюшинным гексеналовым наркозом путем пережатия гепатодуоденальной в течение 10 минут. Выделение АГ от животных через 5-6 дней после рождения производилась по методике M.N. Berry, D.S. Friend. Полученный пул суспензии клеток от 3 крыс в концентрации 2 х 106/кг сразу же вводили внутрибрюшинно, десятикратно, через 24 часа, в объеме 0,5 мл в среде 199. С целью получения КЖАГ АГ культивировали в среде 199 (5 х 107 клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки, в течение 4 ч. После чего клетки осаждали центрифугированием, а КЖАГ десятикратно (с 24-часовым интервалом) внутрибрюшинно вводили реципиентам из расчета 5 мг/кг белка. АГ и КЖАГ готовили ежедневно и вводили сразу же после приготовления. Экспериментальных животных делили на 4 группы по 11-12 особей в каждой: 1-я группа (контрольная) — здоровые крысы; 2-я группа — ОИП; 3-я группа — ОИП и введение АГ; 4-я группа — ОИП и введение КЖАГ. Смертность экспериментальных животных во 2-4 группах в течение 5 дней после моделирования ОИП соответственно составила 34%, 21% и 17%. В циркулирующей крови определяли функционально-метаболическую активность нейтрофилов, в селезенке число иммунных антите-лообразующих клеток (АОК) на эритроциты барана. О выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на эритроциты барана судили по разнице масс (РМ) регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и по разнице количества в них кариоцитов (РК).
Результаты. В условиях ОИП у животных установлена супрессия формирования гуморального иммунного ответа (снижение количества иммунных АОК в селезенке) и ГЗТ (снижение разницы РМ и РК регионарных и контрлатеральных лимфатических узлов), снижение метаболической и фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови (снижение ФИ, ФЧ, НСТ-сп., НСТ-ст.). Введение АГ реципиентам с ОИП нормализует ФЧ нейтрофилов периферической крови и их кислород-зависимую активность по НСТ-ст., корригирует, но не до уровня контрольной группы животных, ФИ полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови и повышает более значительно, по сравнению с контролем,
формирование ГЗТ. Введение КЖАГ крысам с гипоксией печени нормализует формирование клеточной формы иммунного ответа и ФИ нейтрофилов периферической крови, частично нормализует развитие гуморального звена иммунитета, ФЧ и кислород-зависимую функциональную активность полиморфно-ядерных лейкоцитов.
Заключение. Для бескровных манипуляций на печени в клинической практике нередко используется пережатие печеночно-дуоденальной связки. Однако, возникающая при этом ишемия печени может быть причиной не только резких нарушений функции этого органа, но и оказывает отрицательное влияние на весь организм в целом, в первую очередь через возникающее иммунодефицитное состояние. Применение в этих условиях трансплантации гепатоцитов и их культуральной жидкости корригирует в экспериментальных условиях нарушения иммунитета. По-видимому, трансплантированные изолированные гепатоциты не только изменяют гуморальные и молекулярные механизмы, отвечающие за активацию функции поврежденных гепатоцитов реципиента и регенерацию, но и активируют функцию иммунокомпетентных клеток путем выработки гуморальных соединений.
КРАТКОСРОЧНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ С РЕЛЬЕФНЫМ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫМ ПОКРЫТИЕМ НА ТИТАНЕ
Литвинова Л.С.1, Юрова К.А.1, Шуплецова В.В.1, Мелащенко Е.С.1, Хазиахматова О.Г.1, Шаркеев Ю.П. 22 4, Хлусов И.А.1 22 3
1 Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград, Россия
2 Томский политехнический университет, Томск, Россия
3 Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия
4 Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск, Россия
Введение. Известно, что стандартная тест-система в двумерной (2D) стационарной культуре клеток на пластиковой поверхности культуральных планшетов не соответствует условиям реального функционирования клеточных систем, отличаясь многими параметрами, в том числе активацией рецепторов и внутриклеточных сигнальных путей, от естественного микроокружения клеток in vivo. Использование искусственных трехмерных (3D) матриц, способных биомиметически воспроизводить клеточное и тканевое микроокружение, позволяет формировать условия, приближенные к in vivo и проводить эскпериментальные работы на межфазной границе раздела живой и неживой материи.
Цель. Изучение влияния 3D-матриксов, имитирующих минеральное вещество регенерирующей костной ткани, на состояние мононуклеарных лейкоцитов (МНК) в краткосрочной культуре in vitro.
Материалы и методы. Материалом исследования служили МНК, выделенные из лейковзвеси здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографин (1,077 г/см3) (Pharmacia, Швеция) и культивировали (3 х 106 кл/лунку) в полной питательной среде в течение 48 часов при 37 °С, во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Состояние трехмерной (3D) культуры клеток имитировали при помощи добавления в клеточную культуру подложек (10 х 10 х 1 мм3) из коммерчески чистого титана, несущих рельефное кальций-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
фосфатное (КФ) покрытие. Физиологической модели репарации соответствовал индекс шероховатости (Ra) размером 2-3 мкм. Ra образцов для репаративной модели учитывал больший объем ремоделирования кости при ее травматических повреждениях и был равен 3-5 мкм. Контролем служила 2D-модель in vitro культивирования клеток на пластике (контроль). Иммунофенотипирова-ние клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием коктейля моноклональных антител, меченных флюоресцентными метками ViaBlue, FITC, PE, (eBioscience, USA) на проточном цитометре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия). Количественное определение IL-2 в супернатантах исследуемых культур клеток проводили методом проточной флюориметрии на автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, BioRad, США) с использованием коммерческих тест-систем (Bio-PlexProHuman cytokine Group I Assays, Bio-Rad, США). Исследование уровня транскрипции мРНК генов (hTERT, ki-67, IL-2) проводили методом ПЦР. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, а также протоколы амплификации описаны ранее. Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20.
Результаты и обсуждение. По истечении срока инкубации (48 ч) в физиологической и в репаративной моделях культивирования было выявлено статистически достоверное увеличение содержания CD4+CD71+ лимфоцитов и продукции IL-2 в сравнении с контрольной 2D-культурой (р < 0,05), при этом уровень относительной экспрессии мРНК гена IL-2 в обеих моделях культивирования был сопоставим с контрольными значениями. Транскрипция мРНК гена ki-67, свидетельствующая о пролиферативной активности клетки, повышалась (в 6 раз) только в репаративной 3D-модели культивирования in vitro. Анализ динамики теломеразной активности, обеспечивающей репликативную способность высокопро-лиферирующих МНК, не выявил статистически значимого изменения относительной экспрессии мРНК гена hTERT как в физиологической, так и в репаративной 3D-моделях культивирования по сравнению с контролем.
Заключение. 3D-матрикс, имитирующий регенерацию костной ткани, стимулирует пролиферативную активность МНК, предположительно за счет эпигеномного характера действия рельефа кальций-фосфатной поверхности. Установлено различие в механизмах пролиферации МНК в репаративной и физиологической моделях 3D-матрикса.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 16-15-10031).
ДОФАМИН КАК РЕГУЛЯТОР РАЗВИТИЯ ТИМУСА У ПЛОДОВ КРЫС
Лифанцева Н.В., Конеева Ц.О., Воронова С.Н., Мельникова В.И.
ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, Москва, Россия
Введение. В последнее время существенно изменились представления о моноаминах как исключительно о передатчиках сигнала между клетками нервной системы. Все больше данных подтверждает их способность выступать в качестве гуморальных регуляторов широкого профиля в различных органах и тканях. Иммунная система является одним из примеров проявления такого действия моноаминов. Известно, что дофамин синтезируется лимфоцитами и участвует в модуляции иммунных реакций посред-
ством ауто- и паракринных механизмов у половозрелых млекопитающих. Исследование роли дофамина в раннем развитии имеет особое значение, поскольку вмешательство в формирование различных структур плода приводит к долговременным необратимым изменениям в постна-тальном периоде онтогенеза. Ранее нами было показано, что дефицит катехоламинов на определенных стадиях пренатального развития приводит к необратимым мор-фогенетическим изменениям в функционировании Т-клеточного звена иммунитета как в препубертатном, так и в постпубертатном периодах жизни. Однако оставалось невыясненным, какой конкретно из катехоламинов ответственен за обнаруженные эффекты. У плодов, в отсутствии гемато-энцефалического барьера, дофамин может выделяться из мозга в систему общей циркуляции, и его концентрация в крови плодов значительно выше, чем уровень норадреналина и адреналина. Высокая концентрация дофамина в крови плодов, а также отсутствие нарушений в развитии иммунной системы у мышей с нокаутом гена дофамин-Р-гидроксилазы, необходимой для синтеза норадреналина и адреналина, позволили нам предположить, что именно дофамин является регулятором формирования тимуса у плодов крыс.
Цель и задачи. В данной работе исследовали экспрессию рецепторов к дофамину и их функциональную активность в эмбриональном тимусе, а также отдаленные последствия пренатального подавления синтеза катехо-ламинов в критический период формирования тимуса на дифференцировку субпопуляций Т-лимфоцитов в этом органе у половозрелых животных.
Материалы и методы. Возрастную динамику экспрессии рецепторов к дофамину в тимусе оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией у плодов, начиная с 16-го дня эмбрионального развития (Э16). Функциональную активность дофаминовых рецепторов на клетках тимуса оценивали in vitro на Э18 по способности дофамина влиять на пролифера-тивный ответ, индуцированный митогеном конканавали-ном А (Кон А, 2,5 мкг/мл). Для подавления синтеза ка-техоламинов у плодов беременным самкам крыс Вистар внутрибрюшинно вводили а-метил-п-тирозин (а-МПТ, 100 мг/кг массы). У родившегося потомства на 40-й день постнатального развития (П40) в тимусе проводили количественную оценку субпопуляций Т-лимфоцитов, путем окрашивания клеток антителами к поверхностным маркерам CD4, CD8 и CD25 (Cederlain, Канада) с последующим анализом на проточном цитофлуориметре Coulter EPICS XL-MCL (Beckman, США).
Результаты. Согласно полученным данным, в эмбриональном тимусе обнаружена экспрессия мРНК рецепторов к дофамину Д1, Д2, Д3 и Д5 типов. Возрастная динамика экспрессии рецепторов всех изученных типов различна. Тем не менее, следует отметить, что на Э17 уровень экспрессии мРНК относительно высокий для всех типов дофаминовых рецепторов. Добавление дофамина в культуру тимоцитов, выделенных из плодов на Э18, достоверно снижало ответ тимоцитов на митоген КонА для всех использованных концентраций (10-8-10-6 М). Полученные данные свидетельствуют о функциональной активности рецепторов к дофамину на тимоцитах и подтверждают возможность прямого влияния дофамина на развивающийся тимус. Анализ клеточного состава субпопуляций тимоцитов у взрослых крыс, которым фармакологически подавляли синтез катехоламинов на стадиях Э16-17 не выявил различий в динамике созревания
