CC BY
15
УДК 615.361.03:616.008.922.1-008.64J.015.4.076.9
II.В. Мельников
КОРРИГИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА МИЕЛОЛИЗАТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПОКСИЧЕСКОМ
СИНДРОМЕ
Нейродегенеративные заболевания спинного мозга, а также его травматическая болезнь относятся к важнейшим нерешённым проблемам современной медицины. Эти заболевания расцениваются как одни из самых прогностически неблагоприятных ввиду тяжести последствий, недостаточной эффективности существующих методов лечения и отсутствия этиотропных лекарственных средств |8,10].
Как известно, ведущими факторами в развитии нейродегенеративных миелопатий являются ишемия и гипоксия ¡5, 14]. Повреждение спинного мозга в остром и раннем восстановительном периодах также связано с ишемией и гипоксией, возникающих вследствие отёка и воспаления спинномозговой ткани [2]. В этой связи весьма актуален поиск новых лекарственных средств, вызывающих быструю непосредственную защиту нейронов и проводящих п>тей спинного мозга от гипоксии и способствующих предотвращению дегенеративных повреждений этих структур.
Нами разработан новый препарат -миелолизат, представляющий собой естественно сбалансированную смесь низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот, получаемую стандартизированным ферментативным гидролизом белков спин* номозговой ткани свиней [7]. Препарат имеет плотность 1,030±0,01 г/см3, содержит
7,0±1,0 мг/мл пептидов и 3,0±1,0 мг/мл аминного азота. Сухой остаток составляет 8+1,0 %, величина рН - 7,0±0,5. Содержание свободных аминокислот (мг/мл) колеблется в следующих пределах: L-аспарагиновая кислота - 2,6±0,3; L-треонин - 1,4±0,2; L-ce-рин - 2,4+0,3; L-глутаминовая кислота -4,2+0,4; L-пролин - 2,8±0,3; глицин - 1,2±0,2; L-аланин - 2,0±0,2; L-валин - 1,6+0,3; L-метионин - 0,6±0,2; L-изолейцин - 1,2±0,2; L-лейцин - 2,9±0,3; L-тирозин - 0,5±0,1; L-фенилаланин - 1,4±0,2; 1-гистидин - 1,5±0,2; L-лизин - 2,3+0,3; L-аргинин - 2,5±0,3- Величина молекулярной массы пептидов, входящих в состав препарата, определяется селективностью ультрафильтрационных мембран, используемых при его получении, и не превышает 10 кД. Сырьё для изготовления миелолизата получают из хозяйств, благополучных в отношении вирусных и прионо-вых болезней животных, а технологические приёмы, применяемые в процессе производства, полностью исключают возможность попадания в готовый препарат белковых контаминации, способных вызвать аллергические реакции; нуклеиновых кислот, обладающих матричной активностью, а также функционально активных протоонкогенов, вирусов и других инфекционных агентов, включая прионовые амилоиды. Препарат разработан по аналогии с известными пептидными средствами из сырья животного
Пермский медицинский журнал
2006 том XXIII №4
происхождения, обладающими тканеспеци-фическим протективным действием (1,12].
Целью данного исследования явилось изучение протекгивных свойств миелолиза-та при экспериментальном гипоксическом синдроме, моделируемом введением азоти-стокислого натрия.
материалы и методы исследования
Опыт проводили на 60 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г. Животных рандомизировали на шесть групп: 1-я - интактные (контроль), 2-я - гипоксия (отрицательный контроль), 3-6-я -гипоксия + миелолизат в дозах 0,1; 0,25; 0,5 и 1,0 мл/кг (опыт). Крысам 2-6-й групп ежедневно в течение 10 дней подкожно вводили азотистокислый натрий в дозе 15 мг/кг [6]. Животным 3-6-й групп одновременно с азо-тистокислым натрием вводили миелолизат внутримышечно в вышеуказанных дозах. Выбор дозировки обусловлен тем, что известные пептидные лекарственные средства на основе тканевых гидролизатов (церебро-лизин, церебролизат), а также разрабатываемые препараты этого ряда проявляют оптимальную фармакологическую активность при парентеральном введении животным в дозах от 0,1 до 1,0 мл/кг [1,4].
Оценку фукционального состояния спинного мозга крыс в ходе эксперимента проводили по показателям двигательной активности в тестах «открытого поля» и «вертикальных вставаний» [3]. На 11-е сутки эксперимента животных умерщвляли методом одномоментной декапитации.
В сыворотке крови животных при помощи компьютеризованного анализатора «Screen Master plus Сот-Lab» («HOSPITEX», Швейцария) определяли активность катала-зы. В гомогенатах спинного мозга крыс -
содержание ТБК-активных продуктов [11] и общую протеолитическую активность [9].
Для гистологических исследований извлекали спинной мозг с разных уровней, фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине и пропитывали 50 % раствором сахарозы. Срезы толщиной 10 мкм, изготовленные на замораживающем микротоме, окрашивали гематоксилином-эозином и проводили морфометрические исследования, подсчитывая измененные глиальные клетки и нейроны. Индекс альтерации рассчитывали на основании морфометриче-ских показателей: наличия и целостности ядер, присутствия ядрышек, плотности вещества цитоплазмы, наличия отростков у нейронов [13].
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью методов вариационной статистики с использованием компьютерных программ в операционной среде «Windows 2000ХР» с пакетом «Microsoft Office». Различия считали достоверными при /КО,05.
Результаты и их обсуждение
Как известно, нитраты и особенно их метаболиты - нитриты и нитрозосоедине-ния - при введении в организм взаимодействуют с гемоглобином, преобразуя его в метгемоглобин, неспособный переносить кислород, в результате чего снижается кислородная ёмкость крови и развивается кислородное голодание [15-17]. Недостаток кислорода в чувствительных к гипоксии клетках ЦНС инициирует комплекс взаимосвязанных экстра- и внутриклеточных процессов, приводящих к деструкции и гибели нейронов [5,14].
В нашем эксперименте у крыс, подвергнутых гипоксии, снижалась двигатель-
ная активность (табл. I). В крови достоверно падала активность каталазы - естественного эндогенного антиоксиданта. Срыв антиок-сидантной защиты приводил к пероксида-ции; в гомогенатах спинномозговой ткани вдвое возрастало содержание ТБК-реагирую-щих продуктов, а общая протесшти ческая активность повышалась почти в 2,5 раза по сравнению с контролем (табл. 2).
Полученные данные свидетельствуют о том, что у животных развивались явления ♦окислительного стресса», сущность которо-
го сводится к цитотоксическому действию высокоактивных форм свободных радикалов кислорода.
Морфологическая картина нервных меток вентральных рогов спинного мозга крыс, переживающих гипоксию, характеризовалась появлением клеток с признаками деструкции, а морфомепрический анализ свидетельствовал о достоверном увеличении, по сравнению с контролем, патологически измененных нейронов (табл. 2).
Группы животных Доза миелолизата, мл/кг Показатели двигательной активности
количество пересеченных квадратов количество вертикальных вставаний
1-я - контроль - 24,2б±3,4 8,32±0,94
2-я - гипоксия - 15.47*2,71* 4,03±0,83 -
3-я - гипоксия + миелолизат 0,1 20.31 ±4,3 5,3±1,05
4-я - гипоксия + миелолизат 0,25 23,14±3,13 7,35±0,97 *
5-я - гипоксия + миелолизат 0,5 23,01±3,52 8,02*1,05 ♦
8-я - гипоксия + миелолизат 1,0 22,9±3,25 7.81 ±1,21 *
Примечание: *-р<0,05; **-р<0,01 по сравнению с
Одновременное внутримышечное введение крысам азотистокислого натрия и миелолизата в дозе 0,25 мл/кг и выше поддерживало двигательную активность животных, что особенно наглядно проявлялось в тесте вертикальных вставаний. Активность каталазы крови возрастала не только по сравнению с группой отрицательного контроля, но и оказалась выше, чем у интактных животных. В гомогенатах спинного мозга количество ТБК-активных продуктов оставалось на уровне контрольных показателей, а общая протеолитическая активность имела тенденцию к уменьшению.
Введение миелолизата способствовало нормализации внутриклеточных процессов
контролем;р<0,05 по сравнению с группой 2
метаболизма, сохранению нервной ткани от деструкции, о чем свидетельствовали морфологические и морфометрические данные.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение миелолизата в дозе 0,25 мл/кг и выше при экспериментальном гипоксическом синдроме способствует снижению интенсивности свободнора-дикальных процессов в тканях спинного мозга, стимулирует антиоксидантную систему, повышая активность естественного антиоксиданта - каталазы, и, тем самым, снижает уровень эндогенной интоксикации, что проявляется в снижении содержания ТБК-актииных продуктов и общей протео-литической активности ткани спинного
Таблица 1
Влияние миелолизата 8 различных дозах на двигательную активность крыс при гипоксическом синдроме (л=10, М±пг)
Пермский медицинский журнал_2006 том XXIII N8 4
Таблица 2
Влияние миелолизата на биохимические показатели антиоксидантных свойств и морфометрические показатели спинного мозга при гипоксическом синдроме
(п=10, М±т)
Показатель Группы животных и дозы миелолизата
1-я - контроль 2-я - гипоксия 3-я - гипоксия + миелолизат, 0,1 мл/кг 4-я - гипоксия + миелолизат, 0,25 мл/кг 5-я - гипоксия + миелолизат, 0,5 мл/кг 6-я - гипоксия + миелолизат, 1,0 мл/кг
Каталаза крови, у.е. 0,72±0,07 0,53±0,03 * 0,74±0,06 * 1,01±0,02~* 0,96±0,05~* 1,04±0,05~*
ТБК-ашвные продукты гомогената спинного мозга, нмоль/г 21,0214,51 45,0619,22 * 28,9±4,91 23,01±3,12 * 22,84±3,33 ♦ 21,91 ±3,94 *
Протеолитическая активность гомогената спинного мозга, у.е. 0,07±0,02 0,1710,03* 0,16±0,02 0,15±0,06 0,14±0,04 0,1510,01
Индекс альтерации глиальных клеток, % 0,52±0,04 1,25±0,15 ** 0,88±0,09 0,76±0,07 • 0,73±0,05 ^ 0,7210,04 •
Индекс альтерации нейронов, % 5,44±1,13 9,56±1,24 * 8,22±1,59 7,83±1,92 8,59*1,61 6,75±1,33
Примечание: * - р<0,05; " - р<0,01 по сравнению с контролем; * - р<0,05; ~ - р<0,01 по сравнению с группой 2
мозга. Всё это способствует нормализации внутриклеточного метаболизма, препятствует возникновению процессов деструкции в нервной ткани, восстанавливает функциональную активность спинного мозга и поддерживает жизнедеятельность иннервируе-мых структур.
Выводы
1. При экспериментальном гипоксическом синдроме миелолизат способствует восстановлению функций спинного мозга и повышает двигательную активность животных.
2. При гипоксическом синдроме миелолизат в дозе 0,25 мл/кг и выше повышает
активность естественного антиоксиданта -каталазы, способствуя снижению интенсивности свободнорадикальных процессов в тканях спинного мозга.
Библиографический список
1. Абакумова 0^0, Карякин АВ, Скворцов И А. и др. Ц Бюл. эксп. биол. и мед. -1998.-№12(8).-С. 171-174.
2. Баспакьян АТ., Басков АЯ, Соколов НИ. и др. Ц Вопр. мед, хим. - 2000. - Т. 46(5).-С. 431-443.
3. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Дж. П. Хьюстон. - М.: Высшая школа, 1991.
4. Девяткина ТА, Важничая ЕМ., Лу-ценко PB. // Экспер. и клин, фармакол. -
2000.-Т. 63(4).-С. 38-41.
5. Крыжановский ГЛ. // Арх. патол. -
2001.-Т. 63(6).-С. 44-49.
6. Лазарев НВ. Гипоксия. Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований /НВ.Лазарев. - Л.: Медгиз, 1954.
7. Мельников НВ., Варламова ТЯ„ Му-хамедьянова ГЛ. и др. // Патент № 2] 83126 РФ. - 2002. - Бюл. № 16.
8. Парфёнов ВА. // Рус. мед. журн. -2001.-№9(25).-С.52-60.
9. Петрова И.С., Винцюкайте ММ. // Прикл. биохим. и микробиол. - 1996. - № 2.
- С.322.
Ю.Солохин Е£. Суд.-мед. экспертиза. -
2000. - № 2. - С. 36-38.
\\.Стальная ИД. Современные методы в биохимии / ИД. Стальная, ТТ. Гаришвили.
- М.: Медицина, 1977.
ПХавинсон ВХ. // Бюл. эксп. биол. и мед. - 2001. - Т. 132(8). - С. 228-229.
ХЬХавинсон ВХ., Кветной ИМ. // Бюл. эксп. биол. и мед. - 2000. - Т. 130(12). - С. 657-659.
\АШевченко ЮД. Гипоксия: адаптация, патогенез, клиника / ЮЛ. Шевченко. - СПб.: Элби-СПб, 2000.
l5AveryAA. // Environ, Health Perspec. -
2001.-Vol. 109(1). » P. 12-13. \6Xnobelocb L, Saina Hogan A, et al.
//Environ. Health Perspec. - 2000. - Vol. 108(7). - P. 675-678.
V Walker R. //J. of the Council Europe. -Strasbourg. - 2003. - P. 56.
NX Melniko v
CORRECTING PROPERTIES OF MYELOLYSATE IN EXPERIMENTAL HYPOXIC SYNDROME
Protective effect of new preparation myelolysate was investigated on the model of experimental hypoxic syndrome caused by injection of sodium nitrite to rats. Myelolysate is a naturally balanced mixture of peptides and amino acids obtained by standardized hydrolysis of pig spinal tissue proteins. Application of myelolysate in the dose of 0,25 mls/kg and higher promoted reduction in intensity of free-radical processes of spinal cord tissues, stimulated antioxidant system increasing activity of natural antioxidant - catalase, thus reduced the level of endogenous intoxication. Normalization of metabolism prevented occurrence of destruction processes in nervous tissue, contributed to regeneration of functional activity of spinal cord and maintained vital activity of innervated structures.
Keyivords: myelolisate, hypoxic syndrome, metabolism, catalase.
Лаборатория лекарственных средств Уфимского филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и CP РФ. г. Уфа. Материал поступил в редакцию 30.05.06
