CC BY
155
Сер. 11 2008 Прил. к вып. 1
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
УДК 615.225.3
Н. Ю. Семиголовский, С. Ю. Колбасов, Д. В. Лисицын, М. Ф. Фазылов ПОВЫШЕНИЕ ЗАЩИТНЫХ СВОЙСТВ МИЛДРОНАТА
Клиническая больница № 122 им. Л. Г. Соколова ФМБА России,
Институт токсикологии МЗиСР России, Санкт-Петербург
Введение. В лечении гипоксических осложнений, возникающих при самой разнообразной патологии, широко используются в настоящее время разные антиоксиданты (витамины Е, С, группы В и их производные, тиоловые соединения, полифенолы, ферментные препараты и др.). Предлагается также применение разнообразных комбинаций антиоксидантов и антигипоксантов (витамин С + унитиол или рибоксин; акто-вегин + инстенон; церебролизин + реомакродекс) и их сочетаний с иммуномодуляторами, вазоактивными средствами и др. [1—3].
Общепризнанно также, что такие распространенные гипоксические состояния как ишемическая болезнь сердца (ИБС), сердечная недостаточность и мозговой инсульт занимают в настоящее время лидирующее положение среди причин инвалидизации и смертности населения. В их лечении традиционно используют различные классы препаратов — нитраты, бета-адреноблокаторы, антагонисты кальция, мочегонные средства, сердечные гликозиды, антикоагулянты, дезагреганты и др. Из средств т.н. цитопротекторного действия (антиишемического, антигипоксического) популярными препаратами в настоящее время являются триметазидин (предуктал) и милдронат. В отличие от триметазиди-на милдронат не обладает синдромом отмены [4].
Помимо спортивной медицины, для которой и был первоначально предложено применение милдроната, достаточно давно было выявлено его благоприятное действие и в клинике у больных при хронической сердечной недостаточности [5-8] (остром инфаркте миокарда [4, 9], ишемическом инсульте [10, 11] и других заболеваниях и состояниях (пульмонология, офтальмология, наркология).
По своей структуре милдронат является синтетическим аналогом предшественника биосинтеза карнитина — гамма-бутиробетаина. Установлено, что, как и карнитин, он участвует в энергетическом обмене клеток и тем самым предупреждает активацию реакций гликолиза, которые доминируют в условиях тканевой гипоксии, влияя на процессы окисления свободных жирных кислот [12]. Новый импульс для развития получила эта проблема в 2000 году, когда японские исследователи (Науа8Ы У и соавторы* — цит. по [12]) установили, что милдронат более чем на 30 % увеличивает продолжительность жизни экспериментальных животных при сердечной недостаточности, вызванной инфарктом миокарда.
Используя милдронат в лечении больных острым инфарктом миокарда с 1992 года, мы установили, что применение препарата в составе комбинированной терапии
* В Японии препарат известен как МЕТ-88.
© Н. Ю. Семиголовский, С. Ю. Колбасов, Д. В. Лисицын, М. Ф. Фазылов, 2008.
улучшает клинический статус больных ИБС, сократительную функцию левого желудочка, повышает толерантность к физической нагрузке и качество жизни. Препарат использовали в остром периоде заболевания и на этапах реабилитации, что позволило снизить летальность от острого инфаркта миокарда [4]. В последнее время мы задались вопросом об увеличении эффективности милдроната с помощью комбинации с другим веществом этого ряда, но обладающим субстратным механизмом действия. Тем более что известны побочные действия милдроната: диспепсия, возбуждение, тахикардия, изменение артериального давления, кожный зуд. А противопоказаниями к его применению являются: гиперчувствительность, органические поражения ЦНС. Считается, кроме того, что пациентам с хроническими заболеваниями печени и почек при длительном применении милдроната следует соблюдать осторожность.
В клинической практике в качестве биологически активных веществ с широким фармакологическим спектром действия все чаще применяют соединения янтарной кислоты [13, 14]. Известно, что под их влиянием значительно уменьшается или полностью компенсируется постгипоксический метаболический ацидоз различного происхождения. Такой эффект связывают прежде всего с энергодающим действием сукцината — интермедиатора цикла Кребса. Результатом использования сукцината является увеличение синтеза АТФ, торможение гликолиза и усиление глюконеогенеза. Потеря интермедиаторов цикла Кребса возрастает при гипоксии, острых и хронических интоксикациях. Поэтому пополнение их пула считается необходимым. Причем для восстановления пула всех органических кислот цикла Кребса оказалось достаточным экзогенного введения лишь одного сукцината [14, 15]. Доклинические исследования показали наличие у янтарной кислоты биологической активности с уникальным сочетанием проявлений по отношению к здоровому организму. Сукцинат выступает в роли адаптогена и актопротектора, а при наличии патологических расстройств проявляет нетипично высокий терапевтический эффект [12, 14].
Отсюда перспективным считают лечебное применение сукцината при острой и хронической ишемической болезни сердца, в нейрореаниматологии, при поражениях печени различной этиологии, для повышения устойчивости организма человека к неэлектролитному действию алкоголя, к ионизирующим излучениям и ядам, а также как антистрессорного средства. Считают, что антистрессорный эффект янтарной кислоты обусловлен ее антигипоксическим действием как за счет влияния на транспорт медиаторных аминокислот, так и за счет увеличения через шунт Робертса содержания в головном мозге у-аминомаслянной кислоты [16].
Наиболее активно экзогенный сукцинат захватывается печенью, что сопровождается повышением ее детоксицирующей активности и гепатопротекторным действием [19].
Преимущество экзогенного сукцината в скорости окисления перед другими субстратами тканевого дыхания особенно выражены в условиях гипоксии. Кроме того, противоишемический эффект экзогенной янтарной кислоты связан не только с активацией сукцинатдегидрогеназного окисления, но и с восстановлением активности ключевого фермента окислительно-восстановительной активности митохондрий — цитох-ромоксидазы. В эксперименте [16] янтарная кислота предотвращала появление факторов риска атерогенеза (гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, гиперлипопротеи-немию низкой и очень низкой плотности). Она нормализует содержание гистамина и серотонина в крови и повышает микроциркуляцию в органах и тканях, не оказывая влияния на артериальное давление и показатели работы сердца [17]. При использовании сукцината отмечали стабилизацию гемодинамики и рост толерантности к физическим нагрузкам [13, 18].
Мы предположили, что антиоксидантные, антистрессорные и гепатопротек-торные свойства янтарной кислоты в комбинированном препарате могут нивелировать нежелательные побочные явления при использовании милдроната в качестве монотерапии. Известные свойства янтарной кислоты могут усилить антигипоксиче-ский и антиишемический потенциал такой рецептуры, дополнив его антиатероген-ным действием.
Целью исследования явилось изучение двух рецептур: милдронат 40 мг/кг с янтарной кислотой 15 мг/кг (рецептура 1) или 30 мг/кг (рецептура 2) в нагрузочных и гипоксическом тесте в сравнении с милдронатом 40 мг/кг.
Сопоставление защитного эффекта комбинаций милдроната с сукцинатом в разных дозировках и милдроната проведено в моделях изучения антигипоксической и адап-тогенной активности.
Изучалась активность двух рецептур в дозах, рекомендованных для человека: рецептура № 1 — янтарная кислота 100 мг, милдронат 250 мг; рецептура № 2 — янтарная кислота 200 мг, милдронат 250 мг. Объем испытаний определялся «Правилами доклинических исследований безопасности и эффективности фармакологических веществ» [19].
Материал, методы и результаты исследования. Эксперименты выполнялись на нелинейных белых мышах-самцах из питомника Рапполово (г. Санкт-Петербург) весом 19-21 г
При исследовании по каждой из моделей использовали по четыре группы животных:
• контрольную (без введения рецептур);
• с введением рецептуры №1;
• с введением рецептуры №2;
• с введением милдроната в дозе 250 мг.
Группы содержали по 10 животных. Кроме этого, имелась одна общая группа интактных мышей численностью в 20 животных, представлявшая видовую норму.
Выбор направлений изучения фармакологической активности рецептур определялся предполагаемыми показаниями к их применению, главным из которых является адаптация организма к неблагоприятным и экстремальным факторам окружающей среды (активация свободнорадикальных реакций, оксидантные повреждения, гипоксия, энергодефицитные состояния) и про-тивоишемическое действие (стенокардия, инфаркт миокарда, инсульт).
Из сравнительных нагрузочных тестов использовались модели максимальной длительности статической работы (удержание белыми мышами своего тела на вертикальной сетке), длительности плавания мышей с грузом (тест динамической работы). Из моделей экстремальных факторов использовали моделирование гипоксии в замкнутом объеме («баночная гипоксия»).
Рецептуры вводили ежедневно per os на протяжении 7 дней белым нелинейным мышам с помощью дозатора с атравматическим наконечником в 10 часов утра в адаптированных дозах (в 10 раз больших, чем для человека на кг веса): рецептура № 1 — милдронат 40 мг/кг, янтарная кислота 15 мг/кг; рецептура № 2 — милдронат 40 мг/кг, янтарная кислота 30 мг/кг; мил-дронат — 40 мг/кг. Кровь для исследований получали пункцией хвостовой вены или после декапитации животных.
Активность общих липидов, холестерина, билирубина сыворотки крови определяли с помощью наборов Био-Ла-Тест Чешской фирмы «Лахема». Содержание восстановленного глута-тиона в печени определяли иодометрически, сульфгидрильных групп сыворотки крови — амперометрическим титрованием по Н. С. Рубиной, содержание гликогена—методом Самодьи. Уровень глюкозы в крови и гомогенатах органов определяли ортотолуидиновым методом. Интенсивность тканевого дыхания в гомогенатах органов определяли манометрическим методом Варбурга, содержание АТФ—хроматографически. Об интенсивности процессов ПОЛ судили по концентрации МДА и уровню гидроперекисей липидов, а состояние антиоксидантных систем оценивали по активности каталазы плазмы крови. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по Стьюденту-Фишеру.
Таблица 1 Физическая выносливость мышей в тесте статической силовой нагрузки собственным весом (М ± т)
Группы животных Длительность висения, мин
Контроль 21,7 ± 0,5
Рецептура № 1 29,2 ± 0,7*
Рецептура № 2 31,7 ± 0,3*
Милдронат 25,5 ± 0,5*
Примечание: * — достоверные отличия от кон-
троля при Р < 0.05
Таблица 2
Длительность плавания мышей с грузом после введения рецептур (М ± т)
1. Влияние рецептур на статикосиловую выносливость мышей. Влияние рецептур на статико-силовую выносливость изучали, регистрируя время висения мышей опытных и контрольной групп на вертикальной сетке.
Критерием истощения статической силы считали время, когда мышь уже не могла удерживать вес своего тела и падала с сетки вниз (собственный вес мышей составлял в среднем 23 г). Результаты эксперимента представлены в табл. 1. Они демонстрируют увеличение статической физической выносливости под воздействием обеих рецептур.
2. Влияние на длительность плавания мышей. Плавание является тяжелой физической динамической нагрузкой, позволяющей оценить эффективность адаптогенов. Оно осуществлялось с грузом (свинцовая трубка на резиновом кольце, прикрепляемая к корню хвоста), равным 5 % от веса тела, при температуре воды 38°-39 °C. Критерием утомления и прекращения плавания считали первое «ныряние» с погружением носовых ходов в воду. В большой ванне одновременно плавали по 5 животных из каждой наблюдаемой группы. Результаты представлены в табл. 2.
3. Антигипоксическое действие. Дыхание из замкнутого пространства—респерация—является достаточно адекватной и простой моделью острой гипоксии. Животное, поглощая кислород из замкнутого пространства вследствие дыхания, испытывает развитие его дефицита — ги-поксическую гипоксию, что позволяет оценивать исследуемый препарат по интегральным показателям летальности за определенное время наблюдения и устойчивости к дефициту кислорода (максимальной продолжительности жизни).
Животные помещались в банку объемом 250 мл, плотно закрытую стеклянной крышкой, смазанной герметиком. Фиксировали с помощью секундомера максимальную продолжительность жизни и симптомы танатогенеза. Банки с животными во время исследования находились в кондиционере, обеспечивающем постоянство условий эксперимента (температура+20 °C, влажность — 65-70 %, атмосферное давление). Контролем служили интактные животные.
После гибели у каждого животного ex tempore получали головной мозг, проводили его гомогенезацию (400 об/мин, 10 ходов пестика) и определяли в гомогенате активность каталазы, уровень диеновых конъюгатов и гидроперекисей липидов. Эти показатели (см. табл. 3) позволяют оценивать антиоксидантные свойства препарата.
Таблица 3
Эффективность рецептур в тесте «баночной гипоксии» (M ± m)
Группы животных Длительность плавания, мин
Контроль 26б,9 ± 4,9
Рецептура № 1 37,4 ± 5,6*
Рецептура № 2 36,8 ± 4,8*
Милдронат 32,5 ± 5,2*
Примечание: * -троля при P < 0.05
- достоверные отличия от кон-
Показатель
Группы животных Продолжительность жизни, мин Малоновый диальдегид, нмоль/мг белка Каталаза, мкмольН202/мг мин Гидроперекиси липидов, ед. опт. плотности при 480 нм
Интактные Контроль Рецептура № 1 Рецептура № 2 Милдронат 33,6 ± 2,2 47.5 ± 1,2* 46,3 ± 1,7* 38.5 ± 1,0* 2.82 ± 0,31 4,56 ± 0,62 3,22 ± 0,64* 3,12 ± 0,54* 3.82 ± 0,44* 9.42 ± 0,63 3.42 ± 0,54 5,46 ± 0,53* 5,36 ± 0,53* 5,60 ± 0,59* 0,12 ± 0,01 0,48 ± 0,02 0,28 ± 0,03* 0,27 ± 0,03* 0,33 ± 0,02*
Примечание: * — достоверные отличия от контроля при P < 0.05
Оказалось, что рецептуры достоверно увеличивают время жизни мышей, при этом стабилизировались показатели перекисного окисления липидов (снижались уровни малонового диальдегида и гидроперекисей липидов мозга) и восстанавливалась антиокислительная (ката-лазная) активность, что свидетельствует об увеличении резервной антиокислительной активности мозга.
4. Показатели функционального состояния адаптационных систем организма. Показатели, характеризующие энергетический обмен, обмен липидов и антитоксическую активность организма после 7-дневного введения рецептур представлены в табл. 4.
Таблица 4
Показатели функционального состояния адаптационных систем организма
Показатели Контроль Рецептура № 1 Рецептура № 2 Милдронат
Масса тела, г 23,5 і 1,5 24,2 і 1,3 25,2 і 1,3 23,2 і 1,2
Общие липиды, сыворотка, г/л 3,7 і 0,3 3,3 і 0,2* 3,2 і 0,2* 3,4 і 0,2*
Холестерин, сыворотка, ммоль/л 1,72 і 0,44 1,б8 і 0,24 1,б7 і 0,2б 1,бб і 0,34
Билирубин общий, сыворотка, ммоль/л 3,0 і 0,3 3,1 і 0,4 3,2 і 0,4 3,1 І Q,2
-БИгр, сыворотка, мг % 1б50і 90 1бЗ0 і 40 1бЗ5і 50 1б40іб0
Восстановленный глутатион, печень, мг % 1б0 і 8 1бб і 11 1б5 і 11 1б2 і 11
Гликоген, печень, мг % 2500 і 100 24б0і 150 2470 і 150 2480 і 120
Глюкоза, сыворотка, мг % 90 і 10 88 і 12 87 і 12 91 І 13
Глюкоза, мышцы, г % 140 і 30 151 і 10 149 і 40 148 і 40
АТФ, сердце, мкмоль / г 2,4 і 0,2 3,0 і 0,2* 3,1 і 0,2* 2,8 і 0,1*
АТФ, мышцы, мкмоль / г 5,1 і 0,2 5,9 і 0,4* 5,8 і 0,2* 5,0 і 0,2
Интенсивность тканевого дыхания, сердце, мкл О2 / 100 мг / час б0 і 5 73 і б* 72 і б* 58 І 3
Интенсивность тканевого дыхания, мышцы, мкл О2 / 100 мг /час 20 і 4 31 і 4* 30 і 4* 25 і 2
Примечание: * — достоверные отличия от контроля при P < 0.05
Представленные результаты свидетельствуют об антигипоксической и адаптационной направленности действия изученных рецептур, причем рецептура № 1 (соответствует милдронату 250 мг + сукцинат 100 мг) превосходит по эффективности защитного действия препарат сравнения милдронат (250 мг), а рецептура № 2 (соответствует милдронату 250 мг + сукцинат 200 мг) не добавляет статистически достоверно протекторной активности такой комбинации. Перспективным является дальнейшее изучение комбинированного препарата, включающего милдронат и янтарную кислоту, для усиления эффективности антигипоксической защиты и нивелирования побочных действий милдроната.
Summary
Semigolovskiy N. Yu., Kolbasov S. Yu., Lisitsin D. V., FazylovM. F. Increase of protective activity of mildonate.
The combinations of mildronate with succinate potentiate prolongate the life of mice in a hermocamera, its potentiate static and dynamic tolerance, stabilise lipid peroxidation and demonstrate antioxidant activity. High doses of succinate do not increase the pharmacological activity of the combination. Combination of mildro-nate with succinate increases the protective pharmacological activity of the drug in a certain range of doses.
Key words: mildronate, succinate, antihypoxic and adaptogenic pharmacological activity.
Литература
1. Абрамченко В. В. Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве. СПб, 2001. 400 с.
2. Вахрушев Я. М., Трусов В. В., Соловьева Н. Е. Опыт сочетанного применения трентала и солкосерила в лечении больных хроническим панкреатитом // Тер. архив. 1988. Т. 60. № 2. С. 129-133.
3. Кокорева Н. Е. Комплексная оценка терапевтической эффективности фосфокреатина (неотона) и его сочетания со стрептодеказой при инфаркте миокарда: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Минск, 1993.
4. Семиголовский Н. Ю. Антигипоксанты в анестезиологии и реаниматологии (клиникоэкспериментальное исследование). Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. СПб., 1997. 42 с.
5. Карпов Р. С., Кошельская О. А., Врублевский А. В. и др. Клиническая эффективность и безопасность милдроната при лечении хронической сердечной недостаточности у больных ишемической болезнью сердца // Кардиология. 2000. № 6. С. 69-74.
6. Люсов В. А., Савчук В. И., Савенков П. М. и др. Гемодинамические эффекты милдрона-та в клинике у больных инфарктом миокарда с сердечной недостаточностью и в эксперименте // Экспер. и клин. фармакотер. 1991. № 19. С. 113-117.
7. Ольбинская Л. И., Голоколенова Г. М. Применение милдроната при сердечной недостаточности у больных ишемической болезнью сердца // Клин. мед. 1990. № 1. С. 39-42.
8. Сахарчук И. И., Денисенко Г. Т., Грушко В. С. и др. Применение милдроната при сердечной недостаточности у больных с хронической ишемической болезнью сердца // Врач. дело 1989. № 9. С.21-23.
9. Костюченко А.Л., Семиголовский Н. Ю. Антигипоксант милдронат в остром периоде инфаркта миокарда // Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы / Мат. Российской науч. конф. СПб.: ВМедА, 1994. вып. 2. С. 126.
10. Винничук С. М. Эффективность лечения милдронатом больных ишемическим инсультом // Врач. дело. 1991. № 7. С. 77-79.
11. Суслина З. А., Федорова Т. Н., Максимова М. Ю., Ким Е. К. Анитоксидантное действие милдроната и L-карнитина при лечении больных с сосудистыми заболеваниями головного мозга // Эксп. и клин. фармакол. 2003. № 3.
12. Кальвиньш И. Я. Милдронат—механизм действия и перспективы его применения. Рига, 2002. 39 с.
13. Ивницкий Ю. Ю. Янтарная кислота в системе метаболической коррекции функционального состояния и резистентности организма. СПб. 1998. 82 с.
14. Лукьянова Л. Д. Гипоксия при патологиях. Молекулярные механизмы и принципы коррекции // Сб. науч. тр. Перфторорганические соединения в биологии и медицине. СПб., 2001. С. 56-69.
15. КондрашоваМ. Н. Выясненные и наметившиеся вопросы на пути исследования регуляции физиологического состояния янтарной кислотой // Терапевтическое действие янтарной кислоты / Под ред. В. Н. Кондрашовой. Пущино, 1976. С. 8-30.
16. Мутускина Е. А., Заржецкий Ю. В., Трубина И. Е. и др. Влияние янтарной кислоты на постреанимационную патологию ЦНС и организма в целом // Анестезиология и реаниматология. 1996. № 5. С. 61-63.
17. Румянцева С. А. Комплесная антиоксидантная терапия реамберином у больных с критическими состояниями неврологического генеза // Реамберин: реальность и перспективы / Сб. науч. статей. СПб., 2002. С. 74-98.
18. Исаков В. А., Коваленко А. Л., Евграфов В. Д. Реамберин в терапии тяжелых форм гриппа // Реамберин: реальность и перспективы / Сб. науч. статей. СПб. 2002. С. 139-144.
19. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000. 352 с.
