CC BY
21ЙЖ 0868-5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2004, том 14, № 2, с. 109-115
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ
УДК 543.544+ 621.384.668.8]: 5 77.175.722
© А. В. Новиков, И. В. Назимов, В. А. Русанов, А. Н. Веренчиков, Н. В. Краснов
КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ТАНДЕМА "МИКРОКОЛОНОЧНЫЙ ЖИДКОСТНЫЙ ХРОМАТОГРАФ-МАСС-СПЕКТРОМЕТР” В РЕЖИМЕ ПРЯМОГО ВВОДА ОБРАЗЦА
Проведены хроматографическое разделение и МС-анализ компонентов сложных смесей полипептидов в режиме "on-line" путем стыковки высокоэффективного жидкостного микроколоночного хроматографа Мили-Хром А-02 и времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным источником и электрораспылением ионов МХ5303. Возможности тандема показаны на примере контроля содержания целевых и побочных продуктов на отдельных стадиях промышленного биотехнологического процесса получения генноинженерного инсулина человека.
ВВЕДЕНИЕ
Использование масс-спектрометрии (МС) с мягкими методами ионизации позволяет интенсифицировать исследования в различных областях органической, биологической, геологической химии, агрохимии, медицины, биотехнологии и т.д. [1-4]. Тем не менее, при использовании даже современных МС-методов, например ESI-MS
(Electrospray Ionization Mass Spectrometry), работа с компонентами сложных смесей, полученных в режиме "off-line", является трудоемкой задачей, которая быстрее решается при использовании тандема "высокоэффективный жидкостный хроматограф—масс-спектрометр" (ВЭЖХ-МС) [3-4]. Такой тандем, первый элемент которого осуществляет микроколоночную высокоэффективную жидкостную хроматографию (микро-ВЭЖХ) или капиллярный электрофорез (КЭФ), позволяет проводить изучение состава и структуры компонентов сложных смесей органических веществ без предварительного выделения компонентов, что значительно упрощает идентификацию их при сохранении возможности количественного определения исследуемых веществ [4]. В последнее время такой подход особенно актуален в протеомных исследованиях, где приходится иметь дело с разделением чрезвычайно сложных по составу смесей пептидов (включающих тысячи, а иногда и десятки тысяч пептидов — фрагментов белков) с последующим определением химической структуры целевых пептидов.
Целью нашей работы была стыковка отечественного ВЭЖХ МилиХром А-02 с времяпролет-ным масс-спектрометром с ортогональным вводом
и ионизацией электрораспылением (модель МХ5303). Возможности этого тандема показаны на примере анализа продуктов ферментативного гидролиза гибридного белка (ГБ), являющегося предшественником инсулина человека.
Инсулин является полипептидным гормоном, который повышает скорость синтеза гликогена и тем самым снижает содержание глюкозы и ряда других сахаров в крови. Прекращение синтеза инсулина организмом человека приводит к развитию сахарного диабета [5].
Первоначально инсулин для терапевтических целей получали из природных источников (островков Лангерганса поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной ин-сулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека) проявляют в организме активность, сравнимую с инсулином человека. Поэтому долгое время для лечения сахарного диабета применяли инсулины быка или свиньи. Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие. Инсулин человека теоретически можно получать из поджелудочной железы человека, но использование такого источника практически нереально для массового получения инсулина человека в терапевтических целях.
Выходом из этой ситуации стало получение человеческого инсулина генно-инженерным способом (ГИИЧ) путем встраивания гена инсулина человека в генетический аппарат бактерии (Е.соЩ или дрожжей (Наскаготусеи сerevisae) [5-7].
Основные стадии производства ГИИЧ
Методы анализа
1
3
4
5
6
7
Рис. 1. Блок-схема получения ГИИЧ с разделением стадий трипси-нолиза и действия карбоксипептидазы В
В процессе культивирования бактерии (дрожжи) синтезируют ГБ-предшественник, включающий инсулин человека. ГБ ферментативно расщепляют трипсином и карбоксипептидазой В с последующим выделением активной формы гормона (рис. 1).
Ферментативное расщепление ГБ может проводиться либо в несколько последовательных отдельных стадий (трипсинолиз ^ очистка ^ гидролиз карбоксипептидазой В ^-очистка), что довольно долго, либо в одну стадию, совместив действие трипсина и карбоксипетидазы В (что значительно быстрее). При этом необходимо учитывать, что все эти стадии (рис. 1) требуют контроля состояния как исходного ГБ, так и продуктов гидролиза. В связи с этим разработка надежного и экономически целесообразного метода контроля процесса получения инсулина является актуальной задачей [6-7].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Расщепление ГБ трипсином представляет собой сложный многоступенчатый и многопараметрический кинетический процесс. Поэтому первым этапом нашей работы была оптимизация процесса триптического гидролиза с целью получения максимального количества диаргинилинсулина (из которого далее при обработке карбоксипептидазой В получали инсулин) при минимальном образовании побочных (зачастую токсичных) продуктов расщепления ГБ. В частности, необходимо было минимизировать разрыв пептидных связей между Lys29 и Thr30 и образование дезтрионилинсулина (дез-ТЬгБ30-инсулин).
Рис. 2. Микро-ВЭЖХ триптического гидролизата (гибридного белка, ГБ), полученного при 37 °С.
А — исходный ГБ; Б — 4 часа, В — 8 часов, Г — 24 часа гидролиза соответственно.
Колонка: РК0ОТ081Ь АО С18 (2 х 75 мм).
Подвижная фаза: А — 0.1% трифторуксусная кислота (ТФУ),
Б — СН3СК Градиент: 10-40 % Б за 23 мин.
Скорость потока: 100 мкл/мин.
Температура колонки: 40 оС.
Пик 1 — продукт протеолиза ЛФ с ш/2 = 7025.4 Да, пик 2 — ди-А^-инсулин, пик 3 — моно-А^-инсулин, пик 4 — дезтрионилинсулин (дез-ТЬг®30-инсулин)
Рис. 3. Микро-ВЭЖХ триптического гидролизата (гибридного белка, ГБ), полученного при 10 °С.
А — исходный ГБ; Б — 2 часа, В — 8 часов, Г — 22 часа гидролиза соответственно.
Колонка:
Подвижная фаза: Градиент:
Скорость потока: Температура колонки:
PRONTOSIL AQ С18 (2 х 75 мм).
А — 0.1% трифторуксусная кислота (ТФУ), Б — Œ3CN. 10-40 % Б за 23 мин.
100 мкл/мин.
40 оС.
1П7 1
Пик 1 — расщепление по связи Glu -Arg (С-КЯ);
пик 2 — продукт протеолиза ЛФ с m/z = 7025.4 Да;
пик 3 — ди-А^-инсулин;
пик 4 — моно-А^-инсулин;
пик 5 — расщепление по связи Met1-Arg74 (ЛФ-1);
пик 6 — дез-ТЬг®30-инсулин
Для этого была отработана методика расщепления ГБ трипсином и последующего хроматографического и МС-анализа трипсинового гидролизата off-line. При этом гидролизат предварительно разделяли хроматографически, затем отобранные фракции лиофильно высушивали и исследовали масс-спектрометрически.
Было определено, что снижение температуры расщепления белка трипсином (рис. 2, 3) позволяет существенно снизить выход дез-ТЬг-инсулина.
Была проведена масс-спектрометрическая
идентификация всех хроматографических пиков (рис. 4). Были определены все пептиды, образую-
щиеся в результате трипсинолиза. Так как раздельная обработка гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой В занимает много времени, была проведена работа по оптимизации условий совместного гидролиза (рис. 5). После хроматографического разделения продуктов триптического гидролиза проводился масс-спектрометри чес-кий анализ отобранных фракций.
Методика анализа продуктов гидролиза off-line занимает много времени и, несмотря на свою надежность, весьма трудоемка и потому малопригодна для серийного анализа. Для того чтобы сократить время анализа продуктов гидролиза, была
Integrated Mass Spectrum from 0 to 952899
6 000 5 000 ^ 4 000 04 3 000 2 000 1 000
829, S878
1 050 678І 142 5634 а
і . і 1 • 1 427 74,51 244,0027 9336
730,035 L, і ■ л,І І і, li|U> . и IL J, I J, І 1 575,4708 ... I,.
4 000 3 500 3 000 , 2 500 ! 2 00Q 1 500 1 000 500
1 000 1 200 Mass/Char ere
Рис. 4. Масс-спектры продуктов трипсинолиза гибридного белка:
а — суммарный масс-спектр гидролизата; б — масс-спектр дез- ХЬг030- инсулин (фракция получена после хроматографического разделения)
Время, мин
Рис. 5. Микро-ВЭЖХ триптического гидролиза гибридного белка совместно с действием карбоксипеп-тидазы В при 4 °С через 22 часа.
Колонка: РК0ОТ081Ь АО С18 (2 х 75 мм).
Температура: 40 оС.
Пик 1 — расщепление по связи в1и107-Ьу8 138 (С-К); пик 2 — продукт протеолиза ЛФ с т/г = 7024.0 Да; пик 3 — ди-А^-инсулин;
пик 4 — фрагмент совместного триптического гидролиза с т/г = 5984.3 Да; пик 5 — моно-А^-инсулин; пик 6 — инсулин, пик 7 — дез-ТЬг0 0-инсулин
б
2
Рис. 6. Тандем: жидкостной хроматограф МилиХром А-02 с времяпролетным масс-спектрометром с орто-ганальным вводом и ионизацией электрораспылением (МХ5303)
осуществлена стыковка ВЭЖХ МилиХром А-02 и масс-спектрометра МХ5303 в единый тандем (рис. 6).
Важной задачей при стыковке являлся подбор условий, позволяющих добиться максимального разделения компонентов реакционной смеси на хроматографической колонке при условии получения максимального МС-сигнала. Первоначально в качестве одного из элюентов использовали 0.1% трифторуксусную кислоту (ТФУ). Однако использование этого элюента показало, что из-за чрезвычайно низкой чувствительности детектирования масс-спектрометрический анализ пептидов невозможен.
Использование 1% раствора уксусной кислоты позволяет добиться высокой чувствительности МС-детектирования, но не позволяет получить удовлетворительное разделение пептидов и приводит к размытым зонам, содержащим смеси пептидов (рис. 7).
Наилучшие результаты были достигнуты при использовании в качестве элюента 0.5% раствора муравьиной кислоты, который создает оптимальный рН раствора (рис. 8).
Таким образом, в результате проделанной работы были осуществлены хроматографическое разделение и МС-анализ компонентов сложных смесей полипептидов в режиме "on-line" путем стыковки ВЭЖХ (МилиХром А-02) и времяпро-летного масс-спектрометра (МХ5303) с ортогональным источником ионов и электрораспылением (ESI-o-TOF). При этом реализован полностью автоматизированный режим работы "on-line", включающий забор пробы, хроматографическое разделение и МС-анализ с записью масс-спектров в диапазоне от 100 Да до 17 кДа с разрешением 10 000. Время разделения даже сложных смесей пептидов с близкими хроматографическими
свойствами не превышало 20-25 мин при чувстви- 10 пикомоль каждого компонента.
тельности МС-идентификации пептидов не более
Рис. 7. Пример неполного разделения гидролизата при использовании в качестве элюента 1 % уксусной кислоты
Рис. 8. Пример разделения гидролизата гибридного белка при использовании в качестве элюента 0.5 % муравьиной кислоты
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали гибридный белок, инсулин человека (Институт биоорганической химии РАН, Москва), трифторуксусную кислоту, уксусную кислоту, муравьиную кислоту производства фирмы "Merck" (ФРГ), ацетонитрил ("Криохром", Санкт-Петербург). Использовали ферменты: кар-боксипептидазу В, трипсин ("Serva", ФРГ).
Хроматографию проводили на микроколоноч-ном жидкостном хроматографе МилиХром А-02 ("Эконова", Новосибирск). Хроматографическая колонка размером 2 х 75 мм заполнена сорбентом Prontosil AQC18 ("Bishof", ФРГ).
Масс-спектрометрический анализ проводили на приборе МХ 5303, оборудованном электрораспы-лительным источником ионизации (electrospray ionization, ESI) и времяпролетным масс-анализатором (TOF), разработанным в Лаборатории экологической и биомедицинской масс-спектро-метрии ИАнП РАН. Все спектры получены в режиме съемки положительных ионов. Объем анализируемой пробы 10 мкл. Скорость подачи раствора образца 1-2 мкл/мин.
Пептиды растворяли в 50 % ацетонитриле в присутствии 1 % уксусной кислоты в концентрации 0.5-1.0 пмоль/мкл.
Элюцию осуществляли градиентом концентрации ацетонитрила от 10 до 50 % (по объему) в растворах 0.1 % трифторуксусной кислоты, 0.5 % муравьиной кислоты, 1 % уксусной кислоты в зависимости от эксперимента со скоростью 100 мкл/мин.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
USA, 2001. 416 p.
2. Chapman J.R. Practical organic Mass Spectrometry. John Wiley & Sons, Chichester, 1995. 338 p.
3. Mann Matthias, Hendrickson Ronald C., and Pandey Akhilesh. Analysis of proteins and pro-teomes by mass spectrometry // Annu. Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. 437-473.
4. Willoughby Ross, Ed Sheehan & Sam Mitrovich A Global View of LC/MS, How to Solve Your Most Challenging Analytical Problems. Global View Publishing, 2002. 2nd edition. 554 p.
5. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Высшая школа, 1996. 335 c.
6.Миргородская О.А., Казанина Г.А., Миргородская Е.П. и др. Протеолиз проинсулина человека, катализируемый нативным, модифицированным и иммобилизованным трипсином // Биоорганическая химия. 1997. Т. 23, № 2. С.91-97.
7. Клюшниченко В.Е., Якимов С.А., Мальцев К.В. и др. Генно-инженерный инсулин человека. ВЭЖХ в анализе продуктов основных стадий производства // Биоорганическая химия. 1992. Т. 18, № 12. С. 1478-1486.
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург (Новиков А.В., Веренчиков А.Н., Краснов Н.В.)
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва (Назимов И.В., Русанов В.А.)
1. Chhabil Dass. Principles and practice of biological mass spectrometry. Wiley-interscience, NY.,
Материал поступил в редакцию 7.04.2004.
CONTROL OF INDUSTRIAL GENETIC ENGINEERING-BASED PRODUCTION OF HUMAN INSULIN USING AN ON-LINE MICROCOLUMN LIQUID CHROMATOGRAPH—MASS SPECTROMETER
A. V. Novikov, I. V. Nazimov*, V. A. Rusanov*, A. N. Verenchikov, N. V. Krasnov
Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg M.M. Shemyakin and YuA. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow
The paper describes on-line chromatographic separation and MS analysis of complex polypeptide mixture components by interfacing a high-performance microcolumn liquid chromatograph MiliChrom A-02 to an orthogonal electrospray ion source time-of-flight mass spectrometer MX5303. The potential of the tandem is demonstrated on the example of target- and by-product content monitoring at certain stages of the industrial genetic engineering-based production of human insulin.
