CC BY
34ISSN 0868-5886
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2010, том 20, № 4, c. 67-70
== МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ =
УДК543.544.5.068.7: 615.2/.3: 611.018.54
© А. В. Новиков, Р. А. Бубляев, Д. И. Корнев, Н. В. Краснов
ВЭЖХ-МС-АНАЛИЗ СВЕРХМАЛЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
С помощью приборного комплекса, состоящего из времяпролетного масс-спектрометра МХ 5310 и жидкостного хроматографа Милихром А-02, произведен анализ состава лекарственных препаратов. Показана возможность повышения чувствительности хромато-масс-спектрометрического анализа лекарственных компонентов по отношению к хроматографическому анализу.
Кл. сл.: анализ лекарственных средств, жидкостной хроматограф—масс-спектрометр, повышение чувствительности
ВВЕДЕНИЕ
Развитие фармацевтической науки привело к созданию новых лекарственных препаратов, даже ничтожные количества которых обладают сильным биологическим действием [1]. Соответственно возрастают и требования к отечественным приборным комплексам, позволяющим как качественно, так и количественно анализировать эти лекарственные препараты.
В настоящей работе с помощью приборного комплекса, состоящего из времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом и ионизацией электрораспылением МХ 5310 и жидкостного хроматографа Милихром А-02, произведен анализ состава лекарственных препаратов, находящихся как в оптовой, так и в розничной продаже.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Возможности высокоэффективного жидкостного хроматографа Милихром А-02 как отдельного аналитического прибора неоднократно демонстрировались как при выявлении "брака", так и в поиске поддельных лекарств, что подтверждается наличием аттестованных методик [1, 2]. Подключение же в качестве дополнительного детектора времяпролетного масс-спектрометра МХ 5310 позволит значительно расширить диапазон решаемых с помощью Милихрома А-02 задач с точки зрения чувствительности.
В данной работе с помощью указанного приборного тандема решалась задача анализа состава такого лекарственного средства, количества компонентов которого находятся ниже предела обнаружения УФ-детектора хроматографа. Для этого была приготовлена модельная смесь лекарств (па-
рацетамол, кофеин, анальгин и кодеин), содержащая не более 0.1 нг каждого вещества. В качестве растворителя использовался метанол, а в качестве элюента — ацетонитрил и 0.25 %-й раствор муравьиной кислоты.
На рис. 1 представлен участок суммарного масс-спектра модельной смеси, снятого за все время прохождения хроматограммы. Следует отметить, что компоненты смеси УФ-детектором хроматографа не регистрировались.
Анализ масс-спектра позволил идентифицировать компоненты смеси, причем было выявлено, что анальгин присутствует в растворе в виде фрагментов с массами 217.1 Да и 203.1 Да (пики 3), что было подтверждено специальным экспериментом с чистым анальгином.
Аналогичный результат был получен при анализе второй модельной смеси лекарств, содержащей ранитидин, кофеин, ампициллин, ципрофлак-син, кетопрофен и диклофенак, приготовленной в тех же количествах, что и предыдущая смесь.
Суммарный масс-спектр, снятый в режиме online, легко идентифицировался, несмотря на то что на хроматограмме пики искомых веществ не наблюдались (рис. 2).
Для определения чувствительности приборного тандема была произведена серия измерений интенсивности пика бацитрацина А (С6бНю^70^+) массой 1422.757 при различных концентрациях раствора. На рис. 3 представлены данные этих экспериментов.
В области количеств бацитрацина А, отмеченной на рис. 3 штриховкой, хроматографиче-ский спектр отсутствует, т. е. такие количества вещества находятся ниже предела детектирования УФ-детектора хроматографа. Но при этом присутствует масс-спектр бацитрацина А. В незаштри-хованной области детектируются оба спектра.
68
А. В. НОВИКОВ, Р. А. БУБЛЯЕВ, Д. И. КОРНЕВ, Н. В. КРАСНОВ
Интенсивность
1ц иил у*,
152,1008
^ОД.
218,1746 3
2
195,1339
I 219,179
246.1824
187,1256 ■ хл 1Ъ „" _. ____
■ , 1120 ,/5',/ 221 .-228.011 24 251.0324
^ . Ц' у ,Л . .-'У I .■
269.04-?? 281.22 ■-и ......
120
140
160
180
200
220
240
260
230
зоо т / z
Рис. 1. Участок полного масс-спектра.
1 — парацетамол (151.2 Да), 2 — кофеин (194.2 Да), 3 — анальгин (333.1 Да), 4 — кодеин (299.4 Да)
Интенсивность
т / z
Рис. 2. Фрагмент полного масс-спектра смеси лекарств
Следует отметить, что для иных веществ эти облас- ти могут быть несколько сужены либо расширены.
ВЭЖХ-МС-АНАЛИЗ СВЕРХМАЛЫХ КОЛИЧЕСТВ.
69
ВЫВОДЫ
Таким образом, эксперименты показали, что отечественный приборный тандем (Милихром А-02—МХ 5310) позволяет идентифицировать отдельные компоненты смеси лекарственных препаратов на уровне 100 фмоль, — тем самым расширены возможности использования жидкостного хроматографа и ESI-масс-спектрометра.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали стандарты лекарственных веществ: кофеин (Sigma-Aldrich); образцы российской фармацевтической компании "Активный компонент" кетопрофен, диклофенак и ци-профлоксацин (чистота не менее 99.8 %); ацето-нитрил ("Криохром", сорт "0", Санкт-Петербург); муравьиную и трифторуксусную кислоты (Sigma-Aldrich).
Экспериментальные работы проводились на приборе МХ 5310, оборудованном электрораспылительным источником ионов (electrospray ionization, ESI) и времяпролетным масс-анализатором (TOF) с ортогональным вводом ионов, разработанном в Лаборатории биоме-
Рис. 3. Предел чувствительности тандема по ба-цитрацину А
дицинской масс-спектрометрии ИАП РАН. Все спектры получены в режиме детектирования положительных ионов.
Хроматографическое разделение проводилось на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 ("Эконова", Новосибирск) с использованием хроматографической колонки размером 2 х 75 мм, заполненной сорбентом Prontosil AQC18.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Барам Г.И., Рейхарт Д.В., Гольдберг Е.Д. и др. Новые возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармакопейном анализе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 135, № 1. С. 75-79.
2. Новиков А.В., Назимов И.В., Русанов В.А. и др. Контроль производства генно-инженерного инсулина человека с помощью тандема "микроколоночный жидкостный хроматограф— масс-спектрометр" в режиме прямого ввода образца // Научное приборостроение. 2004. Т. 14, № 2. С. 109-116.
3. Миргородская О.А., Козьмин Ю.П., Новиков А.В. и др. Способ получения изотопно-модифицированных пептидов и белков. Патент РФ № 2399627 от 20 сентября 2010 г., приоритет изобретения от 13 февраля 2008 г.
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург
Контакты: Корнев Дмитрий Ильич, kornevdi@gmail.com
Материал поступил в редакцию 8.10.2010.
70
А. В. НОВИКОВ, Р. А. БУБЛЯЕВ, Д. И. КОРНЕВ, Н. В. КРАСНОВ
HPLC-MS ANALYSIS OF ULTRA LOW QUANTITIES OF MEDICAL PRODUCTS
A. V. Novikov, R. A. Boubliaev, D. I. Kornev, N. V. Krasnov
Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg
By means of the instrument complex consisting of the time-of-flight mass-spectrometer МХ 5310 and the liquid chromatograph Milichrome A-02, the analysis of medical products composition was carried out. The possibility of sensitivity increasing chromato-mass spectrometric analysis of medical compounds in comparison with chromatographic analysis is shown.
Keywords: medical product analysis, liquid chromatograph—mass-spectrometer, sensitivity increasing
