CC BY
447
УДК 543.257.063
И. А. Салахов, С. Ю. Гармонов, Р. Н. Исмаилова,
Н. Г. Николаева, С. М. Горюнова
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА АНТИГРИППИНА МЕТОДОМ ГРАДИЕНТНОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
Ключевые слова: лекарственные формы, аскорбиновая кислота, парацетамол, хлорфени-рамина малеат, 4-аминофенола, высокоэффективная жидкостная хроматография. drugs, ascorbic acid, paracetamol, chlorphenamine maleate, 4-aminophenol, high performance liquid
chromatography.
Выявлены условия одновременного количественного определения компонентов лекарственного препарата антигриппина методом градиентной ВЭЖХ. Предложенная методика с высокой чувствительностью и экспрессностью обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов количественного определения действующих веществ аскорбиновой кислоты, парацетамола, хлорфенирамина малеата, нормируемой токсичной примеси 4-аминофенола, вспомогательного вещества сахарината натрия в шипучих таблетках антигриппина. Discovered conditions of simultaneous quantitative determination components of antigrippin drugs by gradient HPLC. Offered method has high sensitivity and expressivity, ensure accurate and reproducible results of quantitative analysis active matters of ascorbic acid, paracetamol and chlorphenamine maleate, toxic related substances 4-aminophenol, and subsidiary matter saccharin sodium in effervescent antigrippin tablets.
Современные средства для лечения простуды и гриппа являются многокомпонентными лекарственными формами. В состав этих препаратов входят жаропонижающие, анальгезирующие, антигистаминные компоненты и лекарственные вещества, влияющие на обменные процессы, комбинированный состав которых обуславливает эффективное устранение основных простудных симптомов при гриппе и острых респираторно-вирусных заболеваниях [1]. К числу таких широко востребованных в лечебной практике средств относятся шипучие таблетки антигриппина для детей и взрослых [2]. Их состав включает наряду с несколькими действующими веществами, такими как, парацетамол, аскорбиновая кислота и хлофенирамина малеат, также и большое число вспомогательных ингредиентов: натрия гидрокарбонат, лимонная кислота, сорбитол, повидон, натрия сахаринат, натрия карбонат, макрогол, натрия лаурилсульфат, ароматизаторы. По этой причине затруднительно одновременное определение всех действующих компонентов и примесей антигриппина, при этом необходимо использование предварительных трудоемких операций отделения анализируемых веществ, что обуславливает многостадийность анализа в целом, снижает его экспрессность и экономичность [3,4].
В тоже время проблема обеспечения и контроля качества этих лекарственных форм весьма актуальна из-за наличия сильнодействующего компонента (хлофенирамина малеат), большой разницы в содержании действующих веществ в десятки и сотни раз, а также необходимости обязательного количественного определения нормируемых токсичных примесей - 4-аминофенола как исходного продукта при синтезе парацетамола. В настоящее время в фармацевтическом анализе метод ВЭЖХ занимает ключевую роль в контроле качества многокомпонентных препаратов в силу ряда преимуществ в анализе сложных смесей, высокой точности и экспрессности [5]. Описанные в нормативной документации
ВЭЖХ методики анализа антигриппина совместимы с рядом трудностей, поскольку количественное содержание активных компонентов действующих веществ в лекарственных формах сильно различается, применяется несколько элюирующих смесей и не решается проблема одновременного определения активных ингредиентов и примесей [3,4]. В состав антигриппина также входят вещества, трудно удерживаемые на широко используемых колонках с привитой фазой С18 и имеется в наличии широкий состав вспомогательных веществ, которые важно учитывать при определении показателя посторонних примесей.
В связи с этим целью настоящей работы явилась разработка экспрессной и доступной для практики фармацевтического анализа методики определения компонентов антигриппина методом градиентной ВЭЖХ.
Экспериментальная часть
Исследования проводили на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы "Schimadzu" (Япония), состоящего из насоса для создания градиента высокого давления (LC-20AB), термостата колонок (CTO-20A), инжектора «Реодайн», вакуум-дегазатора, последовательно соединенных диод-но-матричного (SPD-M 20A) и флуоресцентного (КР-10АХ1) детекторов. Обработку данных и запись хроматограмм осуществляли на персональном компьютере с помощью программного обеспечения LC Solution версии 1.22. Разделение проводили на колонке с обращенной фазой Symmetry С18 (4,6 мм х 150 мм х 5 мкм) с предколонкой Symmetry С18 (3,9 мм х 20 мм х 5 мкм). Подвижная фаза: канал А - 0,05% раствор трифторуксусной кислоты в воде, канал В - ацетонитрил, работа насоса осуществлялась по следующей программе: изократический режим элюирования в течении 3 минут соотношение каналов А/В= 99,8/0,2; прямолинейный градиент в течении 10 минут, в результате которого содержание канала В достигало 55%, затем изократический режим элюирования в течении 2 минут при соотношении каналов А/В= 55/45. Время уравновешивая колонки между циклами программы составляло 5 минут при начальном соотношении каналов программы. Аналитические определения проводили в следующих условиях: скорость потока - 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл, температура термостата колонки 30 0С.
Для приготовления элюентов использовали ацетонитрил ос.ч, метанол марки для хроматографии и сверхчистую воду, полученную на установке MilliporWaters (США) из бидистилирован-ной воды. В качестве стандартов определяемых лекарственных веществ использовали субстанции аскорбиновой кислоты, парацетамола, хлорфенирамина малеата фармакопейной чистоты.
Методика выполнения анализа. Для приготовления анализируемого раствора измельчают и растирают 5 таблеток антигриппина. Отвешивают 0,3 г (точная навеска) порошка растертых таблеток, растворяют в деионизированной воде и переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, энергично встряхивают, обрабатывают ультразвуком 5 мин и доводят водой до метки. Перед вводом в колонку пробы фильтруют через мембранный фильтр с размером частиц 0,45 мкм. По 20 мкл исследуемого раствора и раствора стандартного образца с помощью микрошприца вводят в хроматограф. Массу определяемых веществ (в г) в одной таблетке вычисляют по формуле:
Хг =(Са АстМ К)/(СстАа),
где: Са - средняя концентрация по градуировочной зависимости или площадь пика соответствующих веществ в исследуемых образцах; Аст - навеска соответствующих стандартных образцов; Сст -средняя концентрация по градуировочной зависимости или площадь пика соответствующих веществ в стандартных образцах; Аа - масса навески исследуемого образца; М - средняя масса таблетки, найденная из массы 20 таблеток; К - коэффициент разбавления 0,0025; 0,5; 0,01; 0,1 для 4-аминофенола, парацетамола, хлорфенирамин малеата, аскорбиновой кислоты соответственно.
Результаты и их обсуждение
В предварительных исследованиях на основании данных диодно-матричного детектора получены результаты по интенсивности светопоглощения определяемых соединений
в интервале длин волн 190-600 нм. При этом максимумы поглощения аскорбиновой кислоты регистрировались при длине волны 242 нм, парацетамола - 243 нм, хлорфенирамина малеата - 263 нм. Длина волны 290 нм приемлема для определения парацетамола для снижения интенсивности отклика. В случае многоволнового детектирования или работы с переключением длин волн можно рекомендовать данные максимумы поглощения в качестве аналитических длин волн. Идентификацию определяемых веществ проводили по параметрам удерживания и спектрам поглощения, предварительно определенным на стандартных растворах. Для 4-аминофенола оптимальные параметры флуоресцентного детектора составили: длина волны возбуждения 260 нм, эмиссии 340 нм.
В процессе работы выполнена оптимизация пробоподготовки и хроматографиче-ских условий разделения. Как показали проведенные эксперименты, для полного извлечения компонентов таблеток антигриппина достаточна их обработка водой с последующим воздействием ультразвуком. При выборе и обосновании условий хроматографического разделения мы использовали достоинства градиентного элюирования: сокращение общего времени анализа, улучшение разделения всей смеси и формы пиков, увеличение чувствительности для компонентов смеси, выходящих из колонки позже других. В связи с этим был использован метод обращено - фазной ВЭЖХ в режиме линейного градиента с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила и 0,05%-ного раствора трифторуксусной кислоты. Линейная форма градиента выбрана потому, что показана ее максимальная эффективность для обращено-фазных хроматографических систем с использованием ацетонитрила в качестве органического модификатора подвижной фазы. Повышенные требования к качеству растворителей при использовании градиентного режима позволяют уменьшить число и величину мешающих системных пиков на хроматограммах. Кроме того, применение высокочистых растворителей значительно продляет срок службы дорогостоящих хроматографических колонок, особенно при серийном фармацевтическом анализе. Типичная хроматограмма смеси анализируемых соединений приведена на рис 1-4.
Рис. 1 - Хроматограмма разделения активных веществ: 1 - 4-аминофенол 0,25 мкг/мл; 2 - аскорбиновая кислота 100 мкг/мл. Подвижная фаза: смесь 0,2 % -ацетонитрил и 99,8% - 0,05% водного раствора трифторуксусной кислоты. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны возбуждения 260 нм, эмиссии 340 нм
При этих условиях хроматографирования время удерживания последнего компонента составляет 12 минут. При этом показана возможность количественного анализа трудноудер-живаемой примеси 4-аминофенола в присутствии аскорбиновой кислоты на колонке Symmetry С18 одновременно с количественным определением действующих веществ працета-мола, аскорбиновой кислоты и хлорфенирамина малеата.
mAU
400: 2 1
300-
200-
100- 3 { 1
■ i i 1 i i i i 1 5.0 10.0 i i i min
Рис. 2 - Хроматограмма разделения действующих веществ: 1 - аскорбиновая кислота 100 мкг/мл; 2 - парацетамол 500 мкг/мл; 3 - хлорфенирамина малеат. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,05% водный раствор трифторуксусной кислоты, градиентный режим элюирования. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны детектирования 263 нм
Рис. 3 - Хроматограмма антигриппина: 1 - аскорбиновая кислота 100 мкг/мл; 2 - парацетамол 500 мкг/мл; 3 - сахаринат натрия; 4 - хлорфенирамина малеат 6 мгк/мл. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,05% водный раствор трифторуксусной кислоты, градиентный режим элюирования. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны детектирования 263 нм
Рис. 4 - Хроматограмма антигриппина: 1 - аскорбиновая кислота 100 мкг/мл; 2 - парацетамол 250 мкг/мл; 3 - сахаринат натрия; 4 - хлорфенирамина малеат 5 мгк/мл. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,05% водный раствор трифторуксусной кислоты, градиентный режим элюирования. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Длина волны детектирования 263 нм
За основу валидации методики взяты представленные в литературе рекомендации [6,7]. Достоверность результатов аналитического определения доказывается определением пригодности хроматографической системы и установлением критериев специфичности, правильности, точности, линейности диапазона количественного определения лекарственных веществ.
Данные по оценки пригодности хроматографической системы представлены в табл. 1. Как видно, при подобранных условиях разделения достигаются оптимальные значения времени удерживания компонентов, числа теоретических тарелок и симметрии пика. Хороший результат разделения компонентов смеси, достигнутый в предлагаемых условиях, отражается в и разрешающей способности. При этом значения коэффициентов разрешения (К3) для двух соседних пиков указывают на хорошее разделение соответствующих веществ.
При указанных рабочих условиях проведения анализа линейные, хорошо воспроизводимые градуировочные зависимости интенсивности сигнала (высота пика) - содержание определяемого вещества в записываются в виде уравнений:
для парацетамола З(тЛи-в) = 95417 Сх(мкг/мл) + 9805 (г = 0,9997, П = 15); для аскорбиновой кислоты З(тЛи-в) = 22650 Сх(мкг/мл) + 1584 (г = 0,9996, П = 12); для хлорфенирамина малеата З(тЛи-в) = 23927 Сх(мкг/мл) - 1793 (г = 0,9997, П = 14); для 4-аминофенола З(тЛи-в) = 319376 Сх(мкг/мл) - 9833 (г = 0,9999, П = 16); для сахарината натрия З(тЛи-в) = 10445 Сх(мкг/мл) - 1008 (г = 0,9995, П = 14). Пределы обнаружения составляют для парацетамола, аскорбиновой кислоты, хлор-фенирамина малеата, 4-аминофенола и сахарината натрия 0,2 мкг/мл; 0,5 мкг/мл; 0,4 мкг/мл 0,03 мкг/мл; 0,6 мкг/мл соответственно при интервале определяемых содержаний действующих и вспомогательных веществ 4 мкг/мл - 600 мкг/мл.
Таблица 1 - Оценка пригодности хроматографической системы (П=9)
Определяемое Время Симметрия Число Разре RSD% RSD%
соединение выхода, мин пика теоретических тарелок шение 1 выхода пика Б пика
4-Аминофенол 2,28 1,42 2300 - 0,18 0,31
Аскорбиновая кислота 2,81 1,21 6902 2,62 0,17 0,58
Парацетамол 10,58 1,16 183119 55 0,21 0,26
Хлорфенирамина малеат 12,35 1,14 299971 8,8 0,25 0,41
Критерий приемлемости 0,8 - 2,0 2000 Не менее 1,5 Не более 2 Не более 2
Показатели пригодности хроматографической системы приведены в табл. 1. Специфичность методики оценивалась по совпадению времен удерживания анализируемых компонентов с соответствующими стандартами и по доказательству отсутствия влияния действующих и вспомогательных веществ на аналитические определения. При этом точность метода описывается метрологическими характеристиками в соответствии с рекомендациями фармакопеи [8]. Результаты воспроизводимости оценивались при многократном анализе однородного аутентичного образца (табл. 2). На основании вышеизложенных данных можно утверждать, что диапазон 80% - 120% от номинально испытуемой концентрации (количества препарата) обеспечивает необходимые значения правильности, точности и линейности. Предварительно установлено, что вспомогательные вещества, входящие в состав таблеток, определениям не мешают.
Таблица 2 - Метрологические характеристики аналитических определений компонентов антигриппина методом ВЭЖХ (Р=95, П=9)
Определяемое соединение 1 Б2 Б Бх. Т(Р,1) Хср (мкг/мл) Л X ¡ (мкг/мл) Л Хср (мкг/мл) £ор,%
Парацетамол 8 2,9496 1,7174 0,5724 2,36 500,34 4,053 1,351 0,27
Аскорбиновая кислота 8 5,6827 2,3838 0,7946 2,36 98,13 5,625 1,875 1,91
Хлорфенирамин малеат 8 0,0312 0,1766 0,0588 2,36 6,084 0,416 0,138 2,28
Экспериментально возможность хроматографического определения отдельных компонентов антигриппина в анализируемых смесях проверена в различных модельных и готовых лекарственных формах (табл. 3,4). Оценка правильности подтверждается результатами анализа модельных смесей, представленных в табл. 4.
Таблица 3 - Результаты определения действующих веществ антигриппина в модельных смесях (п=3)
Определяемое соединение, мкг/мл Ведено аналита, мкг/мл Найдено, мкг/мл Оценка откры-ваемости аналита, %
Парацетамол 501,8 503,2 100,27
Хлорфенирамин малеат 6,06 6,14 101,32
Аскорбиновая кислота 100,7 98,7 98,01
4-Аминофенол 0,275 0,289 105,09
Сахаринат натрия 61,4 62,1 101,14
Парацетамол 504,6 506,3 100,33
Хлорфенирамин малеат 10,11 10,26 101,48
Аскорбиновая кислота 198,1 195,7 98,78
4-Аминофенол 0,241 0,256 94,14
Сахаринат натрия 30,29 30,85 101,84
Таблица 4 - Результаты анализа таблеток антигриппина (промышленная серия 02060607) (п=5, Р = 0,95)
Компоненты Норма по НД, мг Хср Б Бх. А Хср £ер, %
Парацетамол 237,5-262,5 248,3 1,92 0,86 2,38 0,96
Хлорфенирамина малеат 2,7-3,3 3,06 0,052 0,023 0,0646 2,11
Аскорбиновая кислота 46,25-53,75 48,86 1,42 0,64 1,77 3,61
Сахаринат натрия 30,00 29,21 0,89 0,40 1,11 3,7
4-Аминофенол Не более 0,1 % (0,25 мг) 0,0006 0,00004 0,0000178 0,0000497 8,28
Таким образом, предложенная методика анализа обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов совместного обнаружения и количественного определения действующих веществ аскорбиновой кислоты, парацетамола, хлорфенирамин малеа-
та и примеси 4-аминофенола, а также вспомогательного вещества сахарината натрия в шипучих таблетках антигриппина для детей и для взрослых.
Литература
1. Смирнов, В.С. Современные средства профилактики гриппа и орви / В.С. Смирнов. - С.-П.: Фарминдекс, 2004. - С. 15-16.
2. Зайченко, Е.А. //Фармацевтический вестник. - 2008. - № 36. - С. 10-11.
3. НД 42-14117-06. Антигриппин. Таблетки шипучие для взрослых.
4. НД 42-14116-06. Антигриппин. Таблетки шипучие для детей.
5. Шатц, В.Л. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии / В.Л. Шатц, О.В. Сахартова. - Рига: Зинатне, 1988. - 390 с.
6. The United States Pharmacopeia (USP27-NF22), Validation of compendial methods. 2004. №7. British Pharmacopoeia, Appendix III D, Liquid chromatography.
7. Государственная фармакопея СССР. Выпуск 2. Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.
© И. А. Салахов - асп. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ; С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. той же кафедры, Р. Н. Исмаилова - канд. хим. наук, доцент той же кафедры; Н. Г. Николаева - канд. хим. наук, доцент той же кафедры; С. М. Горюнова - канд. хим. наук, доцент той же кафедры. E-mail: serggar@mail.ru
