CC BY
249
ПРИКЛАДНАЯ ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ
УДК 615.1; 543.257.063
С. Ю. Гармонов, И. А. Салахов, Г. Р. Нурисламова,
Р. Н. Исмаилова, Э. А. Иртуганова, В. Ф. Сопин
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ВЛИЯЮЩИХ
НА ОБМЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография, метаболики,
контроль качества.
Установлены условия хроматографического разделения смеси водорастворимых витаминов в обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработана методика количественного определения мета-боликов в лекарственных формах и смывах с технологического оборудования.
Keywords: high performance liquid chromatography, metabolic, quality assurance.
Conditions of chromatographic separations of a mix of water-soluble vitamins in the turned-phase high performance liquid chromatography are established. The technique of quantitative definition of the metabolics in medicinal forms and washouts from the process equipment is developed.
Метаболики являются биологически активными соединениями, влияющими на течение различных обменных процессов в организме человека. Лекарственные средства (ЛС) на их основе получили широкое применение в фармацевтической практике [1,2]. В их состав могут входить водорастворимые витамины: Bi (тиамин), B2 (рибофлавин), Вб (пири-доксин), C (аскорбиновая кислота) и PP (никотиновая кислота, ниацин; никотинамид). Для фармацевтического анализа витаминсодержащих ЛС весьма актуально использовать производительные, экспрессные, универсальные и надежные методики анализа. К таким методам в полной мере относится высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая за последние десятилетия во многом определила заметный прогресс в контроле качества ЛС.
Однако более широкое использование ВЭЖХ в практике рутинного фармацевтического анализа ограничено отсутствием унифицированных подходов к созданию методик анализа. В настоящее время для определения каких-либо лекарственных веществ (ЛВ) и примесей в них применяются свои аналитические процедуры подготовки проб и методики ВЭЖХ анализа, которые в каждом конкретном случае предписывают использование разных колонок, подвижных фаз (ПФ) и детекторов. Очевидно, что эти обстоятельства приводят к необходимости каждый раз изменять параметры хроматографической системы и осуществлять ее калибровку, что, в конечном итоге, значительно увеличивает продолжительность всего анализа, требует высокой квалификации персонала и, наконец, существенно повышают стоимость анализа.
Один из возможных путей решения этой проблемы - разработка максимально унифицированных, экономичных и экспрессных методик подготовки пробы и хроматографи-ческих процедур. Реализация такого подхода, очевидно, позволит снизить расходы на проведение контроля и более широко внедрить ВЭЖХ в практику фармацевтического анализа.
В процессе разработки и оптимизации ВЭЖХ методик анализа поливитаминных препаратов необходимо учитывать сложность подбора ПФ для приемлемого разделения, поскольку ряд ЛВ обладают близкими хроматографическими свойствами; способность водорастворимых витаминов слабо удерживаться на наиболее распространенных гидрофобных фазах; необходимость использования ион-парных реагентов на основе алкилсульфо-натов для повышения эффективности разделения и улучшения формы пиков [3,4].
В связи с этим целью настоящей работы явилась разработка экспрессной и доступной для практики фармацевтического анализа методики определения аскорбиновой кислоты, тиамина, рибофлавина, никотинамида и пиридоксина в витаминсодержащих препаратах методом градиентной ВЭЖХ.
Экспериментальная часть
Исследования проводили на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы "Schimadzu" (Япония), состоящем из насоса для создания градиента высокого давления (LC-20AB), термостата колонок (CTO-20A), инжектора «Реодайн», вакуум-дегазатора, последовательно соединенных диод-но-матричного (SPD-M 20A) и флуоресцентного (RF-10AX1) детекторов. Обработку данных и запись хроматограмм осуществляли на персональном компьютере с помощью программного обеспечения LC Solution версии 1.22. Разделение проводили на колонке с обращенной фазой Discovery RP Amide C16 180-5; 4.6*250 мм. Элюенты: фаза А - смесь 0,02 M Na2HPO4 и H3PO4, pH 2,3, фаза Б -ацетонитрил, работа насоса осуществлялась по программе, приведенной в табл. 1. Аналитические определения проводили в следующих условиях: скорость потока - 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл, температура колонки 35 0С. Таблица 1 - Режим градиентного элюирования
Время, Скорость пото- Элюент А: 0,02 M Na2HPO4 - H3PO4, Элюент Б: аце-
мин ка, мл/мин pH 2,3 , % тонитрил, %
0-5 1 99,8 0,2
5-8 1 99,8^ 30 0,2 ^ 70
8 - 14 1 30 70
14 - 20 1 99,8 0,2
Для приготовления элюентов использовали ацетонитрил для хроматографии ос.ч. сорт 0 (Криохром, Санкт-Петербург), ацетонитрил "Lab-scan" марки Ultra Gradient (Ирландия) и сверхчистую воду, полученную на установке MilliporWaters (США) из бидистилированной воды. В качестве стандартов определяемых веществ использовали стандартные образцы анализируемых веществ (Fluka и Sigma), а также вспомогательные вещества, входящие в состав таблеток - фармакопейной чистоты.
Методика выполнения анализа. Для приготовления анализируемого раствора измельчают и растирают анализируемые таблетки. Отвешивают 0,3 г (точная навеска) порошка растертых таблеток, растворяют в деионизированной воде и переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, энергично встряхивают, обрабатывают ультразвуком 5 мин и доводят водой до метки. Перед вводом в колонку пробы фильтруют через мембранный фильтр с размером частиц 0,45 мкм. По 20 мкл исследуемого раствора и раствора стандартного образца с помощью микрошприца вводят в хроматограф. Массу определяемых веществ в одной таблетке вычисляют по формуле:
Х =( Sk тст mc)/( Sct тн),
где Бк и Бс-г - средние значения площадей пиков определяемых компонентов на хроматограммах испытуемого и стандартного образца соответственно; тсг, тс, тн - масса стандарта определяемого вещества в растворе стандартного образца, средняя масса таблетки и масса навески растертых таблеток, взятой для приготовления испытуемого раствора соответственно в граммах.
Результаты и их обсуждение
При выборе аналитических длин волн руководствовались электронными спектрами поглощения анализируемых соединений, полученных с помощью диодно-матричного детектора непосредственно в условиях разделения в хроматографической системе. На рис. 1 представлены спектры поглощения ЛВ в ПФ, применяемой для разделения смеси витаминов.
200 300 400 500
Рис. 1 - Спектры поглощения витаминов С - (I), В1 - (II), Вб - (III), РР - (IV), В2- (V), по данным диодно-матричного детектора в подвижной фазе состава: 0,02 М МЭ2НР04 - Н3Р04, рН 2,3 - ацетонитрил
В процессе работы выполнена оптимизация пробоподготовки и хроматографиче-ских условий разделения. Как показали проведенные эксперименты, для полного извлечения компонентов таблеток достаточна их обработка водой при температуре 50 °С с последующим воздействием ультразвуком.
Анализируемые витамины, наряду с присущей им высокой гидрофильностью, являются ионогенными соединениями. На удерживание и разделение таких соединений
большое значение оказывает рН ПФ и вид применяемого сорбента. При низких значениях рН ПФ на колонках с обращенными фазами С18 и С8 водорастворимые витамины С, Bi, Вб и РР имеют невысокие значения коэффициента емкости и недостаточную степень разделения некоторых пар витаминов (таких как, Bi и С; РР и Вi; PP и С). Эти условия определения не совсем удобны для разделения водорастворимых витаминов, что связано с получением высокогидрофильных ионогенных форм тиамина и никотинамида и, в меньшей степени, пиридоксина в кислой среде, что приводит к уменьшению их удерживания на колонке. Для аскорбиновой кислоты при низком значении рН гидрофобность ее несколько повышается и значение времени удерживания этого вещества смещается в диапазон элюи-рования другой части витаминов, что приводит к наложению пиков и низкой эффективности разделения. При этом витамины, находящиеся в пробе в относительно высоких концентрациях по сравнению с остальными (обычно С и РР) выходят широким пиком, что создает дополнительные трудности для определения остальных компонентов, особенно имеющих полосы поглощения в более коротковолновой области с низким значениями коэффициента экстинкции (например, тиамин при максимуме поглощения 245 нм). В связи с этим получение приемлемых времен удерживания на фазах С18 и С8 достигается только с использованием элюентов с незначительным содержанием органического растворителя или при 100%-ном содержании водного компонента.
Приемлемую для количественных определений степень разделения анализируемых витаминов удалось получить на колонке «Discovery RP Amide С16». Полярные амидные группы данной неподвижной фазы выполняют роль электростатического барьера между свободными, незамещенными гидроксильными группами силикагеля, отталкивая заряженные молекулы анализируемых соединений. При этом снижается взаимодействие компонентов, имеющих кислотно-основные свойства, с активными центрами поверхности сили-кагеля, что приводит к улучшению формы пика и селективности, отличной от общепринятых фаз С18. В соответствии с предполагаемым поведением удерживание витаминов с основными свойствами (Bi и РР) уменьшилось, однако, регистрировалось их полное разделение по сравнению с фазой С18. Коэффициент емкости для аскорбиновой кислоты при этом увеличился, что привело к изменению порядка элюирования аскорбиновой кислоты после витаминов Bi и РР. Хроматограммы смеси анализируемых соединений приведены на рис. 2. Использование предлагаемых условий разделения на других обращенных фазах С18 (Symmetry, Discovery SH) приводило к изменению порядка элюирования веществ, при этом наблюдалось неприемлемое для анализа разделение анализируемых соединений.
За основу валидации методики взяты представленные в литературе рекомендации [5,6]. Достоверность результатов аналитического определения доказывалась определением пригодности хроматографической системы и установлением критериев специфичности, правильности, точности, линейности диапазона количественного определения лекарственных веществ. Данные по оценки пригодности хроматографической системы представлены в табл. 2. Как видно, при подобранных условиях разделения достигаются оптимальные значения времени удерживания компонентов и симметрии пика. Хороший результат разделения компонентов смеси, достигнутый в предлагаемых условиях, отражается и в разрешающей способности. При этом точность метода описывается метрологическими характеристиками в соответствии с рекомендациями фармакопеи [7]. Аналитические характеристики методики при указанных выше рабочих условиях приведены в табл. 3. Результаты прецизионности оценивались при многократном анализе однородного аутентичного образца (табл. 4). Экспериментально возможность хроматографического определения отдельных витаминов проверена в препарате «Гексавит» (табл. 5).
Рис. 2 - Хроматограммы смеси витаминов (I) и в таблетках «Гексавит» (II): В1- 10 мкг/мл (1), РР - 75 мкг/мл (2), С - 350 мкг/мл (3), Вб - 10 мкг/мл (4), В2 - 10 мкг/мл (5). Условия градиентного элюирования приведены в табл. 1
Таблица 2 - Пригодность хроматографической системы (п=10)
Определяемое соединение Время удер-жива-ния, мин Симметрия пика Критерий разделения Критерий се-лектив-ности Фактор удерживания Бг, % 1 выхода пика Бг, % Б пика
Тиамин 3,08 1,24 - 0,000 0,539 0,21 0,34
Никотиновая кислота 3,96 1,08 7,730 1,815 0,978 0,18 0,45
Аскорбиновая кислота 4,40 1,01 2,867 1,228 1,201 0,20 1,88
Пиридоксин 5,03 1,16 3,525 1,259 1,512 0,22 0,29
Рибофлавин 12,7 1,12 55,782 3,544 5,361 0,31 1,88
Таблица 3 - Аналитические характеристики методики
Компонент Аналитическая длина волны, нм Диапазон определяемых содержаний, мкг/мл Наклон градуиро-вочной зависимости Ь Коэффициент корреляции
Тиамин 245 5 - 50 59272 1528 0,9991
Никотиновая
260 10 - 100 52133 1011 0,9995
кислота
Аскорбиновая 290 50 - 500 374 323 0,9981
кислота
Пиридоксин 290 1 - 50 56395 981 0,9992
Рибофлавин 445 1 - 50 49093 1035 0,9990
Таблица 4 - Прецизионность (сходимость и повторяемость) методики при анализе препарата «Гексавит»
Компонент Допустимое содержание, мг/таб Найдено (п=18) Сходимость п=6 Бг, % Повторяемость (второй день в течение месяца) п=6 Бг, % Повторяемость (третий день в течение месяца) п=6 Бг, %
Тиамин 2,0 ± 0,2 1,95 1,41 1,69 1,79
Рибофлавин 2,0 ± 0,2 2,08 0,79 1,32 1,25
Никотиновая 15,0 ± 0,2 15,35 0,65 0,71 0,95
кислота
Пиридоксин 2,0 ± 0,2 2,05 0,41 0,56 0,70
Аскорбиновая 70,0± 0,7 66,3 1,88 2,06 2,34
кислота
Таблица 5 - Анализ лекарственных форм витаминов промышленного изготовления (п=6)
Производитель Компонент Допустимое содержание, мг/таб. Найденное содержание, мг/таб. Sr
ОАО «Дальхим-фармпрепараты» Тиамин 2,0 ± 0,2 2,07 ± 0,19 0,07
Рибофлавин 2,0 ± 0,2 2,04 ± 0,15 0,06
Никотиновая кислота 15,0 ± 0,2 15,45 ± 1,15 0,06
Пиридоксин 2,0 ± 0,2 2,10 ± 0,18 0,07
Аскорбиновая кислота 70,0± 0,7 65,8 ± 7,34 0,09
ОАО «Уфавита» Тиамин 2,0 ± 0,2 2,02 ± 0,17 0,07
Рибофлавин 2,0 ± 0,2 1,98 ± 0,12 0,05
Никотиновая кислота 15,0 ± 0,2 15,30 ±1,14 0,06
Пиридоксин 2,0 ± 0,2 2,08 ± 0,15 0,06
Аскорбиновая кислота 70,0± 0,7 67,2 ± 6,1 0,08
Таким образом, предложенная методика анализа обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов количественного определения аскорбиновой кислоты, тиамина, рибофлавина, никотинамида и пиридоксина в лекарственных смесях на их основе.
Литература
1. Михайлов, И.Б. Витамины / И.Б. Михайлов. - Санкт-Петербург: Аст Сова, 2006. - 128 с.
2. Морозкина, Т.С. Витамины / Т.С. Морозкина, А.Г. Мойсеенко. - Минск: Асар, 2002. - 114 с.
3. Lochmuller, C.H. Ion-Pair Chromatography and Related Techniques / C.H. Lochmuller. - Boca Raton: CRC Press, 2010. - 201 p.
4. Шатц, В.Л. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии / В.Л. Шатц, О.В. Сахартова. - Рига: Зинатне, 1988. - С.390.
5. 5. The United States Pharmacopeia (USP27-NF22), Validation of compendial methods, 2004.
6. British Pharmacopoeia, Appendix III D, Liquid chromatography, 2005.
7. Государственная фармакопея СССР, выпуск 2, Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний, 11-е издание, МЗ СССР, Медицина, Москва, 1989. - С. 400.
© С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ, [email protected]; И. А. Салахов - асп. той же кафедры; Г. Р. Нурисламова -асп. той же кафедры; Р. Н. Исмаилова - канд. хим. наук, доц. той же кафедры; Э. А. Иртуганова -канд. хим. наук, доц. той же кафедры; В. Ф. Сопин - д-р хим. наук, проф. зав. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ.
