Кондуктометрический метод для контроля прироста микробной биомассы пробиотических микроорганизмов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 543.068.8: 615.077

КОНДУКТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ДЛЯ КОНТРОЛЯ ПРИРОСТА МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

А.П. Асташкина1, А.А. Бакибаев1, М.И. Демешева2

1ГОУ ВПО Национальный исследовательский Томский политехнический университет 2Филиал ФГУП "НПО "Микроген" Минздравсоцразвития России в г. Томск "НПО "Вирион"

E-mail: apa2004@mail.ru

CONDUCTOMETRIC METHOD FOR DETERMINING THE GROWTH OF PROBIOTIC MICROORGANISMS DURING CULTIVATION

A.P. Astashkm1, A.A. Bakibaev1, M.I. Demesheva2

Tomsk National Research Polytechnic University 2"Virion" - Tomsk Branch of the Federal State Unitary Company "Microgen"" Scientific Industrial Company for Immunobiological Medicines"

of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation

Показана целесообразность применения кондуктометрического метода для контроля стационарной фазы роста микробной биомассы пробиотических микроорганизмов (лакто- и бифидобактерий) в технологическом процессе. Предлагаемый метод позволяет более точно определить технологически важный момент перехода экспоненциальной фазы в стационарную фазу кривой роста микробной суспензии.

Ключевые слова: кондуктометрический метод, прирост микробной биомассы микроорганизмов, лактобактерии, бифидобактерии.

The study has demonstrated the feasibility of ranductometric method for determining stationary phase in the culture growth of probiotic microorganisms (lactobacteria, bifidobacteria) during cultivation. The given method provides a more accurate determination of the change from the exponential to the stationary phase in the diagram of the microbe suspension growth.

Key words: conductivity method, the growth of microbial biomass, lactobacteria, bifidobacteria.

Введение

Одна из основных задач периодического культивирования - остановить развитие популяции в начале стационарной фазы роста культуры, т.е. заставить клетки находиться неограниченно долго в желаемом состоянии [4]. Количество микроорганизмов в периодической культуре нарастает и останавливается либо из-за исчерпания субстрата, либо из-за ингибирования продуктами жизнедеятельности.

В процессе роста микробной биомассы в культуральной среде происходит накопление заряженных частиц, следовательно, кондуктометрический метод можно использовать для контроля прироста микробной биомассы в технологическом процессе.

Цель работы: исследование прироста микробной биомассы лактобактерий и бифидобактерий в процессе периодического культивирования кондуктометрическим методом.

Материал и методы

Исследования проводили в отделении производства бактерийных препаратов филиала ФГУП НПО “Микроген” Минздравсоцразвития в г Томск НПО “Вирион”.

Для определения электропроводности использовали прибор “Экспресс-анализатор метаболической активно-

сти биокатализаторов” [1].

Глубинное культивирование лактобактерий и бифидобактерий осуществляли в реакторе на казеиново-дрожжевой среде при температуре (37±1) °С, при постоянном перемешивании, подаче углеводных добавок и рН-стати-ровании в интервале от 5,5 до 6,0. Посевной материал вносили в питательную среду в объеме 20%. В качестве углеводной добавки в процессе культивирования лактобактерий и бифидобактерий использовали 40%-й раствор глюкозы и глюкозо-лактозной смеси (15% лактозы и 25% глюкозы) соответственно. Прирост микробной биомассы определяли с помощью стандарта мутности 10 ед. и коэффициента светорассеяния в зависимости от культуры. Параллельно содержание общего количества клеток лактобактерий и бифидобактерий определяли оптическим методом. Концентрацию живых микробных клеток - методом десятикратных разведений с последующим посевом на среду МРС - IV и Блаурокка.

Результаты и обсуждение

Периодический процесс глубинного культивирования микроорганизмов играет важную роль в производстве пробиотических препаратов. В процессе роста микроорганизмов в жидкой питательной среде можно выделить несколько фаз, которые характеризуются определенной

Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 2, Выпуск 2

Рис. 1. Изменения удельной проводимости (1) и мутности (2) микробной суспензии лактобактерий штамма I. Р1аЫатш 8Р-А3 в процессе культивирования: ' - реактор 1, " - реактор 2

Рис. 2. Изменения удельной проводимости (1) и коэффициента светопропускания (2) микробной суспензии бифидобактерий штамма Еі/МоЬаавгіит ЫАМт в процессе культивирования: ' - реактор 1, " - реактор 2, - реактор 3

морфологией и физиологическим состоянием клеток [4].

На рисунках 1, 2 представлены полученные данные оптического метода и кондуктометрического, представляющие классические кривые роста Стокса с характерными фазами роста микробных клеток в процессе культивирования лактобактерий (рис. 1) и бифидобактерий (рис. 2).

Как видно из рисунка 1, первая фаза (лаг-фаза) характеризуется замедленным ростом популяции и продолжается 2 ч. Следующий период - экспоненциальная (логарифмическая) фаза (отрезок кривой от 3 до 11 ч). Эта фаза начинается после того, как клетки полностью адаптировались к заданным условиям и рост культуры не ограничивается ни недостатком питательных веществ, ни избытком продуктов обмена - скорость размножения клеток постоянна и максимальна.

Процесс кислотообразо-вания замедляется к 10 ч культивирования и остается в дальнейшем неизменным. Таким образом, к концу экспоненциальной фазы (11 ч культивирования) количество клеток достигает своего максимального значения, значение мутности и рН - стабильно и не меняется на протяжении 2-3 последних часов культивирования.

Известно [3], что выживаемость лиофилизиро-ванных микробных клеток зависит от фазы развития культуры: наибольшей устойчивостью к лиофилизации характеризуются культуры, взятые для сушки в конце экспоненциальной, начале стационарной фаз. На полученных кривых роста (рис. 1, 2) наглядно выражены граница окончания экспоненциальной и начало стационарной фаз. Таким образом, кондуктометрический метод показал высокую чувствительность к фиксированию оконча-

ния конца экспоненциальной фазы (начала стационарной фазы).

Между технологическими показателями (логарифмом мутности или коэффициента светопропускания) и удельной проводимостью наблюдается хорошая корреляционная зависимость (рис. 3, 4).

Известно, что повышение температуры увеличивает

^ мутности

Рис. 3. Корреляционная зависимость логарифма мутности и удельной проводимости микробной суспензии лактобактерий штамма Ь Plantarum 8Р-А3 (г=0,9837, р=0,000002)

«сО

4*0

3SO

■ ■

0.7: 0.76 OSO 0£> 0,88 O.SC 0.«

lg коэффициента светопропускания

Рис. 4. Корреляционная зависимость логарифма коэффициента светопропускания и удельной проводимости микробной суспензии бифидобактерий Bifidobacterium bifidum (r =-0,9874, p=0,00003)

удельную электропроводность за счет понижения вязкости раствора, уплотнения гидротированных ионов или увеличения степени диссоциации, в случае эндотермической реакции растворения электролита [2].

Кондуктометрический метод показал чувствительность к сбоям в технологическом процессе культивирования. На рисунке 2 показано, что в первом реакторе (1"') на 4-м ч роста при автоматической подачи аммиака в системе произошел сбой (в термостате увеличилась температура) и началось бурное кислотообразование молочной кислоты лактобактериями.

Заключение

Таким образом, кондуктометрический метод показал чувствительность к изменениям в технологическом процессе культивирования. Обоснована целесообразность применения кондуктометрического метода для контроля стационарной фазы роста микробной биомассы пробиотических микроорганизмов (лакто- и бифидобактерий) в технологическом процессе. Предлагаемый метод позволяет более точно определить технологически важный момент перехода экспоненциональной в стационар-

ную фазы кривой роста микробной суспензии.

Работа выполнена при поддержке программы проведение поисковой научно-исследовательской работы в рамках реализации ФЦП “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 2009-2013 гг. № 54П и “Научные и научно-педагогические исследования для государственных нужд” на 2009-2013 гг. № 480П.

Литература

1. Анализатор метаболической активности биокатализаторов: пат. 76340 Рос. Федерация. № 2008114221/22 ; заявл. 11.04.08 ; опубл. 20.09.08, Бюл. № 26. - 2 с.

2. Кутепов А.М. Экспериментальные методы химии растворов: денсиметрия, вискозиметрия, кондуктометрия и другие методы. - М. : Наука, 1997. - 351 с.

3. Несчисляев В.А., Семченко А.В., Моховикова В.Б. и др. Подготовка бактериальных культур к сублимационному высушиванию // Фундаментальные исследования. - 2007. -№ 12. - С. 368-369.

4. Петр С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М. : Мир, 1978. - 332 с.

Поступила 21.04.2011