CC BY
53
Клиническая медицина. 2016; 94(3) DOI 10.18821/0023-2149-2016-94-3-235-238
Заметки и наблюдения из практики
Заметки и наблюдения из практики
© АКПЕРОВА Г.А., 2016
УДК 616.681-007.21-06:616.69-008.811.4]-07
Акперова Г.А.
КОМПЛЕКСНАЯ ДИАГНОСТИКА В ОБСЛЕДОВАНИИ БОЛЬНЫХ С ГЕНОТИПОМ 47, ХХУ СИНДРОМА КЛАЙНФЕЛТЕРА
Бакинский государственный университет Министерства образования Азербайджанской Республики, Л2-1148, Баку, Азербайджанская Республика
Для корреспонденции: Акперова Гюнай Афизовна — канд. биол. наук, доц. каф. генетики и теории эволюции; [email protected]
С целью определения причины клинического полиморфизма синдрома Клайнфелтера проведены биохимический, гормональный, цитологический анализ и секвенирование CAG-повторов гена андрогенового рецептора. Установлено повышение уровня лютеинизирующего гормона (16,8 ± 4,2 Ед/л), фолликулостимулирующего гормона (22,7 ± 6,1 Ед/л), общего холестерина (6,8 ± 2,6ммоль/л), триглицеридов (3,3 ± 1,0 ммоль/л) и глюкозы (9,9 ± 3,8 ммоль/л), что свидетельствует о нарушении липидного и углеводного обмена. У 2/3 больных синдром Клайнфелтера ассоциировался с умственной отсталостью и психическими расстройствами. Больные с расщелиной неба и умственной отсталостью имели 45 CAG-повторов, с психосоциальными расстройствами — 43, без каких-либо ассоциаций — 38—40 повторов CAG-участков. Увеличение количества CAG-повторов прямо пропорционально психическому развитию, социальной адаптации, профессиональной деятельности и обратно пропорционально развитию мужских половых признаков.
Кл ючевые слова: CAG-повторы; андрогеновый рецептор; синдром Клайнфелтера.
Для цитирования: Акперова Г.А. Комплексная диагностика в обследовании больных с генотипом 47, ХХУ синдрома
Клайнфелтера. Клин. мед. 2016; 94 (2): 235—238. DOI 10.18821/0023-2149-2016-94-3-235-238
Akbarova G.A.
COMPREHENSIVE DIAGNOSTICS IN PATIENTS WITH GENOTYPE 47,XXY KLINEFELTER SYNDROME
Baku State University, Baku, Azerbajan
We undertook biochemical, hormonal, cytological analysis and sequencing CAG repetitions of androgen receptor gene in order to elucidate the cause of clinical polymorphism of Klinefelter syndrome. Elevated levels of LH (19.8 ± 4.2 E/l), FSH (22.7 ± 6.1 U/l), total cholesterol (6.8 ± 2.6 mmol/l), triglycerides (3.3 ± 1.0 mmol/l), and glucose (9.9 ± 3.8 mmol/l) suggested disturbances of lipid and carbohydrate metabolism. Two thirds of the patients had Klinfelter syndrome associated with mental retardation and psychic disorders. Patients with cleft palate and mental retardation and with psycho-social disorders had 45 and 43 CAG repetitions respectively, those without associations 38-40 repetitions. Increased frequency of CAG repetitions was directly proportional to the level of psychic development, social adaptation and professional activity but inversely proportional to the development of masculine sexual traits.
Key words: CAG repetitions; androgen receptor; Klinefelter syndrome.
Citation: Akbarova G.A. Comprehensive diagnostics in patients with genotype 47,XXY Klinefelter syndrome. Klin. med. 2016; 94 (3): 235—238 (in Russian). DOI 10.18821/0023-2149-2016-94-3-235-238
Correspondence to: Gyunay A. Akbarova - cand. biol. sci., associated prof., Dept. of Genetics and Theory of Evolution; e-mail: [email protected]
Received 11.05.15 Accepted 17.11.15
Диагностика многих неврологических нарушений в младшем возрасте, особенно тех, которые проявляются в пубертатном периоде, нередко бывает затруднена из-за нечетких клинических проявлений. Вследствие этого использование комплекса современных диагностических методов анализа вплоть до молекулярных исследований позволяет улучшить раннюю диагностику и прогноз заболевания у детей, что необходимо для построения адекватной терапии нарушений и их профилактики.
Нередко причиной возникновения неврологических нарушений являются дупликации генетических ло-кусов, в том числе и анеуплоидии половых хромосом,
для определения которых в последние годы изучается доза гена андрогенового рецептора, расположенного на Х-хромосоме (Xq11.2-q12). В норме, присутствуя во всех тканях организма, активный андрогеновый рецептор регулирует деятельность андрогеночувствительных генов, направляя развитие мужских половых признаков. Один из участков рецептора, известный как СЛО-участок, характеризуется повторами, любые мутации которых могут вести к нарушениям вплоть до неспособности рецептора связываться с андрогеном, в результате чего восприимчивость клеток к гормону уменьшается [1, 2].
В результате исследований, проведенных в ряде районов Азербайджанской Республики, среди пациентов
Clinical Medicine, Russian journal. 2016; 94(3) DOI 10.18821/0023-2149-2016-94-3-235-238
мужского пола с неврологическими нарушениями обнаружены больные с генотипом 47, XXY — классическим вариантом синдрома Клайнфелтера, характеризующимся фенотипической вариабельностью проявления. Установлено, что, несмотря на высокую частоту выявления, около 50% случаев остаются нераспознанными [3].
С целью определения причины клинического полиморфизма и определения возможной взаимосвязи между различием в фенотипическом проявлении синдрома Клайнфелтера и генетической модификацией гена ан-дрогенового рецептора нами проведен молекулярный анализ последнего путем секвенирования с использованием набора BigDye Terminator™.
Материал и методы
В качестве материала для анализов использованы образцы периферической либо капиллярной крови, собранные в пробирки с гепарином или ЭДТА, и соскобы слизистой оболочки щек, взятые стерильными ватными палочками.
Фосфолипиды и липиды экстрагировали и определяли по общепринятой методике [4, 5]. Продукты пере-кисного окисления липидов оценивали по методике Волчегорского [6]. Уровень лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), тестостерона, общего и конъюгированного сывороточного билирубина в крови определяли на аппарате Cobas integra 400 plus (Roche, Швейцария).
Буккальный тест, использованный при обнаружении телец Барра у больных с синдромом Клайнфелте-ра, заключался в определении полового хроматина в соскобах слизистой оболочки ротовой полости. Окрашивание проводили соответственно методу С.И. Доку-мова, А.В. Капустина [7].
ДНК экстрагировали из биологического материала (крови или соскобов слизистой оболочки щек) с помощью комплекта PureLink Genomic DNA MiniKit (Invitrogen, Life Technologies, США). Проверку качества/ концентрации ДНК, экстрагированной из крови, проводили при помощи NanoDrop 1000 Spectrophotometer, X 260/230 нм, X 260/280 нм (ThermoFisherScientific, США) соответственно протоколу [8]. Концентрацию ДНК, экстрагированной из слюны, проводили при помощи TheQuantiFluor™ dsDNASystem на спектрофотометре QuantiFluor™-ST Fluorometer (Pro-mega, США) соответственно протоколу [9].
Для амплификации гена андрогенового рецептора (анализ CAG-повторов) использовали раствор для полимеразной цепной реакции (ПЦР): 1 X Hotstar буфер (Qiagen GmbH, Germany), 2,5 ммоль MgCl2, 200 мкмоль каждого dNTP, 1 мкмоль F-праймера (5'-TCCAG AATCTGTTCCAGAGCGTGC-3'), 1 мкмоль R-праймера (5'-GCTGTGAAGGTTGCTGTTC CTCAT-3'), 0,5 ед. Hotstar Taq Plus (Qiagen, GmbH, Германия) и 2,5 нг геномной ДНК с финальным объемом 25 мкл. Этапы ПЦР:
Clinical notes and case reports
1) инициация денатурации — 95°C/5 мин; 2) 45 циклов термоциклирования, состоящего из трех шагов: 95°C 30 с, 56°C 45 с, 72°C 60 с, 3) финальный этап: 72°C 5 мин и охлаждение — 4 мин. Результаты ПЦР проверяли на 2% агарозном геле.
Секвенирование ДНК проводили с использованием Terminator Ready Reaction Mix of ABI PRISM® Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, v 2.0 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, США), на ABI PRISM™ 310 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, США) и ABI PRISM™ 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi, Япония); для анализа ответов использовали программу Sequencing Analysis, v. 1.1/3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, США).
С целью определения значимости различий сопоставляемых величин применяли критерий t Стьюден-та [10].
Результаты и обсуждение
На основании списков ВТЭК центральной районной больницы, а также путем цитогенетических и генеалогических методов мы выявили 9 человек в возрасте 24—29 лет с синдромом Клайнфелтера. Анализ кари-отипа в соскобах слизистой оболочки ротовой полости выявил присутствие тельца Барра и, следовательно, дополнительной Х-хромосомы, считающейся основным фактором в диагностике этого синдрома.
Согласно опросу родственников, выявленные больные опережали сверстников в росте. В подростковом периоде у них наблюдалась двусторонняя гинекомастия. Больные жаловались на боль в суставах, животе, спине, быструю утомляемость и пониженную работоспособность. Трое больных не имели каких-либо психических отклонений, у остальных зарегистрированы умственная отсталость, фациальные расщелины и психические расстройства.
В качестве контрольной группы обследованы 10 здоровых мужчин аналогичного возраста.
Гормональные и биохимические анализы показали высокий уровень ЛГ (16,8 ± 4,2 мЕд/л), ФСГ (22,7 ± 6,1 мЕд/л), общего холестерина (6,8 ± 2,6 ммоль/л) и триглицеридов (3,3 ± 1,0 ммоль/л), а также нарушение
Результаты гормональных и биохимических анализов у больных с синдромом Клайнфелтера (M ± m)
Показатель Норма Контрольная группа Больные с синдромом Клайнфелтера
ЛГ, мЕд/л 1,8—5,2 3,1 ± 0,9 16,8 ± 4,2
ФСГ, мЕд/л 2,9—8,2 4,6 ± 1,2 22,7 ± 6,1
Тестостерон, нг/дл 250—1100 512 ± 187 225 ± 112,5
Общий холестерин, ммоль/л 3,3—5,2 3,8 ± 1,1 6,8 ± 2,6
Триглицериды, ммоль/л 0,1—2,2 1,5 ± 0,09 3,3 ± 1,0
Глюкоза, ммоль/л 3,05—6,38 4,9 ± 1,3 6,1 ± 2,4
Глюкоза через 2 ч после еды, ммоль/л 4,2—6,4 5,8 ± 1,9 9,9 ± 3,8
Клиническая медицина. 2016; 94(3) DOI 10.18821/0023-2149-2016-94-3-235-238
Заметки и наблюдения из практики
толерантности к глюкозе, при которой уровень глюкозы повышался до 9,9 ± 3,8 ммоль/л при норме менее 7,8 ммоль/л. Таким образом, биохимические показатели свидетельствуют о нарушении липидного и углеводного обмена, что привело к абдоминальному ожирению, в результате которого обследованные больные при росте в среднем 188 см имели среднюю массу тела 121 кг.
Следует отметить, что предыдущие исследования также подтверждают ассоциацию синдрома Клайнфелтера с риском возникновения сахарного диабета и метаболического синдрома, а также с психическими нарушениями, социальной адаптацией и неспособностью или низкой способностью к обучению [11, 12].
Нами установлено, что у 3 больных с синдромом Клайнфелтера не выявлено каких-либо психосоциальных отклонений, тогда как у 6 синдром ассоциировался с умственной отсталостью (в одном случае в сочетании с расщелиной неба) и психическими расстройствами, такими как задержка речи и неспособность к обучению.
При более детальном осмотре выявленных больных врачом установлена фенотипическая вариабельность клинических проявлений. Так, у 6 больных с обнаруженными психическими отклонениями лобные и височные доли оказались значительно меньше по объему по сравнению с таковыми у здоровых людей и больных с синдромом Клайнфелтера без дополнительных отклонений. Кроме того, длина тела, в среднем составившая 188 см, варьировала от 180 до 195 см, соответственно длина рук и ног также оказалась неодинаковой.
У 3 больных без явных психических нарушений синдром Клайнфелтера до настоящих исследований не был распознан. Это согласуется с данными литературы, согласно которым примерно в 25% случаев синдром остается нераспознанным ввиду проявления фе-нотипических признаков после полового созревания и широкого спектра клинических проявлений [13]. Указанные больные были в возрасте 25, 28 и 29 лет, они состояли на учете у врачей в связи с ожирением, повышенным уровнем глюкозы (подозрение на сахарный диабет) и бесплодием. Учитывая последний факт, у пациентов ранее были сделаны анализы, которые показали азооспермию, однако кариотипирования не проводили.
Для выяснения причины различий фенотипического проявления синдрома у всех 9 пациентов проведен молекулярный анализ первого экзона гена андрогенового рецептора. Указанный ген состоит из 8 экзонов, первый из которых кодирует трансактивный домен, второй и третий — ДНК-связывающий домен, 5'-конец четвертого экзона — зависимый домен, 3'-конец четвертого экзона совместно с пятым и шестым экзонами кодирует лигандсвязывающий домен. При этом именно первый экзон содержит полиморфные повторы CAG, кодирующие полиглютаминовые цепи андрогенового рецептора.
Установлена взаимосвязь между различием числа повторов и экспрессией андрогенового CAG-рецептора (в среднем 20 повторов) [14]. В результате молекулярно-
го анализа установлено, что все 9 больных с синдромом Клайнфелтера имели дополнительные повторы. Так, установлено, что в норме CAG- участок повторялся в среднем 22 раза, у больных отмечено до 45 повторов. Больные с расщелиной неба и умственной отсталостью имели 45 повторов (рис. 1 см. на 3-й полосе обложки), больные с психосоциальными расстройствами — 43 повтора (рис. 2 см. на 3-й полосе обложки), больные без каких-либо ассоциаций — 38—40 повторов CAG-участков (рис. 3 см. на 3-й полосе обложки).
Полученные результаты объясняются тем, что рецепторы андрогена позволяют организму адекватно реагировать на андрогенные гормоны. Изменение действия гена андрогенового рецептора меняет направление развития мужских половых признаков. При любой мутации CAG-полиморфного сайта в первом экзоне гена, в том числе и при увеличении числа повторов, экспрессия изменяется и рецептор может потерять свойство связывания с гормоном. При пониженной транскрипционной активности чувствительность клеток к андрогену снижается либо вовсе теряется. При этом известно, что длина CAG-аллели обратно пропорциональна фенотипическим признакам у мужчин [15, 16].
Так, у обследованных больных обнаружены феноти-пические признаки синдрома Клайнфелтера, например гинекомастия и небольшие яички, параметры которых обратно коррелировали с длиной CAG-повторов. Обнаружена прямая связь между ростом и CAG-повторами: у больных с ростом 193—195 см количество CAG-повторов достигало 45 (3 больных), 189—191 см — 43 (3 больных), 184—186 см — 40 (2 больных), 180 см — 38 (1 больной).
Таким образом, чем короче CAG-аллель в гене ан-дрогенового рецептора, тем выше его транскрипционная активность и тем меньше фенотипическое проявление синдрома Клайнфелтера.
Кроме того, наблюдается четкая корреляция между количеством CAG-повторов и уровнем интеллекта. У больных с 45 повторами наблюдалась умственная отсталость (2 больных с умственной отсталостью и 1 больной с умственной отсталостью и расщелиной неба). У 3 больных с 43 CAG-повторами отмечены психосоциальные расстройства (проблемы с вербальной коммуникацией, учебой, исполнением поставленных задач, задержка речи).
Учитывая, что ген андрогенового рецептора находится на Х-хромосоме, которая в норме у мужчин имеется в единственном экземпляре, а у женщин одна из них инактивирована, естественно, что отсутствие лайонизации ведет к дополнительной экспрессии генов указанной хромосомы, связанных со структурными функциями головного мозга.
Кроме того, присутствие Pars-генов Y-хромосомы, имеющих аналоги или не имеющих аналогов в Х-хромосоме, в результате удвоения Х-хромосомы у больных с синдромом Клайнфелтера, увеличивающих дозу экспрессии, также влияет на фенотипическую вариабельность клинических проявлений заболевания
Clinical Medicine, Russian journal. 2Q16; 94(3) DOI 1Q.18821/QQ23-2149-2Q16-94-3-235-238
[17, 18]. Каждая дополнительная Х-хромосома связана с уменьшением IQ на 15—16 пунктов [19].
Заключение
Таким образом, фенотип больного с синдромом Клайнфелтера зависит от числа лишних Х-хромосом (в наших исследованиях — 47, XXY) и длины CAG-аллели (в наших исследованиях выявлено 38—45 CAG-повторов). Повышение этих показателей прямо пропорционально психическому развитию, социальной адаптации, профессиональной деятельности и обратно пропорционально развитию мужских половых признаков.
Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда развития науки при Президенте Азербайджанской Республики — Грант № EiF-Mob-2-2013-4(10)-13/06/3.
ЛИТЕРАТУРА
1. Cirigliano V., Ejarque M., Fuster C., Adinolfi M. X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod. 2002; 11: 1042—5.
2. Mark H.F.L., Feldman D., Sigman M. Conventional and molecular cytogenetic identification of a variant Klinefelter syndrome patient with a deleted X chromosome. Pathobiology. 1999; 67: 55—8.
3. Гусакова Д.А., Мсхалая Г.Ж., Титова Ю.А., Калинченко С.Ю. Опыт применения Небидо у пациента с синдромом Клайнфельтера. Ожирение и метаболизм. 2007; 2: 32—4.
4. Орел Н.М. Биохимия липидов: Практикум для студентов биологических факультетов. Минск: БГУ; 2007.
5. Aceatino L., Gavilan P. Phospholipids and bile acids as diffusional carriers of Na across nonpolar media. Hepatology. 1988; 4 (3): 893—8.
6. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Е.Г., Лифшиц Р.И. Вопр. мед. химии. 1989; (1): 127—31.
7. Капустин А.В. Судебно-медицинская диагностика пола по половым различиям в клетках. М.: Медицина; 1969.
8. NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer, V1.0 User Manual. Thermo Fisher Scientific Inc.; 2009.
9. Measuring the QuantiFluor™ dsDNA System Using the QuantiFluor™-ST Fluorometer, Application Note. Promega Corporation. 2005.
10. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. М.: Практика; 1999.
11. Bojesen A., Gravholt C.H. Klinefelter syndrome in clinical practice. Nat. Clin. Pract. Urol. 2007; 4: 192—204.
12. Lanfranco F., Kamischke A., Zitzmann M., Nieschlag E. Klinefelter's syndrome. Lancet. 2004; 364: 273—83.
13. Bojesen A., Juul S., Gravholt C.H. Prenatal and postnatal prevalence of Klinefelter syndrome: a national registry study. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003; 88: 622—6.
14. Quigley C.A., De Bellis A., Marschke K.B. et al. Androgen receptor defects: historical, clinical and molecular perspectives. Endocr. Rev. 1995; 16: 271—321.
15. Zinn A.R., Ramos P., Elder F.F. et al. Androgen receptor CAGn repeat length influences phenotype of 47,XXY (Klinefelter) syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005; (9): 5041—6.
16. Zitzmann M., Depenbusch M., Gromoll J., Nieschlag E. X-chromo-some inactivation patterns and androgen receptor functionality influence phenotype and social characteristics as well as pharmacogene-
Clinical notes and case reports
tics of testosterone therapy in Klinefelter patients. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2004; 89: 6208—17.
17. Geschwind D.H., Dykens E. Neurobehavioral and psychosocial issues in Klinefelter syndrome. Learn. Disabi. Res. & Pract. 2004; 19 (3): 166.
18. Iitsuka Y., Bock A., Nguyen D.D. et al. Evidence of skewed X-chro-mosome inactivation in 47, XXY and 48, XXYY Klinefelter patients. Am. J. Med. Genet. 2001; 98: 25—31.
19. Velissariou V., Christopoulou S., Karadimas C. et al. Rare XXY/XX mosaicism in a phenotypic male with Klinefelter syndrome: case report. Eur. J. Med. Genet. 2006; 49: 331—7.
REFERENCES
1. Cirigliano V., Ejarque M., Fuster C., Adinolfi M. X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies. Mol. Hum. Reprod. 2002; 11: 1042—5.
2. Mark H.F.L., Feldman D., Sigman M. Conventional and molecular cytogenetic identification of a variant Klinefelter syndrome patient with a deleted X chromosome. Pathobiology. 1999; 67: 55—8.
3. Gusakova D.A., Mskhalaya G.Zh., Titova Yu.A., Kalinchenko S.Yu. Experience of application of Nebido for the patient with Klaynfelter's syndrome. Ozhirenie i metabolizm. 2007; 2: 32—4. (in Russian)
4. Orel N.M. Biochemistry of Lipids: a Practical Work for Students of Biological facultars. Minsk: BGU; 2007. (in Russian)
5. Aceatino L., Gavilan P. Phospholipids and bile acids as diffusional carriers of Na across nonpolar media. Hepatology. 1988; 4 (3): 893—8.
6. Volchegorskiy I.A., Nalimov A.G., Yarovinskiy E.G., Lifshits R.I. Vopr. med. khimii. 1989; (1): 127—131. (in Russian)
7. Kapustin A.V. The Sex Judicial-Medical Diagnostics on Sexual Distinctions in Cells. Moscow: Meditsina; 1969. (in Russian)
8. NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer, V1.0 User Manual. Thermo Fisher Scientific Inc.; 2009.
9. Measuring the QuantiFluor™ dsDNA System Using the QuantiFluor™-ST Fluorometer, Application Note. Promega Corporation; 2005.
10. Glants S. Medical-biological Statistics. Moscow: Practica; 1999. (in Russian)
11. Bojesen A., Gravholt C.H. Klinefelter syndrome in clinical practice. Nat. Clin. Pract. Urol. 2007; 4: 192—204.
12. Lanfranco F., Kamischke A., Zitzmann M., Nieschlag E. Klinefelter's syndrome. Lancet. 2004; 364: 273—83.
13. Bojesen A., Juul S., Gravholt C.H. Prenatal and postnatal prevalence of Klinefelter syndrome: a national registry study. J. Clin. Endocri-nol. Metab. 2003; 88: 622—6.
14. Quigley C.A., De Bellis A., Marschke K.B. et al. Androgen receptor defects: historical, clinical and molecular perspectives. Endocr. Rev. 1995; 16: 271—321.
15. Zinn A.R., Ramos P., Elder F.F., et al. Androgen receptor CAGn repeat length influences phenotype of 47,XXY (Klinefelter) syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005; 9: 5041—46.
16. Zitzmann M., Depenbusch M., Gromoll J., Nieschlag E. X-chromo-some inactivation patterns and androgen receptor functionality influence phenotype and social characteristics as well as pharmacogenet-ics of testosterone therapy in Klinefelter patients. J. Clin. Endocri-nol. Metab. 2004; 89: 6208—17.
17. Geschwind D.H., Dykens E. Neurobehavioral and psychosocial issues in Klinefelter syndrome. Learn. Disabil. Res. & Pract. 2004; 19 (3): 166.
18. Iitsuka Y., Bock A., Nguyen D.D., et al. Evidence of skewed X-chro-mosome inactivation in 47, XXY and 48, XXYY Klinefelter patients. Am. J. Med. Genet. 2001; 98: 25—31.
19. Velissariou V., Christopoulou S., Karadimas C., et al. Rare XXY/ XX mosaicism in a phenotypic male with Klinefelter syndrome: case report. Eur. J. Med. Genet. 2006; 49: 331—7.
Поступила 11.05.15 Принята к печати 17.11.15
