CC BY
28
Комплексный клинико-лабораторный и молекулярно-генетический подход в исследовании фенотипической вариабельности синдрома Клайнфельтера
Г.А.Акперова
Бакинский Государственный Университет, г.Баку
Диагностика неврологических нарушений особенно в младшем возрасте нередко бывает затруднена вследствие нечеткой картины симптомов. Вследствие этого использование комплекса современных лабораторных методов исследования, позволяющих улучшить раннюю диагностику и прогноз повреждении нервной системы у детей, имеет важное значение для построения адекватной терапии церебральных нарушений и их профилактики.
Нередко причиной возникновения неврологических нарушений являются дупликации генетических локусов, в том числе и анеуплоидии половых хромосом, для определения которых в последние годы изучается доза гена андрогеново-го рецептора, расположенного на Х-хромосоме (Xq11.2-q12) [7; 11].
В результате исследований проведенных в ряде районов Муганской, Ширванской, Ленкора-нской и Гянджа-Казахской экономических регионов Азербайджанской Республики, среди пациентов мужского пола с неврологическими нарушениями обнаружены больные с синдромом Клайнфельтера, характеризующиеся фенотипи-ческой вариабельностью проявления, причиной чему чаще всего являются мутации и полиморфизм гена андрогенового рецептора.
С целью определения взаимосвязи между генетической модификацией данного гена и различием в клиническом проявлении синдрома Клайнфельтера, нами проведен молекулярный анализ гена андрогенового рецептора путем прямого секвенирования ДНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В качестве материала для анализов использованы образцы периферической либо капиллярной крови, собранные в пробирки с гепарином или ЭДТА, и соскобы слизистой оболочки щек, собранные стерильными ватными палочками.
Фосфолипиды и липиды экстрагировали и определяли по методике [3; 4]. Продукты ПОЛ оценивались по методике Волчегорского [1].
Уровень ФСГ, ЛГ, тестостерона, общего и конъ-югированного сывороточного билирубина в крови определяли на аппарате Cobas integra 400 plus (Roche, Switzerland).
Буквальный тест, использованный при обнаружении телец Барра у больных с синдромом Клайнфельтера, заключался в определении полового хроматина в соскобах слизистой оболочки ротовой полости. Окрашивание проводили соответственно методу С. И. Докумова [2].
ДНК экстрагировали из биологического материала (крови или соскобов слизистой оболочки щек) с помощью комплекта PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Life Technologies, USA).
Проверку качества/концентрации ДНК, экстрагированной из крови, проводили при помощи NanoDrop 1000 Spectrophotometer, ?=260/230 нм, ?=260/280 нм (Thermo Fisher Scientific, USA), соответственно протоколу [13]. Концентрацию ДНК, экстрагированной из слюны, проводили при помощи The QuantiFluor™ dsDNA System на спектрофотометре QuantiFluor™-ST Fluorometer (Promega, USA), соответственно протоколу [12].
Для амплификации гена андрогенового рецептора (анализ CAG-повторов) использовался ПЦР-раст-вор: 1 X Hotstar буфер (Qiagen GmbH, Germany), 2.5 мМMgCl2, 200 мкМ каждого dNTP, 1 мкМ F-прайме-ра (5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC-3), 1 мкМ R-праймера (5'-GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-3'), 0,5 ед. Hotstar TaqPlus (Qiagen, GmbH, Germany) и 2,5 нг геномной ДНК с финальным объемом 25 мкл. Этапы ПЦР: 1. Инициация денатурации - 95°C/5 мин, 2. 45 циклов термоциклирования, состоящего из трех шагов - 95°C/30 сек., 56°C/45 сек., 72°C/60 сек, 3. Финальный этап: 72°C/5 мин и охлаждение - 4 мин. Результаты ПЦР проверялись на 2% агарозном геле.
ДНК секвенирование проведено с использованием Terminator Ready Reaction Mix of ABI PRISM® Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, v 2.0 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems, USA), на ABI PRISMTM 310 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и ABI PRISMTM 3500xL Genetic Analyzer (AppliedBiosystems, Hitachi); для анализа ответов использована программа Sequencing Analysis, v. 1.1/3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, USA).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Согласно спискам ВТЭК ЦРБ в поселках г.Ширван Муга-нского региона обнаружено трое больных с синдромом Клайнфельтера, в Казахском районе Гянджа-Казахского региона - двое мужчин.
Таблица 1. Результаты гормональных и биохимических анализов больных с синдромом Клайнфельтера в Гянджа-Казахском и Муганском регионах
Параметры Норма Показатели
Контроль С.Клайнфельтера
ЛГ, т1и/мл 1,8-5,2 3,1±0,9 16,8±4,2
ФСГ, тШ/мл 2,9-8,2 4,6±1,2 22,7±6,1
Тестостерон, нг/дл 250-1100 512±187 225±112,5
Общий холестерин, мМ/л 33-5,2 3,8±1,1 6,&=2,6
Триглицериды, мМ/л 0,1-2,2 1,5±0,09 3,3±1,0
Глюкоза, мМ/л 3,05-6,38 4,9±1,3 6,1±2,4
Глюкоза через 2 ч. после еды, мМ/л 4,2-6,4 5,8±1,9 9,9*3,8
При дополнительных исследованиях путем цитогенетических и генеалогических методов в этих районах, а также в Таузском районе обнаружено еще четверо человек с данной хромосомной аналогией.
Согласно опросу родных все выявленные больные в возрасте от 24-29 лет с синдромом Клайнфельтера опережали сверстников в росте. В подростковом периоде у них наблюдалась двухсторонняя гинекомастия. Больные жаловались на боли в суставах, животе, спине, быструю утомляемость и пониженную работоспособность.
Анализ кариотипа в соскобах слизистой оболочки ротовой полости выявил присутствие тельца Барра, следовательно, дополнительной Х-хро-мосомы, считающейся основным этиологическим фактором в диагнозе данного синдрома.
Следует отметить, что трое больных с данным заболеванием не имели каких-либо психических отклонений, остальные шестеро обнаружены среди больных с умственной отсталостью, фациальными расщелинами и психическими расстройствами.
В качестве контрольной группы обследованы здоровые мужчины (10 человек) аналогичного возраста (табл.1).
Гормональные и биохимические анализы, результаты которых приведены в таблице 1, показали высокие уровни лютеинизирующего гормона (ЛГ), составляющего 16,8±4,2 mIU/мл, фолли-кулстимулирующего гормона (ФСГ) - 22,7±6,1 mIU/мл, повышение уровня общего холестерина - 6,8±2,6 мМ/л и триглицеридов - 3,3±1,0 мМ/л, а также нарушение толерантности к глюкозе, при которой уровень глюкозы повышался до 9,9±3,8 мМ/л при норме <7,8 мМ/л.
Биохимические показатели свидетельствуют о нарушении липидного и углеводного обмена, что привело к абдоминальному ожирению, в результате которого обследованные больные при
росте в среднем 188 см, имели средний вес 121 кг.
Надо отметить, что предыдущие исследования также подтверждают ассоциацию синдрома Клайнфельтера с риском возникновения диабета и метаболических синдромов, а также с психическими нарушениями, социальной адаптацией и неспособностью или низкой способностью к обучению [5;10].
Установлено, что 33,3% больных с синдромом Клайнфельтера не выявили каких-либо психосоциальных отклонений, тогда как у 66,7% синдром, ассоциировался с умственной отсталостью - в одном случае совместно с расщелиной неба, и психическими расстройствами, такими как задержка речи и неспособность к обучению.
При более детальном осмотре выявленных больных врачом установлена фенотипическая вариабельность клинического проявления симптомов. Так, среди девятерых больных у шестерых с обнаруженными психическими отклонениями лобные и височные доли оказались значительно меньше по объему, по сравнению с нормальными и больными с синдромом Клайнфельтера без дополнительных отклонений. Кроме того, длина тела, в среднем составившая 188 см, варьировала от 180 до 195 см, соответственно длина рук и ног также оказалась неоднозначна.
У троих больных без явных психических нарушений синдром Клайнфельтера до настоящих исследований не был распознан. Это согласуется с литературными данными, согласно которым около 25% случаев синдрома остаются не распознанными, ввиду проявления фенотипических признаков после полового созревания и широкого спектра клинической картины [6]. Данным больным было 25, 28 и 29 лет, они состояли на учете у врачей в связи с ожирением, повышенным сахаром (подозрение на сахарный диабет) и бесплодием. Учитывая последний факт, пациентам ранее сделаны анализы, которые показали
Рисунок 1. Результаты генетического секвенирования CAG-участка первого экзона гена андрогенового рецептора больных синдромом Клайнфельтера с расщелиной неба и умственной отсталостью (красной стрелкой указан старт, черной - конец CAG-повторов).
^80_90_100_110_120_130_140_150_160
:СТТССАССАССАСаССАССАССАССАСС/СС СС ССАСО СС сс .сс СС СС ССАСС СС ^СС ССлСС СС СС СС ССА
160 170 180 190 200 210 220 230 240
ЛСС. ССАССАССАССАССАССАССЛССЛСОСС ССАССАСС* СС ССАссттсстелссссссссссс -СССАСА ссссстсст<
Рисунок 2. Результаты генетического секвенирования CAG-участка первого экзона гена андрогенового рецептора больных синдромом Клайнфельтера с психосоциальными расстройствами (красной стрелкой указан старт, черной - конец CAG-повторов).
азооспермию, однако кариотипирование отсутствовало.
Для выяснения причины разномасштабной картины фенотипического проявления синдрома у всех девятерых пациентов проведен молекулярный анализ первого экзона гена андрогенового рецептора. Данный ген состоит их восьми экзо-нов, из которых первый - кодирует трансактивный домен, второй и третий - ДНК-связывающий домен, 5'-конец четвертого - зависимый домен, 3'-конец четвертого экзона совместно с У-УШ эк-зонами кодирует лиганд-связывающий домен. При этом именно первый экзон содержит полиморфные повторы CAG, кодирующие полиглюта-
миновые цепи андрогенового рецептора.
Установлена взаимосвязь между различием в числе повторов и экспрессией андрогенового CAG-рецептора (в среднем 20 повторов) [14]. В результате молекулярного анализа установлено, что все девять пациентов с синдромом Клайн-фельтера имели дополнительные повторы. Так, установлено, что в норме CAG участок повторялся в среднем 22 раза, у больных - их количество возрастало до 45 повторов. Больные с расщелиной неба и умственной отсталостью имели по 45 повторов (рис.1), с психосоциальными расстройствами - по 43 (рис.2), без каких-либо ассоциаций - 38-40 повторов CAG участков (рис.3).
1вО 90 100 110 120 130 140 150
:сттсс АССАССАССАС ш С СС С( II :дссАССАССАССАСсдсассА Ш11 ССАССЛССАССАССАССЛССАСОСС СС ССАССАССАССА шшашш
160 (.1 1,1 А 170 АССАССАССАС ММ 18( ;САССА( 11 190 ^ 200 ;САССАССАССАССССССАСССС ЙЁ*1 210 220 230 240 СССССССС ССАСССССССССССССССССССССССССССССС МШЁММ
Рисунок 3. Результаты генетического секвенирования CAG-участка первого экзона гена андрогенового рецептора больных с не ассоциированным синдромом Клайнфельтера (красной стрелкой указан старт, черной - конец CAG-повторов).
Полученные результаты объясняются тем, что рецепторы андрогена позволяют организму адекватно реагировать на андрогенные гормоны. Изменения действия гена андрогенового рецептора меняет направление развития мужских половых признаков. При любой мутации CAG-по-лиморфного сайта в первом экзоне гена, в том числе и при увеличении числа повторов, экспрессия изменяется, и рецептор может потерять свойство связывания с гормоном. При пониженной транскрипционной активности чувствительность клеток к андрогену снижается либо вовсе теряется. При этом известно, что длина CAG-аллели обратно пропорциональна фенотипическим признакам у мужчин [16; 17].
Так, у обследованных больных обнаружены фенотипические признаки синдрома, как, например, гинекомастия и небольшие яички, параметры которых обратно коррелировали с длиной CAG-повторов. Обнаружена прямая связь между ростом и CAG-повторами: у больных синдромом с ростом 193-195 см количество CAG-повторов достигало 45 (трое больных), 189-191 см - 43 (трое), 184-186 см - 40 (двое), 180 см - 38 (один человек).
Таким образом, чем короче CAG-аллель в гене андрогенового рецептора, тем выше его транскрипционная активность и тем меньше феноти-пическое проявление синдрома Клайнфельтера.
Кроме того, наблюдается четкая корреляция между количеством CAG-повторов и уровнем интеллекта. У больных с повторами в количестве 45 наблюдалась умственная отсталость (двое с
умственной отсталостью и один дополнительно с расщелиной неба). У троих больных с 43-мя CAG-повторами отмечены психосоциальные расстройства (проблема с вербальной коммуникацией, учебой, исполнением поставленных задач, задержка речи).
Учитывая то, что ген андрогенового рецептора находится на Х-хромосоме, которая в норме у мужчин находится в единственном экземпляре (46,ХY), а у женщин одна из них инактивирова-на, естественно, что отсутствие лайонизации ведет к дополнительной экспрессии генов данной хромосомы, связанных со структурными функциями мозга.
Кроме того, присутствие Pars-генов Y-хромо-сомы, имеющих аналогов в Х-хромосоме, и в результате удвоения Х-хромосомы у больных синдромом Клайнфельтера увеличивающих дозу экспрессии, также влияет на фенотипическую вариабельность проявления заболевания [8; 9]. Каждая дополнительная Х-хромосома связана с уменьшением ^ на 15-16 пунктов [15].
Таким образом, фенотип больного с синдромом Клайнфельтера зависит от числа лишних Х-хромосом (в наших исследованиях - 47, ХХY) и длины CAG-аллели (в наших исследованиях выявлено 38-45 CAG-повторов). Увеличение данных показателей прямо пропорционально психическому развитию, социальной адаптации, профессиональной деятельности и обратно пропорционально развитию мужских половых признаков.
Благодарности:
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Фонда Развития Науки при Президенте Азербайджанской Республики - Грант № EIF-Mob-2-2013-4(10)-13/06/3.
ЛИТЕРАТУРА
1. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Е.Г., Лифшиц Р.И. // Вопр. мед. химии.,1989, № 1, с.127-131.
2. Капустин А. В. Судебно-медицинская диагностика пола по половым различиям в клетках. М.: Медицина, 1969, 261 с.
3. Орел Н.М. Биохимия липидов: практикум для студентов би-ол. фак. спец. 1-31 01 01 "Биология", специализации 1-31 01 01 - 05 "Биохимия". Минск: БГУ, 2007, 35 с.
4. Aceatino L., Gavilan P. Phospholipids and Bile Acids as Diffusional carriers of Na across Nonpolar Media // Hepatology, 1988, v.4, No 3, p.893-898.
5. Bojesen A., Gravholt C.H. Klinefelter syndrome in clinical practice // Nat Clin Pract Urol., 2007, No 4, p.192-204.
6. Bojesen A., Juul S., Gravholt C.H. Prenatal and postnatal prevalence of Klinefelter syndrome: a national registry study // J Clin Endocrinol Metab., 2003, No 88, p.622-626.
7. Cirigliano V., Ejarque M., Fuster C., Adinolfi M. X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies // Mol Hum Reprod., 2002, No 11, p.1042-1045.
8. Geschwind D.H., Dykens E. Neurobehavioral and Psychosocial Issues in Klinefelter Syndrome // Learning Disabilities Research & Practice, 2004, v.19, No 3, p.166.
9. Iitsuka Y, Bock A., Nguyen D.D., et al. Evidence of skewed X-chromosome inactivation in 47, XXY and 48, XXYY Klinefelter patients // Am J Med Genet., 2001, No 98, p.25-31.
10. Lanfranco F., Kamischke A., Zitzmann M., Nieschlag E. Klinefelter?s syndrome // Lancet, 2004, No 364, p.273-283.
11. Mark H.F.L., Feldman D., Sigman M. Conventional and molecular cytogenetic identification of a variant Klinefelter syndrome patient with a deleted X chromosome // Pathobiology, 1999, No 67, p.55-58.
12. Measuring the QuantiFluor™ dsDNA System Using the QuantiFluor™-ST Fluorometer, Application Note, 2005, Promega Corporation.
13. NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer,V1.0 User Manual, 2009, Thermo Fisher Scientific Inc.
14. Quigley C.A., De Bellis A., Marschke K.B. et al. Androgen receptor defects: historical, clinical and molecular perspectives // Endocr. Rev., 1995, No 16, p.271-321.
15. Velissariou V, Christopoulou S., Karadimas C., et al. Rare XXY/XX mosaicism in a phenotypic male with Klinefelter syndrome: case report // Eur J of Med Genet., 2006, No 49, p.331-337.
16. Zinn A.R., Ramos P., Elder F.F., et al. Androgen receptor CAGn repeat length influences phenotype of 47, XXY (Klinefelter) syndrome // J Clin Endocrinol Metab., 2005, No 9, p.5041-5046.
17. Zitzmann M., Depenbusch M., Gromoll J., Nieschlag E. X-chro-mosome inactivation patterns and androgen receptor functionality influence phenotype and social characteristics as well as pharmaco-genetics of testosterone therapy in Klinefelter patients // J Clin Endocrinol Metab., 2004, No 89, p.6208-6217.
SUMMARY
The clinical-laboratory and molecular-genetic complex approach to the study of the phenotypic variability of Klinefelter's syndrome G.Akbarova
Baku State University, Baku
The results of a comprehensive analysis using DNA sequencing at patients with Klinefelter's syndrome is presented in the article. It was found the correlation between the genetic modification of the androgen receptor's gene and the diversity of the clinical manifestation of the syndrome.
Поступила 22.01.2015
