Коллекция представителей вида Vibrio parahaemolyticus: фенотипические и генотипические характеристики Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

МИКРОБИОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

О.А.Рыковская, Л.М.Смоликова, Е.В.Монахова, О.С.Чемисова, О.А.Подойницына, Е.Н.Голенищева, Е.М.Санамянц, М.М.Сагакянц, Р.Р.Даликова

КОЛЛЕКЦИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ВИДА VIBRIO PARAHEMOLYTICUS: ФЕНОТИ-ПИЧЕСКИЕ И ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Ростовский научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону

Цель. Формирование коллекции Vibrio parahaemolyticus вибрионов в соответствии с современными методическими возможностями и представлениями о биологии возбудителя. Материалы и методы. Для подтверждения видовой принадлежности были использованы традиционные биохимические тесты и ПЦР-тестирование видоспецифических генов. Каталазную, ДНКазную, протеолитическую и твиназную активность определяли общепринятыми методами. Вирулентность оценена комплексным методом: гемолитическую активность определяли в тесте Канагава (КР), уреазную — на среде Кристенсена, ПЦР-тестирование генов tdh и trh. Серотипирование осуществляли с помощью коммерческого набора О/К-сывороток. ПЦР-генотипирование проведено по маркерным генам семи островов патогенности (VPaI-1-7). Результаты. У изученных штаммов подтверждена их видовая принадлежность. Серологическое типирование позволило выявить среди коллекционных штаммов представителей 18 серологических групп. На основе перекомбинаций признаков КР- Ure — tdh-trh все коллекционные культуры были разделены на 4 группы. Выявлено множество генетических вариантов, определены штаммы, принадлежащие к пандемичной группе и относящиеся к серогруппе О3:К6. Заключение. Сформирована коллекция культур V.parahaemolyticus, охарактеризованная по большому набору фено- и генотипических признаков. Для удобства пользования созданной коллекцией разработана база данных, в которую включена информация о происхождении штаммов, фено- и генетических признаках и приведены генетические варианты.

Журн. микробиол., 2014, № 6, С. 3—9

Ключевые слова: Vibrio parahaemolyticus, серогруппа, ПЦР-генотипирование, острова патогенности, пандемичный клон, видоспецифичные гены

O.A.Rykovskaya, L.M.Smolikova, E.V.Monakhova, O.S.Chemisova, O.A.Podoinitsina, E.N.Golenischeva, E.M.Sanamyants, M.M.Sagakyants, R.R.Dalikova

COLLECTION OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS SPECIES MEMBERS: PHENOTYPIC AND GENOTYPIC CHARACTERISTICS

Rostov Research Institute of Plague Control, Rostov-on-Don, Russia

Aim. Formation of Vibrio parahaemolyticus collection according to modern methodical opportunities and understanding of causative agent biology. Materials and methods. Traditional biochemical tests and PCR-testing of species-specific genes were used to confirm species membership. Catalase, DNAse, proteolytic and tweenase activity was determined by common methods. Virulence was evaluated by a complex method: hemolytic activity was determined in Kanagawa test (KT), urease — in Christensen medium, PRC-testing of tdh and trh genes. Serotyping was carried out with a commercial O/K-sera kit. PCR-genotyping was carried out by marker genes of 7 pathogenicity islands (VPaI-1-7). Results. Species membership was confirmed for the studied strains. Serologic typing allowed to detect members of 18 serologic groups among the collection strains. All the collection cultures were divided into 4 groups based on KT-Ure-tdh-trh features recombination. A number of genetic variants were detected, strains belonging to a pandemic group and

O3:K6 serogroup were determined. Conclusion. formed and characterized by a large set of pheno-including information on strain origins, pheno-for ease of use of the collection.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 6, P. 3-9

A collection of V. parahaemolyticus cultures was and genotypic features. A database was developed and genetic features, with genetic variants given,

Key words: Vibrio parahaemolyticus, serogroup, PCR-genotyping, pathogenicity islands, pandemic clone, species-specific genes

ВВЕДЕНИЕ

Парагемолитические вибрионы — галофильные микроорганизмы, обитающие в устьях рек, морских прибрежных водах, донных отложениях и зачастую в ассоциации с зоо- и фитопланктоном. Употребление человеком в пищу морепродуктов, контами-нированных патогенными парагемолитическими вибрионами, ведет к возникновению острого кишечного заболевания, которое в последнее десятилетие выявлено во многих странах мира. Глобальное распространение заболевания связывают с появлением группы клоновых штаммов V parahaemolytius, названных в зарубежной литературе «пандемичными». Они принадлежат к определенным серогруппам [13], имеют в своем геноме, как правило, семь островов патогенности (VPaI-1 — VPaI-7), обусловливают более тяжелые случаи заболеваний, склонных к эпидемическому распространению [11]. В этой связи особую актуальность приобретают исследования, позволяющие проследить этапы формирования современных клонов возбудителя.

Для обеспечения этих и других направлений весьма полезна коллекция культур парагемолитических вибрионов, выделенных в разные годы, которая представляет собой собрание генетических ресурсов для фундаментальных и прикладных работ. Существование музейного фонда делает возможным ретроспективное изучение штаммов возбудителя, анализ эпидемической ситуации, сравнительную оценку микроорганизмов, циркулирующих в разные временные промежутки, и позволяет проследить их эволюционные изменения.

В РостПЧИ на протяжении нескольких десятилетий собраны оригинальные штаммы V. parahaemolytius, изолированные на территории России и ближнего зарубежья. Среди них хранятся культуры, впервые выделенные в 1973 г. из воды Черного моря и от больных в г. Новороссийск [2]. Эти штаммы положили начало коллекции V. parahaemolytius, которая в дальнейшем пополнялась культурами, изолированными от больных при спорадических случаях, крупных вспышках пищевых токсикоинфек-ций (ПТИ) в 1984 — 1986 годах на побережье Черного и Азовского морей, а также из морской воды и гидробионтов. В эти же годы V. parahaemolytius были выделены от людей в регионе Каспийского моря. Позже в коллекцию поступили штаммы, изолированные от больных в Приморском крае во время вспышек ПТИ в 1997 и 2012 годах, при спорадических случаях и из объектов окружающей среды. Накопленные к настоящему времени сведения о свойствах V. parahaemolyticus и появившиеся новые методические подходы требовали дополнения характеристики штаммов. Необходимо было ретроспективно оценить музейные и вновь выделенные V. parahaemolytius по фено- и генотипическим признакам, связанным с проявлением вирулентности. Поэтому целью настоящей работы явилось формирование коллекции V рarahaemolytius в соответствии с современными методическими возможностями и представлениями о биологии возбудителя.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Всего изучено по фено- и генотипическим признакам 290 штаммов. Для подтверждения их видовой принадлежности были использованы традиционные биохимические тесты [6] и ПЦР-тестирование видоспецифических генов VppC и VapC —

генов металлопротеазы (коллагеназы) V. parahaemolytius и V. alginolyticus. В качестве контрольных были привлечены типовые штаммы V. alginolyticus 16463 (АТСС 17749) и V parahaemolyticus 13580 (АТСС 17802). О принадлежности к той или иной серологической группе судили по результатам слайд-агглютинации, которую ставили с помощью набора О- и К-сывороток, выпускаемого фирмой «Toschiba Kazaki Co. Ltd» (Токио, Япония) для типирования V parahaemolytius.

Каталазную, ДНКазную, протеолитическую и твиназную активность определяли общепринятыми методами [1]. Вирулентность штаммов оценивали комплексным методом [3], включающим определение гемолитической, уреазной активности и ПЦР-детекцию основных факторов патогенности — генов термостабильного прямого гемолизина (TDH — thermostable direct hemolysin) и TDH-родственного (TDH-related hemolysin, TRH). Гемолитическую активность определяли в тесте Канагава (КР) на среде Вагатцума, а способность к гидролизу мочевины (Ure) — на среде Кристенсена. Кроме того, штаммы были протестированы на присутствие маркерных генов семи островов патогенности (VPal) и генов двух вариантов транспортной системы третьего типа (T3SS2) — T3SS2a, характерного для tdh+ штаммов и T3SS2P, присутствующего только у trh+ вибрионов [9, 12, 14]. С этой целью проведена ПЦР-идентификация следующих генов: гены T3SS2a, входящие наряду с tdh в состав VPaI-7; ген интегразы int1 и связанного с гемагглютинином белка hapVp— маркеры VPaI-1; ген белка наружной мембраны ompA — маркер VPaI-2; ген фагоподобной интегразы int3 — маркер VPaI-3; ген предполагаемой интегразы порообразующего цитотоксина pfc1 — маркер VPaI-4 ; ген предполагаемого фагоподобного белка php — маркер VPaI-5; ген предпо-лагамой ДНКазы exoV — маркер VPaI-6; а также гены уреазного кластера — ureC, ureR и T3SS2P — находящихся на малой хромосоме [9, 12]. Для определения указанных генов использовали праймеры, предложенные в [7, 9, 12] и сконструированные нами на основе последовательностей генов, размещенных в GenBank. Праймеры были синтезированы в НПФ «Литех» (Москва). В качестве ДНК-матриц использовали супернатанты 1 млрд взвесей суточных агаровых культур, прогретых при 99°C в течение 30 мин. Амплификацию проводили на программируемом термостате «Терцик» («ДНК-Технология», Москва).

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

При изучении культур по таксономическим признакам у подавляющего большинства штаммов подтверждена их видовая принадлежность. Исключение составили три штамма, выделенные от людей в 1985 г., один из них в г. Бердянске и два — в г. Красноводск, которые при повторной идентификации по совокупности биохимических признаков были отнесены к роду Shewanella. Отсутствие у этих культур роста при 4°C, способность расти при 37°С, лизировать эритроциты барана на кровяном агаре, продуцировать H2S и толерантность к 6% NaCl позволили классифицировать их как Shewanella algae. Отмеченное расхождение результатов первоначальной и повторной идентификации штаммов V parahaemolyticus, по-видимому, можно объяснить следующим образом. Бактерии рода Shewanella широко распространены в окружающей среде. Их изолируют из почвы, воды, преимущественно морской, гидробионтов. Известны случаи выделения от больных людей [10, 15]. Общность экологических ниш и культуральных свойств V parahaemolyticus и S. algae определяет возможность одновременного выделения их из исследуемого материала. Поэтому отмеченные три штамма, по-видимому, были смешанной культурой, представленной двумя видами микроорганизмов. V parahaemolytius, обладая, как и S. algae, индофенолоксидазой, способностью к росту при 6% NaCl и будучи биохимически более активными, маскировали в идентификационных тестах S. algae. И только способность к продукции H2S могло выдать их присутствие. Но культуры первоначально были расценены как атипичные штаммы Vрarahaemolyticus. Однако в процессе хранения вибрионы, вероятно, были вытеснены шеванеллами, чем и объясняются результаты повторной иден-

тификации. Этот факт является одним из редких, подтверждающим обнаружение S. algae в клиническом материале [4, 10].

Видовая принадлежность всех остальных музейных культур подтверждена с помощью видоспецифических праймеров VppC и VpaC. При этом выявлены некоторые расхождения результатов биохимического анализа и ПЦР-тестирования. Так, саха-розонегативный штамм, у вибрионов которого определен ген VаpC при отсутствии VpрC, был отнесен к виду V. alginolyticus. Следует отметить, что и среди V. alginolyticus обнаружен штамм, ферментирующий сахарозу, но содержащий в геноме VppC при отсутствии VаpC, т.е. по результатам ПЦР-тестирования отнесенный к V.parahaemo-lyticus. При сравнительной оценке ферментативной активности музейных штаммов отмечена более высокая протеазная активность у вибрионов, выделенных из окружающей среды по сравнению с клиническими. Все исследованные штаммы обладали ДНКазой и каталазой, гидролизовали твин 20 и были не активны по отношению к твину 80. По способности к гидролизу твинов 40 и 60 выявлены штаммовые различия, не связанные с другими характеристиками.

Серологическое типирование позволило определить среди коллекционных штаммов представителей 18 серологических групп — О1:К32, О1:К25, О1:К38, О2:К28, О3:К6, О3:К33, О3:К57, О4:К8, О4:К10, О4:К12, О4:К32, О4:К34, О4:К35, О5:К15, О5:К17, О6:К18, О6:К46, О10:К52. Установлено, что вибрионы, послужившие причиной спорадических случаев, были представлены большим набором серогрупп, а возбудитель эпидемических вспышек до 1996 г. отнесен к группам О5:К15, О4:К12,

Тест-штаммы V. parahaemolyticus, депонированные в ГКПБ института «Микроб» (Саратов)

№ штамма, присв. деп.

Назначение штамма

Характеристика*

Серогруппа

Источник, место и год выделения

293 (17094) КМ-186

Р-17036

КМ-187

16 (17101) КМ-204

58 (17714) КМ-208

Р-16199

КМ-215

293 (17094) КМ-228

Контрольный для оценки уреазной активности парагемоли-тических вибрионов

Контрольный для оценки гемолитической активности V. paгahaemolyticus в тесте Канагава Контрольный для ПЦР-тестирования парагемолитических вибрионов на присутствие генов вирулентности — tdh и йЛ Контрольный для ПЦР-гено-типирования парагемолитических вибрионов Контрольный (негативный) для комплексной оценки вирулентности V. paгahaemolyticus Штамм-продуцент Tгh

Обладает высокой и стабиль- О1:К25 но проявляемой уреазной активностью. Содержит йЛ, uгeC, uгeR, T3SS2p гены при отсутствии tdh и Т3SS2a Обладает высокой гемо- О5:К15

литической активностью на среде Вагатцума. Содержит tdh и Т3SS2a при отсутствии tгh и T3SS2p Содержит гены гемолизинов О6:К18 TDH, TRH и T3SS2P при отсутствии Т3SS2a

Содержит маркерные гены О3:К6 семи островов патогенности, а также гены oгf8, pmp, cefVp и toxR

Не обладает гемолити- О1:К32

ческой и уреазной активностью, не содержит гены tdh, tгh, Т3SS2a и T3SS2p

Обладает высокой уреазной О1:К2 и гемолитической активностью, обусловленной гемолизином TRH. Содержит Гены tгh, UгeC, UгeR, T3SS2p при отсутствии tdh и Т3 SS2a

От больного в 1985 г. в Туркмении

От больного в 1985 г. в Бердянске

От вибриононос. в 1985 г. в Туркмении

От больного гастроэнтер. в 1997 г.

во Владивостоке

Из воды Черного моря в 1972 г.

От больного в 1985 г. в Туркмении

Примечание. * Все штаммы содержат гены tlh, toxRS, gyrB, Vpfla, VppC.

№ штамма

О4:К8. Штаммы, обусловившие в г. Владивосток вспышки в 1997 и 2012 годах, а также спорадические случаи в 2008, 2012 годах в Приморском крае, идентифицированы как представители серогруппы О3:К6.

Для достоверной оценки опасности выделяемых культур нами был разработан комплексный метод, основанный на фено- и генотипической характеристике вибрионов по признакам, связанным с проявлением вирулентности [3]. С целью стандартизации этого метода из числа коллекционных культур V. рагаИаешо^юш подобраны и предложены в качестве контрольных тест-штаммы для определения уреазной, гемолитической активности и ПЦР-детекции структурных генов гемолизинов и 1гИ. Указанные штаммы депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» и представлены в табл.

По результатам изучения комплексным методом все коллекционные культуры были разделены на 4 группы: 1) КР+игеПёИ+Л-; 2) КР-иге+1ёИ- ; 3) КР -(+) иге+1ёИ+1гИ+; 4) КР^ге- 1гИ-. Вибрионы первых трех групп отнесены к вирулентным, а четвертой — к авирулентным. От людей выделены представители всех 4 групп, а из объектов окружающей среды — только последней. Подавляющее большинство штаммов первой группы были КР-позитивными. Исключение составляли 4 клинических штамма, у которых ген не экспрессировался либо экспресси-ровался слабо и непостоянно.

Результаты ПЦР-тестирования КР+игеЧёИ+^И" штаммов показали, что V. рагаИаешо^юш этой группы содержали гены "УРа1-7 (tdh,T3SS2) при отсутствии 1гЪ и T3SS2p , а также маркерный ген наиболее древнего "УРа1-2, но существенно различались по наборам маркерных генов других пяти островов патогенности. Отмечено, что только штаммы серогруппы 03:К6, вызвавшие вспышки ПТИ во Владивостоке в 1997, 2012 годах и спорадические случаи в Приморском крае, содержали гены всех семи "УРа1 и поэтому могли быть отнесены к пандемичной группе, типичный представитель которой V parahaemolyticus КМ-208 депонирован в ГКПБ « Микроб». Время возникновения вспышек 1997 и 2012 годов совпало со сроками появления и распространения пандемичного клона во всем мире. Клинические штаммы, выделенные до 1996 г., по серологической и генетической характеристикам не могли быть расценены как пандемичные. Ни один из них не имел всех семи "УРа1. Однако острова патогенности присутствовали в разных сочетаниях, образуя множество генотипов. У штаммов отмечена делеция одного из маркерных генов (тй и hapVp ) "УРа1-1.

Заслуживает внимания третья (KP-Ure+tdh-trh+) и четвертая (КР-(+Юге +tdh+ группы, представленные 14 уреазопозитивными штаммами, которые выделены от носителей и больных при спорадических случаях заболевания в регионах Черного и Каспийского морей в 1970 — 1980 гг. и в 2010 г. на побережье Японского моря. При ПЦР-тестировании установлено, что вибрионы, ферментирующие мочевину, наряду с иге-кластером содержали структурный ген ^ и кластер T3SS2p. Кроме того, у пяти штаммов помимо ^ выявлен и ген tdh, однако эти вибрионы были лишены кластера генов T3SS2a, т.е. их геномная организация свидетельствует о том, что "УРа1-7 подвержен процессам делеции и может содержаться в неполном составе. Уреазопозитивные штаммы, за исключением 5, у которых обнаружены одновременно гены tdh и Л, были Канагава-негативны. У штаммов, составивших исключение, на среде Вагатцума выявлен гемолиз только в отдельных случаях, к тому же слабовыраженный. Среди иге+ штамммов обнаружены представители серологического варианта О6:К18, вибрионы которого в настоящее время относят к пандемичным штаммам [11]. Однако у V. pаrаhаemolyticus О6:К18, выделенных в 80-е годы, в отличие от современных пандемичных, отсутствовал набор островов патогенности [7]. В то же время, у уреа-зопозитивного штамма, выделенного в 2010 году, кроме консервативного "УРа1-2 дополнительно выявлены маркерные гены "УРа1-1 и "УРа1-6, что, по-видимому, свидетельствует о том, что эволюция патогенных уреазопозитивных вибрионов также идет

по пути приобретения островов патогенности. Среди уреазопозитивных коллекционных парагемолитических вибрионов проведен поиск штамма-продуцента гемолизина TRH. При оценке способности trh+ вибрионов продуцировать гемолизин мы руководствовались их избирательной литической активностью по отношению к эритроцитам кур [17]. Продукция TRH отмечена только у уреазопозитивных штаммов, но не все Ure+ вибрионы секретировали TRH in vitro, что подтверждает положение о независимой экспрессии генов trh и уреазного кластера [16]. Показано, что в группе tdh- trh+ Ure+ V. parahaemolyticus только у 4 из 10 отмечена экспрессия гена trh in vitro, а tdh+ trh+ Ure+ вибрионы экспрессировали его слабо. Проведенные исследования позволили рекомендовать и депонировать в качестве продуцента TRH штамм V. parahaemolyticus КМ- 228. В четвертую группу коллекционных культур вошли клинические штаммы и выделенные из водоемов и гидробионтов. У всех штаммов присутствовал консервативный остров патогенности VPaI-2. Вибрионы, изолированные из водоемов, не содержали генов tdh, trh и T3SS2. Вместе с тем, у некоторых из них выявлены в различных сочетаниях маркерные гены VPaI-3, 4, 5.

ОБСУЖДЕНИЕ

Сформированная коллекция представлена разными группами штаммов, иллюстрирующими природное разнообразие фено- и генотипов V parahaemolyticus. Более широкий круг фенотипических вариантов выявлен среди вибрионов, циркулирующих в окружающей среде, по сравнению с клиническими штаммами. Подобное наблюдение, сделанное и другими авторами, свидетельствует об адаптационных возможностях па-рагемолитических вибрионов. Все представители коллекции систематизированы по признакам, связанным с проявлением патогенности. При этом определены штаммы, принадлежащие к пандемичной группе, содержащие семь осторовов патогенности, и предпандемичные штаммы. Установлены типичные и атипичные варианты. Из атипичных интересны tdh+ КР- штаммы, обнаруженные в 4% случаев. По литературным источникам [9] до 16% tdh+ изолятов могут быть Канагава-негативными. Этот факт объясняли наличием у вибрионов всего одной копии гена tdh (tdh1), обладающей слабым промотором, и поэтому слабо выраженной гемолитической активностью. Однако Шалу

0. А. и др. [5], не подтвердив этого предположения, показали, что утрата КР+ фенотипа связана с двумя нуклеотидными заменами в промоторной области гена tdh.

К коллекционным tdh+ КР- (+) штаммам отнесены уреазопозитивные варианты, содержащие одновременно tdh и trh. Установлено, что КР- феномен у этих штаммов сопровождается делецией генов T3SS2a, tdh2 и двумя нуклеотидными заменами в оставшейся копии tdh1. В этой связи, следует отметить, что неоднородность генетической организации коллекционных штаммов проявилась не только в наборе островов патогенности, но и в составе самих VPaI. Так, у отдельных изолятов отмечена делеция генов VPaI-1 и VPaI-7. Упомянутые штаммы с уникальной генетической характеристикой представляют интерес для специальных исследований. Особое место в коллекции занимают tdh- trh- клинические изоляты. Способность вызывать заболевания, вероятно, связана у них с другими факторами. Эта группа штаммов весьма полезна при поиске дополнительных факторов и выяснении их вклада в патогенность V. parahaemolytius. Для удобства пользования созданной коллекцией разработана база данных, в которую включена информация о происхождении штаммов, фено- и генетических признаках и приведены генетические варианты.

Л ИТЕРАТУРА

1. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984.

2. Либинзон А.Е., Ус З.И., Нагорная А.Ф. и др. Этиологическая структура пищевых ток-сикоинфекций, вызванных морскими галофильными вибрионами. Журн. микробиол. 1994, 6: 20-21.

3. Рыковская О.А., Шалу О. А., Монахова Е. В. и др. Комплексный метод оценки вирулентности парагемолитических вибрионов. Клин. лаб. диагностика. 2013, 2: 38-41.

4. Сиволодский Е.П., Котив Б.Н., Колобова Е.Н. и др. Выделение Shewanella algae из плеврального экссудата больного пневмонией. Журн.микробиол. 2012, 5: 74-76.

5. Шалу О.А., Писанов Р.В., Монахова Е.В. Эффективность экспрессии гена trh Vibrio parahaemolyticus зависит от двух точковых мутаций в его промоторной области. Генетика. 2012, 48 (12): 1364-1371.

6. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. New York, Springer, 2005.

7. Boyd E.F., Cohen A.L., Naughton L.M. et al. Molecular analysis of the emergence of pandemic Vibrio parahaemolyticus. BMC Genomics. 2008, 8: 110-123.

8. Di Pinto A., Ciccarese G., Tantillo G. A collagenase-targeted bultiplex PCR assay for identification ofVibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, and Vibrio parahaemolyticus. J. Food Protection. 2005, 68 (1):150-153.

9. Hayashi S., Okura M., Osawa R. Soft-agar-coated filter method for earley detection of viable and thermostable direct hemolysin (TDH) — or TDH-related haemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72 (7): 4576-4582.

10. Iwata M., Tateda K., Matsumoto T. et al. Primari Shewanella algae septicemia in a patient on hemodialysis. J.Clin.Microbiol. 1999, 37: 2104.

11. Nair G. B., Ramamurthy T., Bhattacharya S. K. et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serovariants. Clin. Microbiol. 2007, 20 (1): 39-48.

12. Okada N., Iida T., Park K.-S. et al. Identification and characterization of a novel type III secretion system in trh-positive Vibrio parahaemolyticus strain TH3996 reveal genetic lineage and diversity of pathogenic machinery beyond the species level. Infect. Immun. 2009, 77 (2): 904-913.

13. Okuda J., Ishibashi M., Hayakawa E. et al. Emergence of unique O3:K6 clone of Vibrio para-haemolyticus in Calcutta, India, and isolation of strains from the same clonal group from Southeast Asian travelers arriving in Japan. J. Clin. Microbiol. 997, 35: 3150-3155.

14. Park K.S., Ono T., Rokuda M. et al. Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio parahaemolyticus. Infect. Immun. 2004, 72 (11): 6659-6665.

15. Tan C.K., Lai C.C., Ruar WK et al. Purulent perikarditis with greenish pericardial effusion caused by Shewanella algae. J.Clin.VMicrobiol. 2008,45: 2817-2819.

16. Venkateswaran K., Dohmoto N., Harayama S. Cloning and nucleotide sequence of the gyrB gene of Vibrio parahaemolyticus and its application in detection of this pathogen in shrimp. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64 (2): 681-687.

17. Ward L.N., Bej A.K. Detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of multiplexed real-time PCR with TaqMan fluorescent probes. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72 (3): 20312042.

Поступила 27.02.14

Контактная информация: Рыковская Оксана Алексеевна,

344002, Ростов-на-Дону, ул.М. Горького, 117/40, р.т. (863)240-27-03

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

М.В.Кузнецова1,2, А.В.Максимова1, Т.И.Карпунина2, В.А.Демаков1

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ЭФФЕКТОРОВ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ У НОЗОКОМИ-АЛЬНЫХ ШТАММОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

1Институт экологии и генетики микроорганизмов, Государственная медицинская академия, Пермь

Цель. Анализ встречаемости эффекторов секреторной системы третьего типа (TTSS) у клинических штаммов P. aeruginosa. Материалы и методы. Изучены внутрибольничные (n=164) и внебольничные (n=30) штаммы P. aeruginosa. Детекцию генов exoS и exoU осуществляли методом ПЦР на термоциклере DNA Engine Dyad Thermal Cycler («Bio-Rad», США). Продуценты металло-бета-лактамаз (МБЛ) выявляли по присутствию Ькуш^-гена. Результаты. Скрининг внутри- и внебольничных штаммов на наличие генов, кодирующих ExoS и ExoU, показал, что в геноме клинических изолятов exoS детектируются в 59,8%, а exoU — в 31,1% случаев. При этом штаммы с генотипом exoS-/exoU+ преобладали в ОРИТ