CC BY-ND
22
42 ЗНиСО ЦЕШ, №12 (213)
«ПАНДЕМИЧНЫЕ» ШТАММЫ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS -ЭТИОЛОГИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ ГАСТРОЭНТЕРИТОВ НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
О.А. Шалу1, А.В. Алленов2, Г.П. Мурначев2, Т.В.Хоменко2, Е.Н.Голенищева1
«PANDEMIC» VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS STRAINS, THE ETIOLOGICAL AGENTS OF GASTROENTERITIS IN THE FAR EAST OF RUSSIAN FEDERATION
O.A. Shalu, A.V. Allenov, G.P. Murnachev, T.V. Khomenko, E.N. Golenischeva
'ФГУЗ научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, 2ФГУЗ Приморская противочумная станция, Приморский край
Проведено серотипирование и ПЦР-генотипирование клинических штаммов Vibrio parahaemolyticus, вызвавших вспышку (1997) и спорадические случаи гастроэнтеритов (2008), связанных с употреблением в пищу морепродуктов, в Приморском крае РФ. Все штаммы продуцировали термостабильный прямой гемолизин, относились серогруппе О3:К6 и содержали маркерные гены семи островов патогенности (VPal), что указывает на их принадлежность к «панде-мичным» клонам, получившим глобальное распространение с 1996 г. Ключевые слова: клинические штаммы, серогруппы, термостабильный прямой гемолизин, глобальное распространение, гастроэнтериты.
Serotyping and PCR-genotyping of clinical Vibrio parahaemolyticus strains, the causative agents of the seafood-borne gastroenteritis outbreak (1997) and sporadic cases (2008) in Primorsk Territory of RF was conducted. All strains produced thermostable direct hemolysin, belonged to O3:K6 serogroup and shared marker genes of seven pathogenicity islands indicating their affiliation to the "pandemic" group which obtained global dissemination after 1996.
Кеуиотйв: clinical strains, serogroups, thermostable direct hemolysin, global dissemination, gastroenteritis.
Введение. Vibrio parahaemolyticus, грамне-гативные галофильные бактерии, обитатели эстуарных и прибрежных морских вод, явля-
ются возбудителями гастроэнтеритов, связанных, как правило, с употреблением в пищу морепродуктов. В последние десятилетия рас-
ЦШМ №12 (213) ЗНиСО
43
пространение вызываемых ими заболеваний в мире приняло глобальный характер вследствие появления в 1996 г. т. н. «пандемичной» группы штаммов, к которой были отнесены представители серогрупп О3:К6, О4:К68, О1:К25, 01:KUT и О6:К18 [6]. Характерной особенностью таких штаммов является присутствие в геноме семи островов патогенности, из которых 5 локализованы на большой хромосоме и 2 — на малой. Наиболее изучен VPaI-7, включающий два гена ключевого фактора патоген-ности термостабильного прямого гемолизина TDH (tdhl и tdh2) и кластер генов одной из двух контакт-зависимых систем секреции третьего типа (TTSS2), ответственной за энте-ротоксичность [9]. Остальные VPaI содержат гены предполагаемых факторов патогенности, роль которых в патогенезе не изучена. Тем не менее, штаммы, не содержащие всех VPaI, не обладают таким патогенетическим потенциалом, как «пандемичные». Считают, что последние произошли от «непандемичных» штаммов О3:К6 путем постепенного приобретения VPaI (кроме консервативного VPaI-2, гены которого присутствуют у подавляющего большинства V. parahaemolyticus) [4].
В 1997 г. во Владивостоке имела место крупная вспышка гастроэнтерита, вызванного V. parahaemolyticus О3:К6 [1, 2], в последующие годы периодически регистрировались спорадические случаи заражения людей [3]. Географическое положение города и время возникновения заболеваний наводят на мысль о том, что они могли быть вызваны «пандемичными» клонами, распространившимися и на территорию Российской Федерации. В таком случае мониторинг за данными возбудителями и оценка их потенциальной опасности приобретают особую актуальность. Однако это предположение нуждалось в экспериментальной проверке.
Цель настоящего исследования состояла в серотипировании и ПЦР-генотипировании клинических штаммов Vibrio parahaemolyticus, вызвавших вспышки и спорадические случаи заболеваний в Приморском крае РФ.
Материалы и методы. Объектами исследования служили 30 штаммов V. parahaemolyticus, выделенных от больных во Владивостоке во время вспышки гастроэнтерита 1997 г. и 4 штамма, вызвавших спорадические случаи заболеваний в Приморском крае в 2008 г. Штаммы были выделены и идентифицированы во Владивостокском отделении Приморской ПЧС и переданы для дальнейших
исследований в Музей живых культур Рост-НИПЧИ, где хранились в лиофилизирован-ном состоянии.
Культуры выращивали на агаре Мартена либо LB, содержащем 2 % хлористого натрия. Способность к продукции TDH (феномен Ка-нагава, KP) определяли на среде Вагатсума с 2 % отмытых эритроцитов крови человека по величине и полноте зоны гемолиза через 24—48 часов. Серотипирование осуществляли с помощью коммерческого набора сывороток фирмы Toshiba Kazaki Co Ltd. согласно рекомендациям изготовителя.
ПЦР-генотипрование проводили по набору следующих генов:
• гены tdh и T3SS2a — pvcsN2a, pvcsC2a, espDa, pvcsV2a, входящие в состав VPaI-7;
• ген orf8 филаментозного профага f237, кодирующий предполагаемый фактор адгезии [6];
• ген интегразы intl и связанного с гемаг-глютинином белка hapVp — маркеры VPaI-1.
• ген белка наружной мембраны ompA — маркер VPaI-2;
• ген фагоподобной интегразы int3 — маркер VPaI-3;
• ген предполагаемой интегразы пороо-бразующего цитотоксина pfcI, потенциального фактора вирулентности — маркер VPaI-4;
• ген предполагаемого фагоподобного белка php — маркер VPaI-5;
• ген предполагаемой ДНКазы (экзону-клеазы) exoV, возможного фактора вирулентности — маркер VPaI-6.
• гены trh, уреазного кластера (ureR, ureC) и T3SS2ß нового типа (pvcsN2 ß, pvcsC2ß, espD ß), недавно обнаруженные только у trh+ штаммов [7]; все локализованы на малой хромосоме.
• ген pmp предполагаемой металлопро-теиназы, сходной с гемагглютинин/протеа-зой V. cholerae, и cefVp предполагаемой липазы, сходной с цитотоническим токсином Cef V. cholerae. У холерных вибрионов эти белки являются факторами патогенности/перси-стенции. У обоих видов их гены локализованы на малой хромосоме.
• ген toxR — регулятор транскрипции белков наружной мембраны, локализован на большой хромосоме.
Для детекции большинства перечисленных генов использовали специфические праймеры, сконструированные нами, для гена tdh — предложенные [5], для генов T3SS2ß — приведенные в статье [7]. Синтез праймеров выполнен ООО НПФ «Литех» (г. Москва). В
44
ЗНиСО рт №12 (213)
качестве ДНК-матриц использовали суперна-танты 1 млрд взвесей суточных агаровых культур, прогретых при 99 ° в течение 10 мин. Амплификацию проводили на программируемом термостате «Терцик» («ДНК-Технология», Москва).
Результаты и обсуждение. При серотипиро-вании исследуемых штаммов парагемолити-ческих вибрионов было установлено, что все они включая выделенные в 2008 г. относятся к серогруппе О3:К6. Все штаммы были КР-позитивными, однако у выделенных в 2008 г. феномен был выражен менее отчетливо, чем у штаммов 1997 г.: зоны гемолиза были меньше в диаметре и слегка «мутными». Возможно, это связано с присутствием у этих штаммов только одной копии гена который у большинства КР+ V. рагакаето1уИст дуплицирован. Гены 1ёЫ и 1ёИ2 имеют 97 % идентичности, поэтому не поддаются дифференциации в ПЦР. Известно, что более 90 % гемолитической активности обеспечивает продукт 1ёИ2, тогда как на долю продукта 1ёЫ приходится от 0,5 до 9,4 %, что отчасти обусловлено более слабым промотором этого гена по сравнению с таковым 1ёИ2. Поэтому штаммы, содержащие только 1ёЫ, экспрессируют его слабо и непостоянно. Однако активность промотора зависит от замены всего одной пары нуклеотидов [8]. Следовательно, такие штаммы следует считать потенциально опасными, так как точечная мутация в промоторе может привести к возникновению более вирулентных клонов.
Результаты ПЦР-генотипирования представлены в таблице, из которой видно, что практически все штаммы (за исключением одного 1997 г.), содержали гены и Т3882а, входящие в состав УРа1-7, но не содержали генов 1гЬ, сцепленного с ним иге-кластера, от-
ветственного за продукцию уреазы, и генов Т3882Р, которые имеют отличия в нуклеотид-ных последовательностях от генов Т3882а, локализованы в непосредственной близости от 1гИ и характерны только для 1гЬ+ штаммов [7].
Все 1ёИ+Т3882а+ штаммы 1997 г. и 3 штамма 2008 г. имели и маркерные гены остальных шести УРа1. При этом большая их часть также содержала ген огГ8, который вначале считали маркером серогруппы О3:К6, однако впоследствии он был выявлен и у представителей других серогрупп [6]. Тем не менее, его присутствие может служить еще одним косвенным подтверждением принадлежности возбудителей заболеваний на Дальнем Востоке к «пан-демичной» группе.
Что касается одного штамма 2008 г., у которого отсутствовали маркерные гены УРа1-4, 5 и 6, то отмеченная зарубежными авторами чрезвычайная пластичность генома У.рагаИаето^юш затрагивает и острова па-тогенности, которые могут содержать делеции [4]. Возможно, утрата части генов произошла в процессе пребывания возбудителя в организме хозяина. С другой стороны, нельзя полностью исключить, что данный больной был исходно инфицирован другим клоном, отличным от трех остальных штаммов, тем более что в 2008 г. заболеваемость была спорадической. Это же можно сказать о единственном клиническом штамме 1997 г., не содержавшем большинства УРа1, хотя он и был выделен во время крупной вспышки.
Из детерминант других потенциальных факторов патогенности, не входящих в состав какого-либо УРа1, мы определяли наличие генов 1охЯ, ртр и сеГУр и выявили их у всех без исключения штаммов. Причастность каждого из них к патогенезу пока не установлена и яв-
Таблица 1. Результаты ПЦР-скрининга штаммов V. рагакавто1уйсш
N. Гены Годы N. выделения4». Число штаммов ТЗББа ^И/иге СЛ СЛ 3 Н 1 шИ ИарУр ! о 3 р^с рИр ехоУ Рй х о ртр сеГУр
1997/2008 26/3 + + - - + + + + + + + + + + +
1997 3 + + - - - + + + + + + + + + +
2008 1 + + - - + + + + + - - - + + +
1997 1 + + - - - + + +
ЦШМ №12 (213) ЗНиСО
45
ляется предметом наших дальнейших исследований.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что на Дальнем Востоке начиная с 1997 г. гастроэнтериты были вызваны «пандемичными» штаммами V. parahae-molyticus. Во время вспышки 1997 г. отмечалось преобладание тяжелых и среднетяжелых форм заболеваний, источником инфекции послужили креветки и другие морепродукты [1]. Это вполне согласуется с заболеваемостью в мире. С 1996 г. в Индии в этиологии гастроэнтеритов, вызванных парагемолитическими вибрионами, на долю таких штаммов приходилось от 50 до 80 % [4]. Впоследствии «пан-демичные» клоны распространились не только в юго-восточной Азии, но и по всему миру, крупные вспышки были зарегистрированы в Северной и южной Америке, Африке, Европе [6]. Происхождение возбудителей гастроэнтеритов во Владивостоке остается неясным. Либо они были изначально занесены из пограничных государств, либо образовались непосредственно в дальневосточных прибрежных водах. Однако в любом случае, как было показано ранее, в Приморском крае сформировался эндемичный очаг заболеваний, вызываемых галофильными вибрионами [3]. Результаты настоящего исследования позволяют полагать, что на сегодняшний день ведущее место в нем принадлежит «пандемичным» клонам V. parahaemolyticus.
В заключении следует обратить внимание санэпидслужб и учреждений здравоохранения на то, что в связи с развитым импортом морепродуктов, в т. ч. с Дальнего Востока РФ, существует реальная угроза распространения «пандемичных» штаммов в различные регионы России и стран СНГ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Маслов Д.В. Вспышка галофилеза среди населения г.Владивостока Приморского края //Здоровье населения и среда обитания. 1997. № 12 (57).
С. 17—18.
2. Смоликова Л.М., Ломов Ю.М., Хоменко Т.В. и др. Галофильные вибрионы, обусловившие вспышку пищевой токсикоинфекции в r. Владивостоке. //Журн. микробиол. 1998. № 6. С. 3—7.
3. Хоменко Т.В., Мурначев Г.П. Галофилез во Владивостоке. Противочумные учреждения в России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны. Мат. конф., посв. 70-летию противочумного центра, 16—17 ноября 2004 г., Москва. С. 123—124.
4. Boyd E. F., Cohen A. L., Naughton L. M. et al. Molecular analysis of the emergence of pandemic Vibrio parahaemolyticus //BMC Genomics. 2008. Vol. 8, N 110. P. 1—14.
5. Hayashi S., Okura M., Osawa R. Soft-agar-coated filter method for earley detection of viable and Thermostable Direct Hemolysin (TDH) — or TDH-related haemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in seafood //Appl.Environ.Microbiol. 2006. Vol. 72, N 7. P. 4576—4582.
6. Nair G. B., Ramamurthy T., Bhattacharya S. K. et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serovariants //Clin. Microbiology Reviews. 2007. Vol.20, N1. P. 39—48.
7. Okada N, Iida T, Park KS et al. Identification and characterization of a novel type III secretion system in trh-positive Vibrio parahaemolyticus strain TH3996 reveal genetic lineage and diversity of pathogenic machinery beyond the species level //Infect Immun. 2009. Vol. 77, N 2. Р. 904—913.
8. Ono T, Park K. S., Ueta M. et al. Identification of proteins secreted via Vibrio parahaemolyticus type III secretion system 1 //Infect. Immun. 2006. Vol. 74. P. 1032—1042.
9. Park K.-S., Iida T, Yamaichi Y et al. Genetic characterization of DNA region containing the trh and ure genes of Vibrio parahaemolyticus. //Infect. Immun. 2000. Vol. 68, N 10. P.5742—5748.
Контактная информация. Шалу Ольга Андреевна, тел.: 8928-150-83-53, 240-91-33, e-mail: [email protected].
Contact information.
Shalu Olga Andreevna, phone: 8928-150-83-53, 240-91-33, e-mail: [email protected].
